一种材料表面抗菌性能的检测方法
阅读说明：本技术 一种材料表面抗菌性能的检测方法 (A kind of detection method of material surface anti-microbial property ) 是由 曹永平 于兵孝 塔拉提百克·买买提居马 吴浩 焦洋 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种材料表面抗菌性能的检测方法,涉及材料检测技术领域。该方法包括菌悬液的制备、材料预处理和抗菌性能检测,将菌悬液悬滴于被检测材料的表面培养,乙醇固定后染色观察。相比于传统的贴膜法检测,该检测方法省去了细菌洗脱、转种的过程,简化了操作步骤,减少了实验误差,及操作的出错率；另一方面,本发明提供的检测方法可以直接在材料表面观察细菌的生长情况来判断材料的抗菌性能,更加直观；该方法操作简单、有效、快捷,可广泛应用于各种非吸水性材料抗菌性能的检测。(The present invention provides a kind of detection methods of material surface anti-microbial property, are related to measuring for materials field.This method includes preparation, pretreatment and the anti-microbial property detection of bacteria suspension, and bacteria suspension hanging drop is cultivated in the surface for being detected material, the fixed poststaining observation of ethyl alcohol.It is detected compared to traditional film applicator coating, which eliminates the process of bacterium elution, transferred species, simplifies operating procedure, reduces experimental error, and the error rate of operation；On the other hand, the growing state that detection method provided by the invention can directly observe bacterium on the surface of the material carrys out the anti-microbial property of judgement material, more intuitively；This method is easy to operate, effective, quick, can be widely applied to the detection of various unwetted property material anti-microbial properties.)
技术领域
本发明涉及材料检测技术领域，尤其涉及一种材料表面抗菌性能的检测方法。
背景技术
随着科技的不断发展，人们对疾病与健康的深入认识和关注，抗菌材料的开发与应用也成为了目前研究的热点。抗菌材料是一类具有抗菌功能的新型材料，可广泛应用于医疗用品、生活用品、食品包装材料和建筑材料等领域，比如：抗菌纤维、抗菌塑料、抗菌涂料、抗菌金属、抗菌陶瓷等。在抗菌材料研制开发过程中需要对其抗菌性、物理性能、长效性、安全性等进行定性和/或定暈地评价。
目前常用的，对于抗菌材料抗细菌性能的检测方法包括定性检测和定量检测。定性检测包括平板培养基法、平板划线法和奎因法；定量检测包括浸渍法、贴膜法和振荡法。平板培养基法：将样品放在接种的平板培养基上，样品与被测菌充分接触培养一段时间后观察抑菌效果，适用于含有溶出型抗菌剂的抗菌材料及其制品的测定。平板划线法：在平板培养基上平行划线接种后，接触样品一段时间后，通过观察接触样品区和未接触样品区评价抗菌产品的抑菌作用，适用于含有溶出型抗菌剂的抗菌材料及其制品的测定。奎因法：样品包埋于一定量菌液的培养基内，培养一定时间后观察细菌在样品上及周围的生长情况和测定样品受侵蚀情况，适于评价抗菌塑料、抗菌织物等的抗菌效果。浸渍法：一定量的菌液均匀地滴入样品中，样品与菌接触培养一定时间后，计算与“0”时间的菌数减少率，适用于吸水性材料及其制品的评价。贴膜法：将菌液滴加在样品上，铺盖薄膜使菌液均匀涂覆在样品表面，接触一定时间后，洗脱细菌，转种至固体培养基培养，活菌计数，计算抗细菌率。适用于非吸水性材料及其制品的评价。振荡法：把样品浸泡在一定浓度的菌液中，振荡培养一段时间，样品洗脱后，转种至固体培养基培养，活菌计数并计算抗菌率。适用于面积较小、含有溶出型抗菌剂的抗菌材料及其制品的测定。不同的检测方法适用于不同的被检测材料，其中，在实际应用中最广泛使用的是贴膜法。此抗菌方法，需要在材料表面培养细菌后转种细菌到培养基上，根据细菌的生长情况判断抗菌性能，步骤复杂，耗时时间长。
随着抗菌性能检测技术的发展，中国专利CN108998500A公开了一种材料抗菌性能快速检测方法，该方法使用的是振荡培养法，振荡培养接触后的菌液加入TTC 标准溶液，经离心，萃取，测定OD值，根据TTC标准曲线，计算抗菌率。适用于溶出性材料的检测。中国专利CN101029866公开了一种利用硫代巴比妥酸法测定抗菌不锈钢抗菌性能的方法，该方法是将菌液覆盖于材料上，培养一段时间后，吸取与材料作用后的菌液，经过超声波震荡，添加硫代巴比妥酸溶液，水浴，测定溶液OD值，通过公式计算出脂质过氧化终产物丙二醛的含量，获得杀菌率。该方法避免了贴膜法测定程序复杂、费时费力、不适于考察大量样品抗菌性能等问题。虽然该方法避免了贴膜法测定程序复杂操作，但又增加超声波震荡、检测溶液的加入、水浴和OD值等检测步骤。
现有的材料抗菌性能的检测方法操作复杂，增大了实验误差，耗时较长。因此，亟需开发一种操作简单，快速、有效的材料抗菌性能的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种材料表面抗菌性能的检测方法。克服了现有技术存在的缺陷，该检测方法更为简单有效，减少了实验误差，及操作的出错率。
本发明一方面提供了一种材料表面抗菌性能的检测方法，所述的方法包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：活化试验菌，转种，液体培养基培养至对数期，用液体培养基调节菌种浓度，制成菌悬液；
S2、材料预处理：用70％乙醇溶液擦拭被检测材料表面，用无菌水冲洗，紫外线环境下自然干燥，得到预处理后的被检测材料；
S3、抗菌性能检测：将S1配制的菌悬液悬滴于S2预处理后的被检测材料的表面滴加量为4-6μl/cm2，均匀平铺在湿度为95％的无菌培养皿中，37℃恒温培养16-24小时，室温自然蒸发水分，80％-90％乙醇固定，常用的细菌染色方法进行染色，材料显微镜观察被检测材料表面细菌的生长情况，评估抗菌性能；
所述的液体培养基包括：TSB培养基、胰蛋白酶和甘露醇。
优选地，步骤S1中所述的液体培养基包括：TSB培养基94％-98％(v/v)、胰蛋白酶0.5％-2.5％(v/v)和甘露醇1.5％-3.5％(v/v)。
进一步优选地，步骤S1中所述的液体培养基包括：TSB培养基96.8％(v/v)、胰蛋白酶1.3％(v/v)和甘露醇1.9％(v/v)。
优选地，步骤S1中所述的液体培养基培养的条件为：温度28-32℃， 180-280r/min振荡培养20-28h。
优选地，步骤S1中所述的菌悬液的浓度为1-5×106CFU/mL；进一步优选地，步骤S1中所述的菌悬液的浓度为3×106CFU/mL。
优选地，步骤S1中所述的试验菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和绿脓假单胞菌 (Pesudomonaspyocyaneum)中的一种，可以是任何可检测的细菌。
优选地，步骤S2中所述的被检测材料可分为对照材料和抗菌材料，且均为非吸水性材料。
进一步优选地，上述的抗菌材料中含有的非溶出性抗菌物质。
优选地，表面积为2-8cm2。进一步优选地，被检测材料表面积为6cm2。
优选地，步骤S3中所述的细菌染色方法包括但不限于单染色法、革兰氏染色法和抗酸染色法中的一种；进一步优选地，步骤S3中所述的细菌染色方法为革兰氏染色法。
具体的，一种材料表面抗菌性能的检测方法包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：将试验菌接种至LB固体培养基中，在培养箱中，28℃活化培养24h，取活化后菌种，转种至液体培养基中，28-32℃，180-280r/min振荡培养20-28h，至细菌生长的对数期，取1mL菌液，用液体培养基调节菌种浓度至1-5×106CFU/mL，制成菌悬液；
S2、材料预处理：将被检测材料裁剪为表面积为2-8cm2，用70％乙醇溶液擦拭被检测材料表面，用无菌水冲洗30s，紫外线环境下自然干燥15-30min，得到预处理后的被检测材料；
S3、抗菌性能检测：将S1配制的菌悬液悬滴于S2预处理后的被检测材料的表面滴加量为4-6μl/cm2，均匀平铺在湿度为95％的无菌培养皿中，37℃恒温培养16-24小时，室温自然蒸发水分，80％-90％乙醇固定，常用的细菌染色方法进行染色，材料显微镜1000-1500倍观察被检测材料表面细菌的生长情况，评估抗菌性能；
所述的液体培养基为通用的液体培养基。
本发明另一方面还提供了上述的检测方法在非吸水性抗菌材料和产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供了一种新的材料表面抗菌性能的检测方法，对传统的材料表面抗菌性的检测进行了颠覆。相比于传统的贴膜法检测，本发明提供的检测方法省去了传统的贴膜法中的细菌洗脱、转种的过程，简化了操作步骤，减少了实验误差，及操作的出错率；另一方面，本发明提供的检测方法可以直接在材料表面观察细菌的生长情况来判断材料的抗菌性能，更加直观。该方法操作简单、有效、快捷，可广泛应用于各种非吸水性材料抗菌性能的检测。
附图说明
图1中，图(A)为实施例2中对照材料的观察结果图，图(B)为实施例 2中抗菌材料的观察结果图；
图2中，图(A)为贴膜培养对照材料的观察结果图，图(B)为贴膜培养抗菌材料的观察结果图。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例1：
一种材料表面抗菌性能的检测方法包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：将大肠杆菌(ATCC 25922)接种至LB固体培养基中，在培养箱中，28℃活化培养24h，取活化后菌种，转种至液体培养基中，28℃， 180r/min振荡培养20h，至细菌生长的对数期，取1mL菌液，用液体培养基调节菌种浓度至1×106CFU/mL，制成菌悬液；
S2、材料预处理：将被检测材料(对照材料和抗菌材料)裁剪为表面积为 2cm2，用70％乙醇溶液擦拭被检测材料表面，用无菌水冲洗30s，紫外线环境下自然干燥15min，得到预处理后的被检测材料；
S3、抗菌性能检测：将S1配制的菌悬液悬滴于S2预处理后的被检测材料的表面滴加量为4μl/cm2，均匀平铺在湿度为95％的无菌培养皿中，37℃恒温培养16小时，室温自然蒸发水分，80％乙醇固定，革兰氏染色法进行染色，材料显微镜1000倍观察被检测材料表面细菌的生长情况，评估抗菌性能。
同时，利用“抗菌塑料的应用及抗菌性能评价(彭如群et al.，2011)”中的贴膜法以及JIS Z 2801-2000和QB/T2591-2003标准进行复核。
所述的液体培养基包括：TSB培养基94％(v/v)、胰蛋白酶2.5％(v/v)和甘露醇3.5％(v/v)。
材料表面抗菌性能的判读：随机观察多个视野(本实施例观察20个视野) 的菌落计数，根据公式计算材料抗菌率。抗菌率＝(1-抗菌材料每视野平均菌落数/对照材料每视野平均菌落数)*100％。
检测结果表明，受检的抗菌材料对大肠杆菌的抗菌率为98.7％，贴膜法JIS Z2801-2000和QB/T2591-2003标准复核的抗菌率为98.6％和98.6％，说明本实施例所述方法的检测结果与贴膜法结果基本一致，无显著差异。
实施例2：
一种材料表面抗菌性能的检测方法包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：将金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)接种至LB固体培养基中，在培养箱中，28℃活化培养24h，取活化后菌种，转种至TSB液体培养基中，30℃，220r/min振荡培养24h，至细菌生长的对数期，取1mL菌液，用TSB 液体培养基调节菌种浓度至3×106CFU/mL，制成菌悬液；
S2、材料预处理：将被检测材料(对照材料和抗菌材料)裁剪为表面积为 6cm2，用70％乙醇溶液擦拭被检测材料表面，用无菌水冲洗30s，紫外线环境下自然干燥20min，得到预处理后的被检测材料；
S3、抗菌性能检测：将S1配制的菌悬液悬滴于S2预处理后的被检测材料的表面滴加量为5μl/cm2，均匀平铺在湿度为95％的无菌培养皿中，37℃恒温培养20小时，室温自然蒸发水分，85％乙醇固定，革兰氏染色法进行染色，材料显微镜1000倍观察被检测材料表面细菌的生长情况，评估抗菌性能。
同时，利用“抗菌塑料的应用及抗菌性能评价(彭如群et al.，2011)”中的贴膜法以及JIS Z 2801-2000和QB/T2591-2003标准进行复核。
所述的液体培养基包括：TSB培养基96.8％(v/v)、胰蛋白酶1.3％(v/v) 和甘露醇1.9％(v/v)。
材料表面抗菌性能的判读：随机观察多个视野(本实施例观察20个视野) 的菌落计数，根据公式计算材料抗菌率。抗菌率＝(1-抗菌材料每视野平均菌落数/对照材料每视野平均菌落数)*100％。
本实施例在材料显微镜下的观察图片如图1所示，其中图(A)和图(B) 分别是对照材料和抗菌材料的观察结果图；贴膜法进行复核后的结果如图2所示，其中图(A)和图(B)分别是对照材料和抗菌材料的结果图。由于观察结果图片较多，本发明仅展示本实施例的一个观察结果图，其他实施例的结果图片与本实施例相似。
检测结果表明，受检的抗菌材料对金黄色葡萄球菌的抗菌率为99.4％，贴膜法JISZ 2801-2000和QB/T2591-2003标准复核的抗菌率为99.4％和99.4％，说明本实施例所述方法的检测结果与贴膜法结果基本一致，无显著差异。
实施例3：
一种材料表面抗菌性能的检测方法包括以下步骤：
S1、菌悬液的制备：将绿脓假单胞菌(CMCC(B)10104)接种至LB固体培养基中，在培养箱中，28℃活化培养24h，取活化后菌种，转种至LB液体培养基中，32℃，280r/min振荡培养28h，至细菌生长的对数期，取1mL菌液，用 LB液体培养基调节菌种浓度至5×106CFU/mL，制成菌悬液；
S2、材料预处理：将被检测材料(对照材料和抗菌材料)裁剪为表面积为 8cm2，用70％乙醇溶液擦拭被检测材料表面，用无菌水冲洗30s，紫外线环境下自然干燥15min，得到预处理后的被检测材料；
S3、抗菌性能检测：将S1配制的菌悬液悬滴于S2预处理后的被检测材料的表面滴加量为6μl/cm2，均匀平铺在湿度为95％的无菌培养皿中，37℃恒温培养24小时，室温自然蒸发水分，90％乙醇固定，革兰氏染色法进行染色，材料显微1000倍观察被检镜测材料表面细菌的生长情况，评估抗菌性能。
时，利用“抗菌塑料的应用及抗菌性能评价(彭如群et al.，2011)”中的贴膜法以及JIS Z 2801-2000和QB/T2591-2003标准进行复核。
所述的液体培养基包括：TSB培养基98％(v/v)、胰蛋白酶0.5％(v/v)和甘露醇1.5％(v/v)。
材料表面抗菌性能的判读：随机观察多个视野(本实施例观察20个视野) 的菌落计数，根据公式计算材料抗菌率。抗菌率＝(1-抗菌材料每视野平均菌落数/对照材料每视野平均菌落数)*100％。
检测结果表明，受检的抗菌材料对绿脓假单胞菌的抗菌率为98.3％，贴膜法 JISZ 2801-2000和QB/T2591-2003标准复核的抗菌率为98.1％和98.2％，说明本实施例所述方法的检测结果与贴膜法结果基本一致，无显著差异。
对比例1：
分别利用实施例1-3中的方法设置对照1-3，对照1-3与实施例1-3中的方法区别仅在于，所述的液体培养基不添加胰蛋白酶。
检测结果表明，对照1-3的被检测材料(对照材料)表面均出现了单菌落集中生长的现象，导致无法准确计数。
对比例2：
分别利用实施例1-3中的方法设置对照4-6，对照4-6与实施例1-3中的方法区别仅在于，步骤S3所述抗菌性能检测中，37℃恒温培养26小时。
检测结果表明，对照4-6的被检测材料(对照材料和抗菌材料)表面均出现了单菌落集中生长的现象，导致无法准确计数。
对比例3：
分别利用实施例1-3中的方法设置对照7-9，对照7-9与实施例1-3中的方法区别仅在于，步骤S3所述抗菌性能检测中，菌悬液在被检测材料的表面滴加量为3μl/cm2。
检测结果表明，对大肠杆菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538) 和绿脓假单胞菌(CMCC(B)10104)的检测，对照7-9的抗菌率分别为96.3％、 97.5％和95.6％，与贴膜法的检测结果相比均偏小，准确度较低。
综上，本发明提供的材料表面抗菌性能的检测方法与传统的贴膜法相比，更为简单，检测结果与贴膜法结果基本一致，可准确、有效、快速地检测材料表面抗菌性能，减少了实验误差及操作的出错率，节省了大量的时间。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。