阅读说明：本技术 一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒及其应用 (Drug sensitivity detection kit for bacterial diseases of freshwater fishes and application thereof ) 是由 陈福艳 欧阳贤华 黎建斌 梁万文 陈福彩 李大列 黄彩林 雷爱莹 罗洪林 李旻 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒及其应用,属于水产疾病防治技术领域。一种淡水鱼类细菌病快速检测药敏试剂盒,包括TSA培养基、增菌液和渔类抗菌药纸片。基于所述试剂盒检测淡水鱼类细菌病药敏的方法包括：病样组织液的提取、细菌扩增、细菌接种培养和结果判断。本发明提供的试剂盒能快速筛选出对病原菌敏感的渔用药物,及时指导养殖户高效用药,提高用药治疗效果；检测方法简单方便；对实验技能要求不高,临床应用性强,同时还可实现耐药菌株的分离。(The invention provides a drug sensitivity detection kit for bacterial diseases of freshwater fishes and application thereof, belonging to the technical field of prevention and treatment of aquatic diseases. A quick detection drug sensitive kit for fresh water fish bacterial diseases comprises a TSA culture medium, a bacteria increasing liquid and a fishery antibacterial drug paper sheet. The method for detecting the bacterial disease drug sensitivity of the freshwater fishes based on the kit comprises the following steps: extracting a disease sample tissue fluid, amplifying bacteria, inoculating and culturing the bacteria and judging results. The kit provided by the invention can quickly screen out the fishing drugs sensitive to pathogenic bacteria, timely guide farmers to take high-efficiency drugs, and improve the drug treatment effect; the detection method is simple and convenient; the method has low requirement on experimental skills, strong clinical applicability and can realize the separation of drug-resistant strains.)

一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于水产疾病防治技术领域，具体涉及一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒及其应用。

背景技术

我国是世界水产养殖大国，也是水产品贸易大国，水产品产量占世界的70％，出口额连续6年居世界首位。但近年来，由于水产养殖业的快速发展，细菌性疾病时有发生，处理不当，可造成较大的经济损失。目前，细菌病治疗最有效的是抗生素，但是近年来药物治疗效果不显著并出现反复发作的现象，原因可能与引起细菌病不同种类细菌有关，另外可能由于抗生素的频繁和不规范使用，引起抗生素耐药性、抗药性和药物残留等问题，特别是药物残留问题会直接影响我国水产品出口贸易。因此，很有必要在使用药物治疗前，进行药敏试验，快速筛选出高效的治疗药物。然而，目前市场上只有针对人源细菌或哺乳动物源细菌相关的药敏试剂盒，而没有专门针对水产动物源细菌使用的产品；也有一些学者针对水产动物源细菌药敏试剂盒开展研究，但仍存在使用繁杂，环境条件要求高，用时长，抗生素品种与渔药产品脱节等问题，且只停留在研究阶段，尚未达到推广和应用；另外渔药市场上的抗生素产品种类繁多、含量与成分不明，还可能存在鱼目混珠的情况。因此急需一种科学、快速和贴合实际的用药指导，指导养殖户及时、准确和高效地使用抗生素类药物治疗，减少抗生素的使用，减少养殖户经济损失。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒及其应用，所述试剂盒能快速、准确、实用方便的检测鱼病样的的渔药敏感性，及时指导养殖户科学用药。

本发明提供了一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒，包括以下组成：

TSA培养基、渔类抗菌药的药敏纸片和增菌液。

优选的，所述渔类抗菌药的药敏纸片包括氟苯尼考的药敏纸片、磺胺异恶唑的药敏纸片、阿莫西林的药敏纸片、恩诺沙星的药敏纸片、盐酸新霉素的药敏纸片、链霉素的药敏纸片、诺氟沙星的药敏纸片和强力霉素的药敏纸片中的一种或几种。

优选的，所述增菌液以TSB培养基为基础培养基，还包括体积浓度9％～11％的鱼血清和0.02％～0.04％的阿尔玛蓝溶液指示剂。

优选的，还包括滴管、封口胶和用于盛装TSA培养基的培养皿。

优选的，所述培养皿的直径为90mm。

本发明提供了所述检测试剂盒在筛选治疗淡水鱼类细菌病的抗生素或筛选耐抗生素的菌株中的应用。

本发明提供了一种基于所述检测试剂盒快速检测淡水鱼类细菌病药敏的方法，包括以下步骤：

1)取患细菌病淡水鱼的肝脏，剪碎，得到的肝脏糜与增菌液混合，静置，待混合液变淡红色后，取2～3滴混合液滴入TSA培养基上，涂布，得到涂布有混合液的TSA培养基；

2)取渔类抗菌药的药敏纸片置于所述涂布有混合液的TSA培养基上，压平所述药敏纸片后密封；

3)将密封后的TSA培养基置于37℃条件下恒温培养12～24h，观察细菌生长情况，测定药敏纸片周围的无菌圈直径，根据美国CLSI判断标准进行药敏程度判读。

优选的，步骤1)中所述静置的时间为4～6h。

优选的，步骤1)中涂布后，还包括将涂布有混合液的TSA培养基静置5～6min晾干水分。

优选的，步骤3)中所述美国CLSI判断标准如下：

本发明提供的淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒，与现在技术相比，本发明的有益效果是：

(1)快速：拿到鱼病样，可立即进行药敏试验，接种后经过12-48h培养，可以得到实验结果；

(2)准确：直接测量抑菌圈；

(3)操作简单：操作步骤简单，方便；

(4)技术要求低：可在实验室或野外操作，对实验结果影响不大；

(5)同时分离获得耐药菌株；

(6)试剂盒成本低廉，方便实用，准确高效，适合大规模生产。

附图说明

图1为本发明药敏试剂盒的示意图；其中：1一次性培养皿，直径90mm；2TSA培养基；3EP管；4装在EP管里的药敏纸片；5EP管；6装在EP管里的增菌液；7涂布棒；8滴管；9封口胶。

具体实施方式

本发明提供了一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒，包括以下组成：

TSA培养基、渔类抗菌药的药敏纸片和增菌液。

本发明提供的检测试剂盒包括TSA培养基。所述TSA培养基的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知TSA培养基即可，例如商品购买或自制。所述TSA培养基的配方如下：胰蛋白胨17g/L、大豆胨3g/L、葡萄糖2.5g/L、NaCl₅ g/L、K₂HPO₄2.5 g/L、琼脂20g/L，pH值7.0～7.2。所述TSA培养基的配制方法将各组分混合、溶解于蒸馏水中，在121℃灭菌15min，备用。所述TSA培养基的作用是提供药敏抑菌直径的载体。

本发明提供的检测试剂盒包括渔类抗菌药的药敏纸片。所述渔类抗菌药的药敏纸片优选包括氟苯尼考的药敏纸片、磺胺异恶唑的药敏纸片、阿莫西林的药敏纸片、恩诺沙星的药敏纸片、盐酸新霉素的药敏纸片、链霉素的药敏纸片、诺氟沙星的药敏纸片和强力霉素的药敏纸片中的一种或几种。所述药敏纸片的直径优选为6mm，各药敏纸片中抗生素的负载量如下：氟苯尼考(30μg/片)、磺胺异恶唑(300μg/片)、阿莫西林(20/10μg/片)、恩诺沙星(5μg/片)、盐酸新霉素(30μg/片)、链霉素(10μg/片)、诺氟沙星(10μg/片)、强力霉素(30μg/片)。本发明对所述渔类抗菌药的药敏纸片的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的渔类抗菌药的药敏纸片的来源即可。在本发明实施例中，所述渔类抗菌药的药敏纸片购于杭州天和生物科技有限公司。所述渔类抗菌药的药敏纸片的作用提供抑菌作用的抗生素形成抑菌圈。

本发明提供的检测试剂盒包括增菌液。本发明对所述增菌液的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的增菌液的来源即可，例如商品购买途径获得的增菌液或自制的增菌液。所述增菌液优选以TSB培养基为基础培养基，还优选包括体积浓度9～11％的鱼血清和0.02％～0.04％的阿尔玛蓝溶液指示剂，更优选为包括体积浓度10％的鱼血清和0.034％的阿尔玛蓝溶液指示剂。TSB培养基的配方如下：胰蛋白胨17g/L、大豆胨3g/L、葡萄糖2.5g/L、NaCl5 g/L和K₂HPO₄2.5 g/L，pH值为7.0～7.2。

本发明提供的检测试剂盒优选还包括滴管、封口胶和用于盛装TSA培养基的培养皿。所述培养皿的直径优选为90mm。所述培养皿优选为一次性培养皿。所述滴管用于吸取增菌培养后的混合液，所述滴管的规格没有特殊限制，采用本领域所熟知的滴管规格即可。所述封口胶用于密封装有TSA培养基的培养皿。本发明对滴管、封口胶和培养皿的来源均没有特殊限制，采用本领域所熟知的常规购买途径获得即可。

本发明提供了所述检测试剂盒在筛选治疗淡水鱼类细菌病的抗生素或筛选耐抗生素的菌株中的应用。所述应用中，筛选治疗淡水鱼类细菌病的抗生素的方法是将染病淡水鱼中的致病细菌在TSA培养基上培养，致病细菌对药敏纸片形成的抑菌圈的大小判断致病细菌对负载在药敏纸片上的抗生素的敏感程度，从而掌握致病细菌对常见抗生素的耐药性及敏感性，根据该结果选择敏感性强的抗生素，以便及时指导养殖户高效用药，提高用药治疗效果或者可以筛选出对抗生素耐药性强的菌株，用于后续技术研究。

本发明提供了一种基于所述检测试剂盒快速检测淡水鱼类细菌病药敏的方法，包括以下步骤：

1)取患细菌病淡水鱼的肝脏，剪碎，得到的肝脏糜与增菌液混合，静置，待混合液变淡红色后，取2～3滴混合液滴入TSA培养基上，涂布，得到涂布有混合液的TSA培养基；

2)取渔类抗菌药的药敏纸片置于所述涂布有混合液的TSA培养基上，压平所述药敏纸片后密封；

3)将密封后的TSA培养基置于37℃条件下恒温培养12～24h，观察细菌生长情况，测定药敏纸片周围的无菌圈直径，根据美国CLSI判断标准进行药敏程度判读。

在本发明中，所述淡水鱼的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的淡水鱼即可。所述细菌病的致病细菌的种类没有特殊限制，淡水鱼常见的致病细菌均可采用本发明提供的方法进行测定。

在本发明中，所述肝脏糜的质量与增菌液的体积比优选为0.5～1g：2.5～3.0mL，更优选为1g：3mL。所述静置的时间优选为4～6h，更优选为5h。静置过程，细菌在增殖液中进行增殖培养获得菌液，当混合液变淡红色，说明细菌增殖可进行下一步接种及药敏试验，但是如果增菌液不变色，说明细菌未增殖，停止试验。

在本发明中，涂布后，还优选包括将涂布有混合液的TSA培养基静置5～6min晾干水分。

在本发明中，渔类抗菌药的药敏纸片置于所述涂布有混合液的TSA培养基上，优选每个培养基上放置4个相同或不同的所述渔类抗菌药的药敏纸片。

在本发明中，所述恒温培养的时间优选为15～22h，更优选为18h。所述恒温培养的时间根据致病细菌的种类不同而有所差异。所述测定药敏纸片周围的无菌圈直径的方法优选测定3次无菌圈直径，取平均值。

在本发明中，所述美国CLSI判断标准优选如下：

下面结合实施例对本发明提供的一种淡水鱼类细菌病药敏检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

淡水鱼类细菌病快速检测药敏试剂盒包括培养基、药敏纸片和接种工具，试剂盒的结构如图1所示。包括：平皿1，装在平皿内的TSA培养基2，装在EP管3里的八种常用渔类抗菌药的药敏纸片4，装有EP管5里的增菌液6，涂布棒7，滴管8，封口胶9。

利用本发明药敏试剂盒进行检测的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1：在背风处干净场地，取典型细菌病样1尾，剪开鱼的腹部，用无菌剪刀剪取肝脏0.5～1g。

步骤2：将肝脏放于EP管5，将肝脏剪烂后封盖，静置1h。

步骤3：将EP管5轻摇，用滴管8吸取2滴，滴到TSA培养基2上，然后用无菌涂布棒6均匀地涂布菌液,待晾干(约5min)。

步骤4：用镊子取EP管3内的药敏纸片4，贴于培养基2上，稍用力压紧压平，每个平板贴4张药敏纸片4，盖上皿盖，用胶布9封紧平皿。

步骤5：将TSA平皿1置于常温室内或专用培养箱(37℃)内培养，培养时间一般有鳞鱼类12～24h，无鳞鱼类36～48h。当观察到细菌斑圈，可进行测量抑菌圈，判断药物敏感性。

步骤6：结果参照美国CLSI判断标准如表1所示。

表1美国CLSI判断标准

实施例2

对10例来源于不同地区的罗非鱼病样进行药物检测，其步骤和结果如下：

取具典型病样的罗非鱼、白鲢鱼和草鱼，分别剪取肝脏组织，约1g，置于装有增菌培养基的EP管内，然后用剪烂肝脏，盖上盖子，自然增菌4～6h，可观察到增菌液由蓝色变成淡红色，用滴管取菌液2～3滴，滴到脂肪培养基上，用涂布棒涂抹均匀，待5min晾干后，贴上药敏药片，每个培养皿贴4～5片。然后用封口胶密封培养皿，将TSA培养皿置于室内培养12～24h后，进行结果判读，判断标准参照表1所示的美国CLSI判断标准。

3例药敏检测结果如表2所示。

表2细菌病的罗非鱼、白鲢鱼和草鱼的药敏实验结果

由上述实施例可知，本发明提供的检测试剂盒能实现快速、准确淡水鱼致病细菌对常见的8种抗生素的耐药性及敏感性，从而为选择针对性的抗生素提供依据。同时本发明提供的检测方法具有快速：、准确、操作简单：操作步骤简单，方便，对技术要求低的特点；在实现筛选适合的抗生素的同时还能同时分离获得耐药菌株。此外，试剂盒成本低廉，方便实用，准确高效，适合大规模生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。