阅读说明：本技术 柠檬苦素在制备预防和治疗急性肾损伤药物中的用途 (Application of limonin in preparation of medicine for preventing and treating acute kidney injury ) 是由 傅海燕 周栋 刘史佳 周先可 卢嘉微 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,涉及一种中草药单体柠檬苦素在制备预防和治疗急性肾损伤药物中的用途。本发明分别通过体内、体外研究发现,柠檬苦素具有明显的抑制肾小管上皮细胞凋亡,促进增殖的生物学作用,其对缺血-再灌注或化疗药物顺铂诱导的急性肾损伤具有明显的肾保护作用。因此,柠檬苦素可以应用于制备预防和治疗急性肾损伤的药物,具有明显的肾保护作用,且毒副作用小,成本低廉。(The invention belongs to the field of medicines, and relates to application of a Chinese herbal medicine monomer limonin in preparation of a medicine for preventing and treating acute kidney injury. The limonin is found to have obvious biological effects of inhibiting the apoptosis of renal tubular epithelial cells and promoting proliferation through in vivo and in vitro researches respectively, and has obvious renal protection effect on acute renal injury induced by ischemia-reperfusion or chemotherapeutic drug cisplatin. Therefore, the limonin can be applied to preparing the medicine for preventing and treating acute kidney injury, has obvious kidney protection effect, and has small toxic and side effect and low cost.)

柠檬苦素在制备预防和治疗急性肾损伤药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种中草药单体柠檬苦素(Limonin)的用途，具体涉及柠檬苦素在制备预防和治疗急性肾损伤药物中的用途。

背景技术

急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是临床常见的急危重症，起病急、进展快、死亡率高，严重威胁着人类健康。患者主要表现为肾功能的快速下降及代谢废物的蓄积，临床诊断依据为血清肌酐(Serum Creatinine，Scr)升高和尿量的减少。AKI发病率高，且逐年呈上升趋势。流行病学资料显示：即使是轻微的、可逆的AKI也会造成肾脏组织的持久损伤；严重的AKI则导致肾功能的不可逆下降，增加死亡风险。由于目前缺乏针对性的预防和保护药物，AKI及其进一步发展导致的慢性肾脏病，仍是我国及全球医疗卫生事业的一大难题。因此，深入探索AKI的发病的机制，寻找特异的治疗靶点，开发有效的预防和治疗药物则显得尤为迫切和重要。

肾脏缺血、肾毒性药物、脓毒血症、泌尿系梗阻等多种病因导致AKI的机制虽有不同，但基本都涉及血流动力学的改变、氧化应激损伤和炎症反应这几个病理生理环节。上述病理生理上的改变均导致肾小管上皮细胞受损，肾小球滤过和肾小管重吸收障碍，肾脏功能急剧下降，肾脏损伤进一步加重，最终导致肾脏功能不可逆转的下降。AKI发生后，肾小管上皮细胞最先受累，大量细胞从G0期进入G1期，进行损伤修复；修复成功，则进入下一个细胞周期；若修复失败，或损伤过重，则出现凋亡和坏死，释放炎症因子，介导组织炎症反应，扩大反应，加重损伤。因此，如何抑制肾小管细胞凋亡，促进组织修复，是有效预防和治疗AKI发生发展的关键所在。

柠檬苦素(Limonin)是存在于芸香科和楝科植物中的一种三萜类化合物，是植物中重要的具有高度生物活性的次生代谢产物。近年来，柠檬苦素越来越受到科学家们的关注，发现其有良好的抗炎、抗菌、镇痛、抗肿瘤等作用。在大鼠缺血-再灌注引起的肝损伤模型中，柠檬苦素能通过抑制乳酸脱氢酶活性，降低氧化应激水平，减轻肝细胞变性坏死；柠檬苦素还能抑制TLR-4-NFκB信号通路的活化，抑制炎症因子的释放，发挥肝保护作用。此外，在结肠癌、乳腺癌和肝癌等小鼠体内外研究还发现，柠檬苦素可抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，发挥有效的抗癌作用。然而，在急性肾损伤治疗领域对于柠檬苦素的研究在国内外未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供中药单体柠檬苦素(Limonin)的新用途，具体是柠檬苦素在制备预防和治疗急性肾损伤药物中的用途。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的急性肾损伤是缺血-再灌注或化疗药物顺铂引起的急性肾损伤。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的药物是用于抑制缺血-再灌注或化疗药物顺铂引起的肾小管上皮细胞凋亡药物。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的药物是用于促进缺血-再灌注或化疗药物顺铂引起的肾小管上皮细胞增殖药物。

本发明分别通过体内动物学实验和体外细胞学实验发现，柠檬苦素可通过抑制肾小管上皮细胞凋亡，促进肾小管上皮细胞增殖，发挥显著的肾功能保护作用。因此，柠檬苦素可以应用于制备预防和治疗急性肾损伤的药物，具有明显的肾保护作用，且毒副作用小，成本低廉。

具体的，发明人分别在小鼠双侧缺血-再灌注(BIRI)和顺铂诱导的AKI模型中发现：小鼠经柠檬苦素灌胃治疗后，可显著恢复血清肌酐、血清尿素氮水平，肾组织病理损伤减轻，肾小管上皮细胞凋亡减少。体外细胞学实验进一步证明，柠檬苦素分别对缺氧-复氧和顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有显著的抑制作用；同时，柠檬苦素还可促进肾小管上皮细胞增殖。综上，柠檬苦素具有显著的肾保护作用，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效的AKI预防和治疗药物。

本发明首次揭示：柠檬苦素对缺血-再灌注和顺铂注射引起的小鼠急性肾损伤具有明显的保护作用。该研究在国内外未见报道，其成果对开发AKI预防和治疗药物具有重大的现实意义。

附图说明

图1A至图1C显示柠檬苦素可恢复小鼠肾脏双侧缺血-再灌注(BIRI)损伤引起的急性肾功能下降和肾组织损伤。其中，图1A显示生化方法检测小鼠血清肌酐水平变化；图1B显示生化方法检测小鼠血清尿素氮水平变化；图1C和图1D显示PAS(Periodic Acid-Schiffstain)染色显示小鼠肾脏组织病理学变化。

图2A至图2E显示柠檬苦素抑制小鼠肾脏双侧缺血-再灌注(BIRI)损伤引起的肾脏组织细胞凋亡，采用蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)方法检测细胞凋亡分子的表达变化。

图3A至图3F显示柠檬苦素在体外抑制缺氧-复氧引起的肾小管上皮细胞凋亡，采用Western Blot方法检测细胞凋亡分子的表达变化，采用流式细胞术检测凋亡细胞比例。

图4A至图4D显示柠檬苦素可恢复化疗药物顺铂引起的小鼠急性肾功能下降和肾组织损伤；其中，图4A显示生化方法检测小鼠血清肌酐水平变化；图4B显示生化方法检测小鼠血清尿素氮水平变化；图4D显示PAS染色显示小鼠肾脏组织病理学变化。

图5A至图5E显示柠檬苦素抑制顺铂引起的小鼠肾脏组织细胞凋亡，采用WesternBlot方法检测细胞凋亡分子的表达变化。

图6A至图6E显示柠檬苦素在体外抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡；采用Western Blot方法检测细胞凋亡分子的表达变化；采用流式细胞术检测凋亡细胞比例。

图7A至图7D显示柠檬苦素在体外促进肾小管上皮细胞增殖，采用Western Blot方法检测细胞增殖相关分子的表达变化。

具体实施方式

下面仅以实施例的方式结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例一：柠檬苦素对小鼠肾脏双侧缺血-再灌注(BIRI)损伤引起的急性肾损伤的保护作用

1、实验动物：C57小鼠，雄性，8周龄，体重20-22g，SPF级。小鼠24只，随机分为4组，假手术组4只，手术组6只，低剂量(40mg/kg/d)治疗组11只，高剂量(80mg/kg/d)治疗组7只。

治疗药物：柠檬苦素，来源于南京中医药大学刘史佳教授课题组，其纯化与制备工艺已获得发明专利(专利号：CN201410005038.8)。柠檬苦素用Kolliphor HS(Sigma)溶解。

2、各组处理

1)假手术组：室温，3％戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后，选择腹部正中切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，分别将左、右两侧肾脏暴露肾蒂后随即逐层缝合。

2)缺血-再灌注组：麻醉及手术入路同上，将左、右两侧肾动静脉用微型动脉夹夹闭35min，体温维持在37℃；然后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况；逐层缝合局部并消毒。术前3天起小鼠进行Kolliphor HS灌胃，剂量5mg/kg，1次/天，连续灌胃4天。

3)低剂量治疗组：麻醉及手术入路同缺血-再灌注组，术前3天起小鼠进行柠檬苦素灌胃治疗，剂量40mg/kg，1次/天，连续灌胃4天。

4)高剂量治疗组：麻醉及手术入路同缺血-再灌注组，术前3天起小鼠进行柠檬苦素灌胃治疗，剂量80mg/kg，1次/天，连续灌胃4天。

3、实验过程

各组小鼠分笼饲养。术前3天，缺血-再灌注组给予KolliphorHS灌胃，低/高剂量治疗组给予柠檬苦素灌胃；1次/天，连续灌胃4天；于灌胃第3天，行双侧缺血-再灌注手术。术后1天，各组小鼠留取血、尿后处死，摘取双侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定、液氮冷冰冻组织。血液凝固后留取血清，经大生化仪检测肌酐和尿素氮水平；甲醛固定组织经脱水、包埋、切片、制片后，进行PAS染色；冰冻组织匀浆后提取蛋白，Western Blot方法检测凋亡相和增殖相关分子的蛋白表达变化。

4、实验结果

1)柠檬苦素对缺血-再灌注引起的急性肾功能下降有明显的保护作用

实验结果如图1A和图1B所示，与假手术组相比，缺血-再灌注组血清肌酐、血清尿素氮升高，提示肾功能受损；低/高剂量治疗组血清肌酐、血清尿素氮水平明显降低，尤以高剂量组更为明显。

2)柠檬苦素对缺血-再灌注引起的肾组织损伤有明显的保护作用

实验结果如图1C和图1D所示，PAS染色结果显示，与假手术组相比，缺血-再灌注组肾组织损伤明显，肾小管扩张，刷状缘消失，肾小管上皮细胞坏死、脱落；治疗组上述病理变化明显减轻。

3)柠檬苦素可抑制缺血-再灌注引起的肾组织细胞凋亡

实验结果如图2A至图2E所示，与假手术组相比，缺血-再灌注组凋亡分子P53、Fas、Bax、cleaved-caspase-3表达升高，抗凋亡分子survivin表达降低；治疗组上述凋亡分子降低，抗凋亡分子表达升高。

实施例二：柠檬苦素在体外可抑制缺氧-复氧诱导的肾小管上皮细胞凋亡

1、实验材料：

细胞：人肾小管上皮细胞(HK-2)。

培养基：含10％FBS的DMEM/F12(1:1)培养基。

培养条件：常规培养：37℃含5％CO₂培养箱；缺氧培养：37℃含5％N₂，5％CO₂培养箱。

2、实验处理：

将状态良好的人肾小管上皮细胞HK-2以1.5×10⁶种于6孔细胞培养板过夜培养，改换无血清培养基DMEM/F12(1:1)进行血清饥饿24小时后，药物组的细胞培养基中加入柠檬苦素(10ng/mL)预处理1小时，然后将缺氧组、药物组同时放入缺氧孵箱(5％N₂，5％CO₂)培养24h，然后再转入常规孵箱复氧2h。收取蛋白，进行Western blot和流式细胞仪检测凋亡指标。

3、实验结果：

柠檬苦素可抑制缺氧-复氧引起的人肾小管上皮细胞凋亡。

实验结果如图3A所示，缺氧-复氧可引起人小管上皮细胞HK-2凋亡指标升高，如PARP-1、Fas、FasL、FADD、Cl-cas3(cleaved-caspase3)；若预先加入柠檬苦素处理后，则可有效抑制上述凋亡分子的升高；α-tubulin为内参照。图3B至图3F为图3A的统计结果。

实施例三：柠檬苦素对顺铂注射小鼠引起的急性肾损伤的保护作用

1、实验动物：C57小鼠，雄性，8周龄，体重20-22g，SPF级。小鼠35只，随机分为3组，对照组9只，手术组14只，治疗组(80mg/kg/d)12只。

2、各组处理

1)对照组：小鼠腹腔注射生理盐水20mL/kg，核实标记，置于相应鼠笼。

2)顺铂注射组：小鼠腹腔注射化疗药物顺铂20mg/kg，建立急性肾损伤模型。核实标记，置于相应鼠笼。

3)治疗组：顺铂诱导的急性肾损伤模型方法建立手术同上，建立前3天起小鼠进行灌胃治疗，80mg/kg，1次/天，连续灌胃5天。

3、实验过程

各组小鼠分笼饲养。对照组仅观察；顺铂注射组给予溶剂Kolliphor HS灌胃；治疗组给予柠檬苦素灌胃；80mg/kg/天；连续灌胃5天，于灌胃第3天，小鼠腹腔注射顺铂，20mg/kg，1次/天，连续3天。注射后第3天，各组小鼠留取血、尿后处死，摘取双侧肾脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冰冻组织。血液凝固后留取血清，经大生化仪检测肌酐和尿素氮水平；甲醛固定组织经脱水、包埋、切片、制片后，进行PAS染色；冰冻组织匀浆后提取蛋白，用Western Blot检测凋亡相关分子的蛋白表达变化。

4、实验结果

1)柠檬苦素对顺铂引起的急性肾功能下降有明显的保护作用

实验结果如图4A和图4B所示，与对照组相比，顺铂注射后引起血清肌酐、血清尿素氮升高，提示肾功能受损；治疗组血清肌酐、血清尿素氮水平明显降低。

2)柠檬苦素对顺铂引起的肾组织损伤有明显的保护作用

实验结果如图4C和图4D所示，PAS染色显示顺铂注射组出现明显的肾组织病理损伤，肾小管扩张，刷状缘消失，小管上皮细胞坏死、脱落；而治疗组肾脏组织病变显著减轻。

3)柠檬苦素可抑制顺铂引起的肾组织细胞凋亡

实验结果如图5A至图5E所示，与对照组相比，顺铂注射组凋亡分子P53、Fas、Bax、Cl-cas3(cleaved-caspase3)表达显著升高；治疗组中上述分子表达降低；α-tubulin为内参照。

实施例四：柠檬苦素在体外可抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

1、实验材料：

细胞：人肾小管上皮细胞(HK-2)。

培养基：含10％FBS的DMEM/F12(1:1)培养基。

培养条件：常规培养：37℃含5％CO₂培养箱。

2、实验处理：

将状态良好的人肾小管上皮细胞HK-2以1.5×10⁶种于6孔细胞培养板过夜培养，改换无血清培养基DMEM/F12(1:1)进行血清饥饿24小时后，顺铂+药物组的细胞培养基中加入柠檬苦素(10ng/mL)预处理1小时，然后顺铂组、顺铂+药物组分别加入顺铂25ug/ml诱导凋亡。12小时后收取细胞，分别进行Western blot和流式细胞仪检测凋亡指标。

3、实验结果：柠檬苦素可抑制顺铂诱导的人肾小管上皮细胞凋亡。

实验结果如图6A所示，顺铂可诱导人小管上皮细胞HK-2凋亡指标升高，如PARP-1、Fas、FasL、FADD、Bax；若预先加入柠檬苦素处理后，则可有效抑制上述凋亡分子的升高；α-tubulin为内参照。图6B至图6E为图6A的统计结果。

实施例五：柠檬苦素在体外可促进肾小管上皮细胞增殖

1、实验材料：

细胞：人肾小管上皮细胞(HK-2)。

培养基：含10％FBS的DMEM/F12(1:1)培养基。

培养条件：常规培养：37℃含5％CO₂培养箱。

2、实验处理：

将状态良好的人肾小管上皮细胞HK-2以1.5×10⁶种于6孔细胞培养板过夜培养，改换无血清培养基DMEM/F12(1:1)进行血清饥饿24小时后，药物组的细胞培养基中加入柠檬苦素(10ng/mL)，分别于加药后0-3天后收取细胞，Westblot方法检测细胞增殖指标。

3、实验结果：

柠檬苦素可促进人肾小管上皮细胞增殖。如图7A至图7D所示，经柠檬苦素处理后，增殖指标CyclinD1、c-fos、PCNA表达逐渐升高。

综上所述，柠檬苦素具有明显的肾保护作用，可显著抑制IRI和顺铂引起的肾功能下降，减轻肾组织病理损伤，抑制肾小管上皮细胞凋亡，促进肾小管上皮细胞增殖，促进修复。因此，作为中药单体，柠檬苦素有望成为临床AKI患者的预防和治疗药物。