一种口腔类微生物数量快速测定方法、试剂盒及应用
阅读说明：本技术 一种口腔类微生物数量快速测定方法、试剂盒及应用 (Method and kit for rapidly determining number of oral microorganisms and application of kit ) 是由 崔大祥 李雪玲 梁辉 田静 吕军鸿 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种口腔类微生物数量快速测定方法、试剂盒及应用,本发明所述测定方法包括下列步骤：(1)将待测样品进行ATP裂解释放；(2)在上述混合液中加入荧光检测液,混合均匀；(3)用荧光检测仪读取荧光值；(4)根据ATP标准品制作的标准曲线,获得微生物数量。本发明方法灵敏度高、成本低廉、操作简易,能够快速有效地测定口腔类微生物数量,可用于口腔清洁类产品抑菌效果评价和临床诊断等领域。(The invention discloses a rapid determination method of the number of oral microorganisms, a kit and application thereof, wherein the determination method comprises the following steps: (1) carrying out ATP cracking release on a sample to be detected; (2) adding a fluorescence detection solution into the mixed solution, and uniformly mixing; (3) reading the fluorescence value by using a fluorescence detector; (4) the microbial count was obtained according to a standard curve prepared from an ATP standard. The method has the advantages of high sensitivity, low cost and simple operation, can quickly and effectively determine the number of the oral microorganisms, and can be used in the fields of antibacterial effect evaluation and clinical diagnosis of oral cleaning products and the like.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种口腔类微生物数量快速测定方法、试剂盒及应用。
背景技术
在人的口腔内繁殖有大量的微生物，其中可能包含诱发牙齿龋齿、牙龈炎和牙周炎或口腔炎的微生物。因此，口腔类微生物数量的测量对于口腔疾病的诊断、预后以及口腔清洁类产品抑菌效果的评价等具有重要意义。目前测量口腔类微生物数量的方法主要为微生物平板培养，虽然该方法灵敏度高，为微生物数量测定的“金标准”，但其存在操作复杂、所需时间长、不能测定无法培养微生物的数量等缺点。因此，寻找一种不依赖于培养的操作简易、灵敏度高的口腔类微生物数量的快速测定方法是相关领域技术人员亟待解决的问题。
ATP生物荧光检测是基于生物发光体系的发光机理所设计，生物体发光细胞内具有特殊的发光物质——荧光素及荧光素酶，荧光素在荧光素酶催化下，由三磷酸腺苷（ATP）激活发出荧光光子。由于所有生物活细胞中含有恒量的ATP，所以ATP含量可以清晰地表明样品中微生物与其他生物残余的多少。其荧光强度与ATP浓度在一定范围内成线性关系。利用这一发光体系测定微生物释放出的ATP，可进行微生物含量的测定，为在数分钟内检测微生物提供了一种简便而灵敏的方法。目前，尚未见有将ATP生物荧光检测方法用于测定口腔类微生物数量的报道。
发明内容
本发明目的在于，一种口腔类微生物数量快速测定方法。以克服当前口腔微生物数量测定中所遇到的操作复杂、所需时间长、不能测定无法培养微生物的数量等问题。
本发明的再一目的在于：提供一种口腔类微生物数量快速测定试剂盒。
本发明的又一目的在于：提供一种口腔类微生物数量快速测定方法的应用，所述应用为口腔清洁类产品抑菌效果评价。
本发明目的通过下述方案实现：一种口腔类微生物数量快速测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将待测样品进行ATP裂解释放；
（2）在上述混合液中加入荧光检测液，混合均匀；
（3）用荧光检测仪读取荧光值；
（4）根据ATP标准品制作的标准曲线，获得微生物数量。
本发明克服了当前口腔微生物数量测定中所遇到的操作复杂、所需时间长、不能测定无法培养微生物的数量等问题。基于口腔类微生物的特点，基于ATP生物荧光检测方法所提供的一种口腔类微生物数量测定方法具有操作简便、检测时间短，灵敏度高，降低了无法培养微生物的漏检率。
本发明所述的待测样品包括临床诊断样品、口腔类微生物的纯培养物中的一种或多种。所述的临床诊断样品包括拭子、唾液中的一种或多种。
本发明所述的ATP裂解释放的方法包括表面活性剂裂解释放、加热煮沸裂解释放、超声裂解释放、酸裂解释放、碱裂解释放等裂解释放方法中的一种。
本发明所述的荧光检测液包括荧光素、荧光素酶中的一种或多种。所述的荧光检测液是每60mL的ATP荧光试剂缓冲溶液包含32mg荧光素酶、25.2mg的D-荧光素和112mg牛血清蛋白。其中，所述的ATP荧光试剂缓冲溶液是每1000mL水中溶解有4.468g三羟甲基氨基甲烷、0.732g乙二胺四乙酸二钠、3.232g乙酸镁、26.8mg二巯基苏糖醇、100g的β-环糊精和3.7g葡萄糖。
本发明所述的荧光检测仪，包括生物化学发光检测仪、实时荧光检测仪、便携式荧光检测仪等。
本发明提供一种口腔类微生物数量快速测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表面活性剂、荧光素、荧光素酶、ATP标准品中的一种或多种。
本发明所述的表面活性剂，其特征在于，所述的表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、苯扎溴铵（BAB）、苯扎氯胺（BAC）、二羟基苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、三氯乙酸（TCA）等中的一种或多种。
本发明提供一种口腔类微生物数量快速测定方法的应用，其特征在于，所述应用为口腔清洁产品抑菌效果评价。
本发明所述的ATP标准品用于绘制标准曲线。在与ATP标准品实验条件一致的情况下，后续测试待测样品时，标准曲线的绘制非必需。
本发明为口腔清洁类产品和临床诊断等领域提供了一种口腔类微生物数量快速测定方法。本发明有益效果包括：采用本发明测定口腔类微生物数量的方法具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高等优点。与目前常用的微生物培养法相比，本发明采用的基于ATP生物荧光检测原理，不需要进行微生物培养，避免了繁琐的培养基制备、涂板和菌落计数等步骤，因而，非常适于口腔清洁类产品抑菌效果评价和临床诊断。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
绘制ATP标准品标准曲线的方法，按下述步骤：
取ATP标准品（0.5mmol/L），在ATP标准品内加入400μL冰浴无菌生理盐水轻轻振动混匀，制得10-4mol/L的ATP标准品稀释液，然后，依次进行10倍稀释，获得10-5～10-10mol/L的标准品系列稀释液；各浓度梯度ATP标准品分别与0.03% CTAB按体积比10:1轻轻振动混匀，4oC离心机，10000g离心5分钟，进行ATP裂解释放；
将20μL梯度ATP稀释液加入100μL自行配制的荧光检测液，混合均匀，反应3分钟；所述的荧光检测液是每60mL的ATP荧光试剂缓冲溶液包含32mg荧光素酶、25.2mg的D-荧光素和112mg牛血清蛋白，其中，所述的ATP荧光试剂缓冲溶液是每1000mL水中溶解有4.468g三羟甲基氨基甲烷、0.732g乙二胺四乙酸二钠、3.232g乙酸镁、26.8mg二巯基苏糖醇、100g的β-环糊精和3.7g葡萄糖；
用荧光检测仪读取荧光值；
各个稀释梯度依次检测三个平行样品并求取平均值，以ATP标准品浓度对数值为横坐标，以对应荧光强度的对数值为纵坐标，绘制ATP标准品的标准曲线。
通过回归分析，得到一元线性方程为y=0.8546x+9.843（R2=0.9965，P<0.05）,表明由ATP标准品制作的标准曲线具有代表性。
实施例2
口腔类细菌数量的快速测定方法：
1，金黄色葡萄球菌是口腔颌面部多间隙感染的一种重要病原菌，本实施例实验所用的金黄色葡萄球菌菌株购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），编号为21600；
将在营养肉汤斜面培养20小时的金黄色葡萄球菌，用10ml无菌生理盐水冲洗斜面，振荡混匀，得菌悬液；
将菌悬液在4oC离心机，4000rpm，离心8分钟，用无菌生理盐水洗涤沉淀数次；然后，将沉淀悬浮在10ml生理盐水中；
取1ml菌悬原液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10-8；
并取最后5个梯度菌悬液按照国标法进行平板菌落计数；
分别取各梯度菌悬液与0.03% CTAB按体积比10:1振荡混匀，冰浴超声10分钟后，4oC离心机，11000g离心5分钟，取上清液；
把上清液20μL与100μL自行配制得到的荧光检测液（制备步骤与实施例1一致）混合均匀，反应3分钟；
用荧光检测仪读取荧光值；
采用平板计数法得到的微生物数量的对数值为横坐标，以对应荧光强度的对数值为纵坐标，绘制微生物各梯度菌落含量与荧光强度的标准曲线；
通过回归分析，得到一元线性方程为y=0.9926x-1.843（R2=0.9432，P<0.05）,表明各菌落浓度对数与相应荧光值对数呈正相关关系。
由上述标准曲线或者一元线性方程，可计算得出在某一发光值时对应的微生物含量。
按照上述方法，分别绘制大肠埃希氏菌（菌株购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为10421）和表皮葡萄球菌（菌株购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为1.4260）各梯度菌落含量与荧光强度的标准曲线，得到一元线性方程。
对各微生物在不同荧光值下菌落含量进行方差分析，结果表明，几种常见微生物对应的菌落浓度差异不显著，也就是说，在应用ATP荧光计数测定微生物数量时可忽略菌种差异的影响。
应用例
口腔类细菌数量的快速测定方法在口腔清洁类产品抑菌效果评价中的应用：
按照实施例1和实施例2中所用的试剂组分，配制试剂盒；口腔清洁类产品为本公司配制的漱口剂G。
将唾液平均分为三份，其中，第一份室温放置3分钟；第二份与清水等体积比例混匀3分钟；第三份与漱口剂G等体积比例混匀3分钟；然后，
按照实施例2的方法，分别将两个拭子用试剂盒中的CTAB进行ATP的裂解释放；然后，
加入荧光检测液；随后，
在便携式荧光检测仪（风途ATP荧光检测仪）中测定微生物数量。
结果显示，三份唾液样品中的微生物含量分别为3000，1500和48，表明口腔清洁类产品漱口剂G具有很好的抑菌效果。
采用拭子A在牙龈表面轻轻刮取3下，然后用漱口剂G漱口3分钟，然后用另一拭子B在同一位置牙龈表面轻轻刮取3下。然后按照实施例2的方法，分别将两个拭子用试剂盒中的CTAB进行ATP的裂解释放，然后加入荧光检测液，随后在便携式荧光检测仪（风途ATP荧光检测仪）中测定微生物数量。
结果表明，拭子A和拭子B含有的微生物数量分别为180和5，表明口腔清洁类产品漱口剂G具有很好的抑菌效果。
上述结果表明，本发明一种口腔类细菌数量的快速测定方法可以很好的用于口腔清洁类产品抑菌效果的评价。