具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了雷公藤二醇在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物中的应用，雷公藤二醇的结构如下所示：

在一个具体的示例中，预防和/或治疗为：靶向预防和/或靶向治疗。

传统的雷公藤甲素及其它衍生物是利用其RNA聚合酶抑制剂的作用，抑制NLRP3mRNA的表达，即并非直接的、靶向的NLRP3抑制剂。而雷公藤二醇会直接与NLRP3结合，影响NLRP3与NEK7的结合，进而影响NLRP3炎症小体的形成，且雷公藤二醇对RNA聚合物无抑制作用。

更具体地，雷公藤二醇通过与NLRP3蛋白的C280残基结合，抑制NLRP3炎症小体的组装。

可以理解地，在本发明中，炎症性疾病包括但不限于：炎症性肠病、肺炎、非酒精性肝病、非酒精性脂肪肝炎、冠心病、心率衰竭、类风湿性关节炎、痛风、II型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、冷吡啉相关周期性综合征、胃癌、结直肠癌、肺癌或黑色素瘤。

在一个具体的示例中，雷公藤二醇的制备包括如下步骤：

将雷公藤甲素与催化剂混合，进行区域选择性开环反应；

雷公藤甲素的结构如下所示：

更具体地，催化剂选自LiBH₄·THF溶液与BF₃·Et₂O溶液中的至少一种。

更更具体地，催化剂为LiBH₄·THF溶液与BF₃·Et₂O溶液。

在一个具体的示例中，NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物的剂型为片剂。

在一个具体的示例中，NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物的剂型为胶囊剂。

在一个具体的示例中，NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物的剂型为颗粒剂。

在一个具体的示例中，NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物的剂型为丸剂。

在一个具体的示例中，NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物的剂型为口服液。

在一个具体的示例中，NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物的剂型为注射剂。

可以理解的是，雷公藤二醇可以与合适种类的辅料结合，制备成不同形态的药物(例如液态、半固体、固体)，相应形成不同的剂型，这些剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂。

以上，本发明实施例只是对“剂型”的种类进行举例说明，可以理解的是，这并非是对“剂型”的具体限制，除了本发明实施例举例的“片剂”、“胶囊剂、“颗粒剂”、“丸剂”、“口服液”、“注射剂”这几种剂型之外，还可以将其制备成其他合适的、药学上可以接受的药物剂型。

以下结合具体实施例对本发明的雷公藤二醇在制备NLRP3炎症小体抑制剂中的应用做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。

实施例1

本实施例提供一种雷公藤二醇的合成方法，具体如下：

将雷公藤甲素(27mg，0.07mmol)溶解于无水四氢呋喃(4mL)中，依次加入LiBH₄·THF溶液(2N，84μL，0.17mmol)和BF₃·Et₂O溶液(45μL，0.35mmol)，氩气保护下室温搅拌3h。反应结束后，加入稀盐酸淬灭反应并继续搅拌10min，加入二氯甲烷萃取3次，合并有机层，依次用碳酸氢钠饱和水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩经柱层析得到白色雷公藤二醇7mg，产率25.9％。

产物表征为：1H NMR(500MHz，CDCl3，δ)：4.73(m，2H)，3.85(d，J＝1.5Hz，1H)，3.83(d，J＝3.0Hz，1H)，3.55(d，J＝12.0Hz，1H)，3.44(dd，J＝3.0Hz，J＝1.0Hz，1H)，2.53(m，2H)，2.29(m，4H)，1.97(m，1H)，1.63(m，2H)，1.28(m，2H)，1.23(s，3H)，1.03(d，J＝7.0Hz，3H)，0.87(d，J＝7.0Hz，3H).13C NMR(125MHz，CDCl3，δ)：173.9，162.1，124.6，74.3，72.5，70.4，70.0，65.7，57.3，54.2，44.1，37.9，35.8，29.5，28.7，19.6，17.9，17.6，16.7，14.1.HRMS(m/z)[M+H]+cacld for C20H27O6，363.1808；found，363.1797.

实施例2生物实验

一、方法

1、动物和试剂

所有动物实验均通过澳门大学伦理审查并得到批准。C57BL/6J小鼠由澳门大学无特定病原体(SPF)动物中心提供。实验前1周，小鼠应在12小时的黑暗/光亮周期中适应环境，自由获得食物和水，温度控制在22.5±0.5℃之间。肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)从PeproTech购买。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白(FLA-BS)从InvivoGen购买。MCC950从Cayman Chemical购买。所有其他材料和试剂从Thermo Fisher Scientific和Sigma-Aldrich购买或另有说明。

2、细胞培养

AD-293细胞系购自Strategene(La Jolla，CA，USA)。AD-293细胞维持在补充有10％FBS的DMED高葡萄糖培养基中。含有NF-κB反应元件的AD-293稳定细胞系在1μg/ml嘌呤霉素的存在下维持。AD-293细胞在1μg/ml嘌呤霉素和40μg/ml潮霉素B金(InvivoGen)存在下持续过表达TLR4加NF-κB反应元件荧光素酶报告基因。

THP-1单核细胞维持在含有10％FBS、1％青霉素和链霉素以及50μM 2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中，并在3天前使用10nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)分化为巨噬细胞样细胞。

稳定表达His-procaspase-1的AD-293细胞在加有40μg/ml潮霉素B的高糖DMEM培养液中维持。所有细胞在37℃下用5％CO₂，超市环境下培养。

3、骨髓源性巨噬细胞的分离

从6-8周龄的C57BL/6J小鼠中分离骨髓来源的巨噬细胞，在DMEM培养基加10％热灭活FBS和10％L-929条件培养基中分化为成熟巨噬细胞，在37℃5％CO₂潮湿环境下培养。

4、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验

细胞释放到培养液中的乳酸脱氢酶通过上海碧云天生物科技有限公司的乳酸脱氢酶试剂盒测定。

5、分子克隆和转染

使用标准分子生物学方法，包括PCR、重叠延伸PCR、限制酶片段化和连接构建所有质粒。把不同基因的开放阅读框架扩增后插入pcDNA5/TO载体(Thermo FisherScientific)，NLRP3 C280A和C280S突变质粒是通过使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)产生。所有构建的质粒均通过DNA测序验证。

6、蛋白质印迹分析

细胞使用RIPA裂解液裂解，高速离心后含有蛋白的裂解物通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上进行蛋白质印迹分析。所使用的抗体具体信息如下：pol II(#sc-56767，Santa Cruz Biotechnology)，NLRP3(#ALX-804-819-C100，ENZO生命科学；#AG-20b-0014，AdipoGen)，MYD88(#4283，Cell Signaling Technology)、磷酸化p65(Ser536，#3033，CellSignaling Technology)，p65(#6959，Cell Signaling Technology)，RNA聚合酶II(PolII，#sc-56767，Santa Cruz Biotechnology)，TH1L(#3088，Cell Signaling Technology)，ASC(#ab180799，Abcam；#AG-25B-0006，AdipoGen)，NEK7(#ab 1335

14，Abcam)，MYC tag(#2276，Cell Signaling Technology)，HA标签(#ab9110，Abcam)，His标签(#ab9108，Abcam)，ASC(#AG-25B-0006，AdipoGen)，β-actin(#A5316，Sigma-Aldrich)。所有抗体均以1∶1000稀释度用于蛋白质印迹分析。

7、基于微珠的血清细胞因子水平测定

促炎细胞因子和趋化因子的水平基于与LEGENDplexTM微珠的免疫反应来测定。具体测定按照BioLegend公司的说明书操作。

8、实时定量PCR(qRT-PCR)

利用Trizol试剂(Invitrogen)提取组织总RNA，使用cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将提取的总RNA逆转录为cDNA。稀释50倍后的cDNA作为qRT-PCR的模板。根据试剂盒操作说明，采用SYBR Green荧光探针检测mRNA的表达水平。qRT-PCR所需引物如表1所示。

表1

9、免疫荧光

小鼠骨髓来源巨噬细胞经过处理后，采用4％多聚甲醛在室温固定30分钟后使用0.5％TritonX-100(PBS配制)通透15分钟。使用PBS-0.5％Tween 20洗3次，每次10分钟，在加入2％牛血清白蛋白的PBS-0.5％Tween 20中室温封闭1小时后加入1∶200稀释抗体在4℃孵育过夜。使用PBS-0.5％Tween 20洗3次，每次10分钟，加入1∶500稀释的荧光二抗，室温孵育1小时。使用PBS-0.5％Tween 20洗3次，每次10分钟，加入Hoechst染料，然后使用防褪色试剂封片，在荧光共聚焦显微镜下拍照。

10、免疫共沉淀

小鼠骨髓来源巨噬细胞经过处理后，在NT-2缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，1mM MgCl₂，0.05％Nonidet P-40和不含EDTA的cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche Scientific))混悬，反复冻融三次，15000rpm 4℃高速离心取上清。细胞蛋白裂解液加入NEK7抗体或NLRP3抗体，采用protein G磁珠进行免疫沉淀，然后用蛋白质印迹分析免疫共沉淀复合物中蛋白表达水平。

11、模拟结合研究

NLRP3的NACHT结构域基于NOD2蛋白(PDB：5IRN)模板，采用同源建模的方法构建。NLRP3与化合物3e的结合预测通过MOE软件计算分析得到。

12、野生型和C280A突变型NLRP3 NATCH结构域重组蛋白纯化

用于构建NLRP3重组蛋白的野生型和C280A突变NACHT域的编码区通过PCR的方法连接到pET28a质粒上，转染到大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Promega)，加入1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，在16℃下培养16小时。在裂解缓冲液(50mM Tris HCl、pH 8.0、300mMNaCl、20mM咪唑、1％Triton X-100、1mM DTT和1mM PMSF)中对细菌进行超声处理。使用含有50mM Tris HCl、pH 8.0、300mM NaCl、8M尿素和20mM咪唑的缓冲液从无法溶解的包涵体中回收重组蛋白，并用Ni-IDA树脂进行纯化。使用SDS-PAGE和考马斯蓝染色确定重组蛋白的纯度。

13、等温滴定量热测定

等温滴定量热测定在MicroCal-ITC微量热仪(Malvem Panalytical)上进行。野生型和C280A突变NACHT NLRP3的重组蛋白在含有10％甘油的PBS中透析。将化合物3e溶解在DMSO中。所有测量均在25℃下在含有5％DMSO的透析缓冲液中进行。等温滴定量热测定使用的滴定池中终浓度为7μM蛋白质和500μM 3e。采用GraphPad Prism 6.0和ORIGIN 2019软件分析热谱图。

14、药物亲和反应靶稳定性测定

药物亲和反应靶稳定性测定实验中，将分化的小鼠骨髓来源巨噬细胞以5×105细胞/ml的密度接种在10cm培养板中。细胞用100ng/ml脂多糖刺激4h后，与不同浓度的化合物3e或MCC950再孵育2小时。在完全蛋白酶抑制剂混合物存在下，在含有50mM Tris-HClpH7.4、150mM NaCl、2mM EDTA、1mM ATP和0.5％Igepal CA-630的裂解缓冲液中裂解细胞。离心后澄清的裂解物用链霉蛋白酶消化，并用免疫印迹分析。

15、脂多糖滴鼻诱导小鼠急性肺损伤模型

混合性别6-8周龄C57BL/6J小鼠采用3e治疗组(100，200，和500μg/kg体重，溶解于临床使用的辅料聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯，每日灌胃给药两次，间隔12小时)预保护5日，之后通过鼻内滴注脂多糖(LPS，无菌生理盐水配置LPS溶液10mg/ml，2mg/kg体重)，假手术组将给予同样体积无菌生理盐水。作为治疗对照组，假手术组给予相同体积的Solutol。连续给药7天，每日记录体重(图3)。LPS滴鼻后继续给药治疗三日。实验结束时，将所有小鼠用CO2麻醉并处死。将收集肺组织和血清供进行进一步分析。

16、脂多糖腹腔注射小鼠败血症休克

6-8周龄C57BL/6J小鼠腹腔注射脂多糖(35mg/kg体重)一次诱导败血症休克。化合物3e腹膜内注射给药(200mg/kg体重)，对照药物为地塞米松(Dexamethasone，5mg/Kg体重)。每日给药两次，间隔12小时。实验开始后密切观察小鼠死亡情况，绘制生存曲线。脂多糖注射72小时候为实验终点，CO2麻醉小鼠，处死。

17、肺组织苏木精-伊红染色

苏木精-伊红染色液购自南京建成生物工程研究所，按厂家提供方法染色。

18、免疫组织化学染色和免疫荧光染色

小鼠肺组织，经后固定、脱水、包埋、切片后，用0.05M柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)加热抗原修复，1％Triton X-100通透切片30min，10％马血清10％牛血清白蛋白育1h封闭非特异性的位点，按照1：200比例稀释抗体，4℃孵育过夜。然后与辣根过氧化物酶或荧光探针标记的二抗反应，采用DAB过氧化物酶底物试剂盒显色或Leica TCS SP8激光共聚焦观察荧光染色的组织切片。

19、统计分析

将不会排除任何动物的数据进行分析。获得的所有数据将以平均值±SEM表示。所有实验将重复至少两次或多次。组间的测量变量差异将通过GraphPad Prism 5.0软件使用单向或双向ANOVA方法分析。当p＜0.05时，可认为结果显著差异，具有统计学意义。

二、结果

图中：DMSO为二甲基亚砜；3a、3c、3g均为雷公藤甲素衍生物，具体结构式如下所示；3e为雷公藤二醇；1为雷公藤甲素。

1、图1显示了雷公藤二醇对THP-1细胞中不同免疫信号通路蛋白和RNA聚合酶II的作用。

图1(A)为PMA分化的THP-1细胞经化合物DMSO、3a、3c、3e、3g与1单独或与脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)共处理，通过免疫印迹方法分析细胞内NLRP3、ASC、MYD88、磷酸化p65(p-p65)、p65、β-actin表达水平。

图1(B)为PMA分化的THP-1细胞经化合物DMSO、3a、3c、3e、3g与1单独或与LPS共处理，通过免疫印迹方法分析细胞内Pol II、TH1L与β-actin表达水平。

图1(C)为PMA分化的THP-1细胞经雷公藤二醇单独或与LPS共同处理后细胞培养液上清中IL-1β含量。

图1(D)为PMA分化的THP-1细胞经雷公藤二醇单独或与LPS共同处理后细胞中IL-1β mRNA相对18S rRNA表达水平。

图1(E)为PMA分化的THP-1细胞经雷公藤二醇单独或与LPS共同处理后细胞中NLRP3 mRNA相对18S rRNA表达水平。

结果显示雷公藤二醇可以通过抑制NLRP3炎症小体有效调控Toll样受体(TLR)4配体LPS激活的天免疫反应降低LPS诱导产生的NLRP3和磷酸化p65(图1A)，且对雷公藤甲素的分子靶标RNA聚合酶II(Pol II)和翻译延伸因子TH1L无影响(图1B)。雷公藤二醇显著LPS诱导产生的IL-1β表达(图1C)和mRNA水平(图1D)，但对NLRP3 mRNA水平无影响(图1E)。

2、图2显示了雷公藤二醇对小鼠骨髓来源原代巨噬细胞中NLRP3炎症小体的作用。

图2(A)为雷公藤二醇和MCC950分别对LPS和三磷酸腺苷(ATP)刺激小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞乳酸脱氢酶释放的作用。

图2(B)为雷公藤二醇和MCC950分别对LPS和尼日利亚菌素(Nig)刺激小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞乳酸脱氢酶释放的作用。

图2(C)为雷公藤二醇和MCC950分别对LPS和三磷酸腺苷(ATP)刺激小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞后释放到细胞培养液中的I1-1β含量的作用。

图2(D)为雷公藤二醇和MCC950分别对LPS和尼日利亚菌素(Nig)刺激小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞后释放到细胞培养液中的I1-1β含量的作用。

图2(E)为雷公藤二醇和MCC950对LPS和ATP处理的小鼠骨髓来源原代巨噬细胞中pro-caspase 1、caspase 1、NLRP3、ASC、NEK7和β-actin表达水平的影响。

图2(F)为雷公藤二醇和MCC950对LPS和Nig处理的小鼠骨髓来源原代巨噬细胞中pro-caspase 1、caspase 1、NLRP3、NEK7、ASC、磷酸化p65(p-p65)、p65和β-actin表达水平的影响。

图2(G)为通过免疫荧光染色分析在雷公藤二醇和MCC950作用下，LPS和APT在小鼠骨髓来源原代巨噬细胞激活的NLRP3和ASC共定位。

在小鼠骨髓来源原代巨噬细胞中，雷公藤二醇单独或与脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)，或与尼日利亚菌素(Nig)联合使用，对NLRP3乳酸脱氢酶释放(图2A-B)，释放到细胞培养液中的Il-1β(图2C-D)，pro-caspase 1裂解激活(图2E-F)，和NLRP3炎症小体形成(图2F)均起到显著抑制作用。

3、图3显示了雷公藤二醇与NLRP3蛋白中NACHT结构域中的Cys280残基特异性结合结果。

图3(A)为NLRP3与雷公藤二醇的模拟结合图。

图3(B)为AD-293细胞中分别顺势转染表达野生型、C280S和C280A突变型NLRP3和ASC与pro-caspase 1转染48小时后加入DMSO或雷公藤二醇处理2小时，通过免疫印迹方法分析细胞内MYC-NLRP3、HA-ASC、His-pro-caspase1和β-actin表达水平。

图3(C)为图3(B)图中procaspase 1相对表达水平。

图3(D)为等温滴定量热法分析雷公藤二醇与野生型NLRP3 NACHT结构域蛋白的直接结合。

图3(E)为等温滴定量热法分析雷公藤二醇与C280A突变型NLRP3 NACHT结构域蛋白的直接结合。

图3(F)为雷公藤二醇与野生型NLRP3 NACHT结构域蛋白结合常数，以及雷公藤二醇与C280A突变型NLRP3 NACHT结构域蛋白结合常数。

图3(G)为通过药物亲和反应靶蛋白稳定性实验检测雷公藤二醇和MCC950分别与NLRP3、NEK7和β-actin的结合。

通过分子对接模拟发现，雷公藤二醇可以直接与NLRP3 NACHT结构域Cys280氨基酸残基结合(图3A)。在AD-293细胞中顺势转染表达野生型、C280S和C280A突变型NLRP3，同时共转ASC和pro-caspase 1，经过免疫印迹发现雷公藤二醇(3e)仅可以有效的抑制野生型NLRP3表达下产生的pro-caspase 1裂解(图3B-C)。C280S和C280A突变型NLRP3本身不能促进pro-caspase 1裂解，加入雷公藤二醇(3e)后pro-caspase 1裂解反而增加(图3B-C)。通过等温滴定量热法分析结果发现雷公藤二醇(3e)与野生型NLRP3(图3D-F)结合的远远高于与C280A突变型NLRP3结合(图3D-F)。药物亲和反应靶蛋白稳定性实验检测雷公藤二醇(3e)和MCC950与NLRP3，NEK7，和β-actin的结合实验发现雷公藤二醇(3e)和MCC950均能有效保护链霉蛋白酶(Pronase)对NLRP3的降解作用，而不能保护链霉蛋白酶(Pronase)对NEK7和β-actin的降解作用(图3G)。

4、图4为雷公藤二醇对NLRP3与NEK7、ASC结合的影响。

小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞经雷公藤二醇预处理1小时，再分别LPS和尼日利亚菌素(Nig)联合刺激2小时后，收集细胞。

图4(A)表示使用NEK7抗体通过免疫共沉淀方法分析细胞中NLRP3和NEK7的结合。

图4(B)表示使用NLRP3抗体通过免疫共沉淀方法分析细胞中NLRP3和ASC结合。

在LPS和尼日利亚菌素(Nig)刺激小鼠骨髓来源原代巨噬细胞中，分别采用NEK7和NLRP3抗体进行免疫共沉淀，发现雷公藤二醇(3e)有效的减少了NEK7与NLRP3的结合(图4A)，和NLRP3与NEK7或ASC的结合(图4B)。

5、图5表示雷公藤二醇对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白(FLA-BS)和聚(脱氧腺苷酸-脱氧胸苷酸)钠盐(poly dA：dT)刺激小鼠骨髓来源原代巨噬细胞后细胞培养液中促炎细胞因子的含量的影响。

雷公藤二醇对FLA-BS刺激下细胞培养液中(A)Il-1β，(B)Tnf-α，和(C)Il-6含量。雷公藤二醇对poly dAdT刺激下细胞培养液中(D)Il-1β，(E)Tnf-α，和(F)Il-6含量。

由于不同点头样受体蛋白结构和序列高度相似，为了验证雷公藤二醇对NLRP3是否为特异性抑制，我们采用革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白(FLA-BS)和聚(脱氧腺苷酸-脱氧胸苷酸)钠盐(poly dA：dT)分别激活小鼠骨髓来源原代巨噬细胞激活NLRC4和AIM2这两种域NLRP3结构相似的点头样受体。雷公藤二醇对NLRC4和AIM2激活产生的包括Il-β，Tnf-α，Il-6下游促炎细胞因子水平没有影响(图5)。

6、图6表示雷公藤二醇对LPS诱导急性肺损伤的保护作用。

雷公藤二醇预保护五日之后与LPS一同给药，腹腔注射给药(每日两次)，LPS滴鼻刺激四天(0.4毫克/千克，每日两次)。

图6(A)为小鼠肺组织苏木精伊红染色和F4/80免疫组化染色结果。

图6(B)为小鼠肺组织Nlrp3和Asc免疫组化染色结果。

图6(C)为小鼠肺组织Nlrp3和Asc免疫荧光共定位，Hoechest着色色为细胞核。

图6(D)为小鼠血清中Il-1β含量。

图6(E)为小鼠肺组织中Il-1β相对18S rRNA含量。(**，p＜0.05；***，p＜0.01)。

预先口服雷公藤二醇后使用LPS滴鼻诱导小鼠急性肺损伤，发现雷公藤二醇可以剂量依赖地减轻LPS起的肺部损伤和巨噬细胞浸润(图6A)。NLRP3和ASC在肺组织表达(图6B)和结合(图6C)也在雷公藤二醇作用下剂量依赖性显著降低。小鼠血清和肺组织中Il-β的含量也在雷公藤二醇的作用下恢复到假手术组水平(图6D-E)。

7、图7为雷公藤二醇对LPS诱导的感染性休克致死保护作用。

雷公藤二醇预保护6小时，腹腔注射给药(200微克/千克，每日两次)，地塞米松(DEXA，1毫克/千克)与雷公藤二醇给药时间相同，LPS腹腔注射(35毫克/千克，一次)LPS注射后开始记录小鼠死亡时间。雷公藤二醇给药组和地塞米松给药组小鼠死亡率与LPS诱导感染性休克至死p值在图上标注。

采用大剂量LPS构建小鼠感染性休克模型，雷公藤二醇与地塞米松(DEXA)在每日给药两次情况下均可以显著得保护脂多糖诱导的小鼠感染性休克致死(图7)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 深圳艾克斯恩生物科技有限公司

澳门大学

<120> 雷公藤二醇在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体介导的炎症性疾病药物中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagcccatc ctctgtgact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctctgcttgt gaggtgctga 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcaagaga cttccatcca g 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtggtatag acaggtctgt tgg 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacgtggaac tggcagaaga g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggtggttt gtgagtgtga g 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgatggctt attacagtgg caa 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcggagatt cgtagctgga 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgtgagtccc attaagatgg agt 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccgacagtg gatatagaac aga 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggctcagcca gatgcagtta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctgctggtg atcctcttgt 20