3-吲哚乙腈在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用
阅读说明：本技术 3-吲哚乙腈在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用 (Application of 3-indole acetonitrile in preparing medicine for inhibiting novel coronavirus SARS-CoV-2 ) 是由 金梅林 回显锋 杨丽 黄坤 张宇飞 赵雪锦 盛锋 张强 孙小美 钟鸣 杨欢欢 于 2021-03-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物制剂领域,具体涉及3-吲哚乙腈在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。本发明首次发现3-吲哚乙腈在细胞和动物水平均能对新型冠状病毒起抑制作用,并且能缓解机体由于新型冠状病毒感染导致的不良症状,3-吲哚乙腈在小鼠SARS-CoV-2感染模型中有效果,可以显著降低小鼠肺组织中的病毒含量,降低小鼠体重下降程度,提高小鼠的存活率,这使得3-吲哚乙腈具有非常大的临床治疗潜力。(The invention belongs to the field of biological preparations, and particularly relates to application of 3-indole acetonitrile in preparation of a medicine for inhibiting novel coronavirus SARS-CoV-2. The invention discovers for the first time that 3-indole acetonitrile can inhibit novel coronavirus at cell and animal levels and relieve adverse symptoms of organisms caused by infection of the novel coronavirus, and the 3-indole acetonitrile has an effect in a mouse SARS-CoV-2infection model, so that the virus content in lung tissues of mice can be obviously reduced, the weight reduction degree of the mice is reduced, the survival rate of the mice is improved, and the 3-indole acetonitrile has great clinical treatment potential.)
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体涉及3-吲哚乙腈在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。
背景技术
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 19,COVID-19)严重危害人类健康和公共卫生安全，给世界社会和经济带来巨大负担。许多国内外学者推测新冠病毒或将类似于流感病毒，与人类长期共存。但是，迄今为止，还没有公认有效的新冠肺炎治疗方法或抗SARS-CoV-2病毒的的方法，因此，研究并开发新型抗SARS-CoV-2的制剂或药物具有重要意义。
截至目前，已有大量的在细胞水平对新冠病毒有抑制效果的药物出现，但目前在临床上依然无有效的治疗药物，有些药物虽然在使用，但无效。Pauline Maisonnasse等(2020，Hydroxychloroquine use against SARS-CoV-2infection in non-humanprimates，nature)发表在nature上的研究表明，根据之前的大量研究证实羟氯喹(HCQ)具有广泛的抗病毒效果，因此在很多抗SARS-CoV-2药物筛选的项目中都包含了HCQ，在体外评估羟氯喹(HCQ)抗病毒效果时，证明其在体外确实具有抗SARS-CoV-2的功效；结合已有的文献报道HCQ可以作为免疫调节剂，狼疮患者使用HCQ能够降低炎症性细胞因子的水平，而在治疗COVID-19患者时也存在细胞因子风暴问题；基于这些特性，HCQ被认为能够用于治疗COVID-19，并且已在全球范围内被用于数千名感染SARS-CoV-2而导致COVID-19的患者，但是，到目前为止却没有明确数据表明HCQ对治疗COVID-19有效。因此，Pauline Maisonnasse等人建立了非人类灵长类(NHP)动物感染SARS-CoV-2的模型，该模型可以用于人类感染SARS-CoV-2早期阶段的分析评价，在体内评估了非人类灵长类动物模型食蟹猴感染SARS-CoV-2后，HCQ的抗病毒效果和治疗作用，同时也进行了体外抗SARS-CoV-2的评估，结果显示，HCQ在VERO E6细胞中显示了抗SARS-CoV-2病毒活性，但在重建的人气道上皮模型中没有抗SARS-CoV-2的作用；在食蟹猴动物模型中，和安慰剂相比较，食蟹猴感染SARS-CoV-2后，无论是在感染的早期阶段还是中晚期阶段，单独使用HCQ或和阿奇霉素连用，对组织中病毒载量均没有显著性影响，也没有明显的临床使用效果；并且，在SARS-CoV-2感染前，HCQ作为预防使用也无法提供抗SARS-CoV-2感染的保护作用。
2020年，WHO宣布启动一项名为团结试验的全球性临床试验，选着了当时4种最有可能降低新冠死亡率的药物，分别是瑞德西韦、羟氯喹、洛匹那韦和干扰素β1a，经过近一年的试验，全球30多个国家的400多家医院及1万多名患者参与，但试验结果并不理想，因为没有证据表明羟氯喹、洛匹那韦能够降低死亡率，世卫组织分别在6月和8月停止了这2种药物的试验。瑞德西韦(Remdesivir GS-5734)在新冠爆发早期就被认为是抗SARS-CoV-2的有效药物，然而经过一年多的验证，其作用效果目前仍然还处于争论中。2020年10月15日，世卫组织宣布瑞德西韦不能显著降低新冠病毒的死亡率和改善患者的治疗过程，建议不要使用瑞德西韦治疗新冠肺炎住院患者，但在10月22日，瑞德西韦的研发公司，美国吉利德科学公司公告称，瑞德西韦可以将新冠肺炎住院患者的住院时间缩短5天，成为首个美国获FDA批准的新冠治疗药物。中国在新冠爆发最严重时期也在武汉的包括金银潭医院在内的10家医院进了了瑞德西韦的随机双盲多中心临床试验，结果发现，瑞德西韦对临床病程的整体时间和存活率改善上无差异，相关数据发表在著名杂志柳叶刀上(WangYemingetal.Remdesivir in adults with severe COVID-19:a randomised,double-blind,placebo-controlled,multicentre trial[J].Lancet,2020,2020 05 16,39510236(10236))。这些结果表明，对于新型冠状病毒这种新发性传染病原，其致病机理和治疗策略目前都不是很明确，寻找抗病毒有效药物并非易事。
3-吲哚乙腈(3-Indoleacetonitrile)是吲哚类化合物，E.R.H.JONES等于1952年分离发现于卷心菜叶，并证明其结构是植物生长激素，系从高等植物组织中以结晶形态得到的第一个植物生长素，缩写IAN。十字花科植物的中性植物生长激素大多为3-吲哚乙腈，美国肿瘤学会推荐多食用十字花科蔬菜(包括菜花、甘蓝、包心菜、大白菜和萝卜等)以降低肿瘤发生率。其中3-取代吲哚类化合物及异硫氰酸酯类被认为是十字花科蔬菜中两类以糖甙形式存在的主要抑癌成分。3-取代吲哚类化合物主要包括：吲哚-3-甲醇(Indole-3-carbinol，I3C)；3,3'-二吲哚甲烷(3,3'-Diindolylmethane，DIM)及3-吲哚乙腈(3-Indoleacetonitrile，IDA)。
有研究表明，吲哚类化合物可以有效抑制大肠杆菌等细菌性病原菌，吲哚及其衍生物被视为抗生素耐药病原体的潜在抵抗化合物，但目前，尚未发现任何关于3-吲哚乙腈抗SARS-CoV-2病毒的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供了一种小分子化合物3-吲哚乙腈(3-Indoleacetonitrile)在制备治疗或预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染药物中的应用，从而为临床上SARS-CoV-2的治疗提供一种有效的小分子化合物。3-吲哚乙腈分子式为C10H8N2，分子量为156.18，结构式如下：
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
3-吲哚乙腈在制备治疗或预防SARS-CoV-2感染药物中的应用，所述的应用包括：
3-吲哚乙腈在制备抑制SARS-CoV-2药物中的应用；
3-吲哚乙腈在制备治疗或预防SARS-CoV-2感染的药物中的应用；
3-吲哚乙腈在制备缓解SARS-CoV-2感染后体重降低的药物中的应用；
3-吲哚乙腈在制备提升SARS-CoV-2感染后机体存活率的药物中的应用；
3-吲哚乙腈在制备降低SARS-CoV-2感染后机体肺部病毒含量的药物中的应用。
3-吲哚乙腈在制备治疗或预防小鼠SARS-CoV-2感染的药物中的应用；
3-吲哚乙腈在制备提高治疗小鼠SARS-CoV-2感染存活率的药物中的应用；
3-吲哚乙腈在制备缓解小鼠SARS-CoV-2感染后体重降低的药物中的应用；
或3-吲哚乙腈在制备降低小鼠SARS-CoV-2感染后机体肺部病毒含量的药物中的应用。
以上所述的应用中，优选的，所述的小鼠SARS-CoV-2感染中的SARS-CoV-2为新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，保藏编号为CCTCC NO：V202031。
与现有技术相比，本发明优点如下：
1、3-吲哚乙腈是小分子化合物，对Caco-2细胞的毒性作用小，在体外细胞水平能够显著抑制SARS-CoV-2对Caco-2细胞的感染，抑制其在细胞中的增殖，说明其具有安全高效的特点。
2、3-吲哚乙腈在小鼠SARS-CoV-2感染模型中有效果，可以显著降低小鼠肺组织中的病毒含量，降低小鼠体重下降程度，提高小鼠的存活率，这使得3-吲哚乙腈具有非常大的临床治疗潜力。
附图说明
图1为3-吲哚乙腈对Caco-2细胞的细胞毒性示意图。
图2为3-吲哚乙腈细胞水平抗SARS-CoV-2的Western Blot检测效果示意图；
其中上图为WB显示不同浓度3-吲哚乙腈在细胞水平对SARS-CoV-2增殖的影响，条带越弱表明病毒含量越低，GADPH为细胞内参对照，泳道从左至右分别表示3-吲哚乙腈工作浓度为0μM、75μM、150μM、300μM；
下图为SARS-CoV-2核蛋白(NP)条带灰度值和细胞内参(GADPH)条带灰度值的比值，比值越小表明病毒含量越低，横坐标值从左至右分别表示3-吲哚乙腈工作浓度为0μM、75μM、150μM、300μM。
图3为3-吲哚乙腈细胞水平抗SARS-CoV-2的空斑检测效果示意图。
图4为3-吲哚乙腈对SARS-CoV-2病毒感染小鼠体重的影响示意图；
其中虚线表示未感染SARS-CoV-2病毒PBS组和3-吲哚乙腈组。
图5为3-吲哚乙腈对SARS-CoV-2病毒感染小鼠存活率的影响示意图。
其中未感染新冠病毒PBS组和3-吲哚乙腈组小鼠没有死亡，存活率为100％，线条重合在一起。
图6为3-吲哚乙腈对SARS-CoV-2病毒感染小鼠肺脏组织病毒载量的影响示意图。
图7为3-吲哚乙腈对SARS-CoV-2病毒感染小鼠肺脏组织病理变化的影响。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。本发明实施例中的试验方法和条件如无特殊说明，均为常规方法。本发明所述的技术方案，如无特殊说明，均为领域的常规方案；所述试剂或材料如无特殊说明，均来源于商业渠道。本发明中所有与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)活病毒相关的试验均在生物安全三级实验室(ABSL3)完成。
目前，抗病毒药物评价模型主要分为体外模型(in vitro model)和体内模型(invivo model)。
体外模型主要使用各种细胞系对药物进行评价，其优点在于可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物毒性、有效浓度等，为后期机理研究提供更多基础。体内模型一般使用各种模式动物感染模型，通过药物处理后的各种表型指标来衡量药物在活体动物内的整体效果。其优点是可对候选药物在活体内的效果进行真实、系统的评价。本发明采用人结肠癌细胞系Caco-2对3-吲哚乙腈的体外抗SARS-CoV-2效果进行测定；采用小鼠适应性毒株WBP-1感染模型，对3-吲哚乙腈的体内抗SARS-CoV-2效果进行评价。
实验材料：
(1)实验所需细胞系、实验动物及病毒
细胞系：Caco-2细胞为华中农业大学实验室保存；
实验动物：SPF级6周龄Balb/c小鼠，购自三峡大学实验动物中心；
毒株：新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，保藏编号为CCTCC NO：V202031，CN111961653A，在本发明中，将该病毒简称为新型冠状病毒WBP-1或小鼠适应性毒株WBP-1；
(2)实验所需药物
3-吲哚乙腈购自Sigma公司。
(3)实验所需试剂：
DMEM培养基，胎牛血清(FBS)均购自于GIBCO公司；
细胞活性检测试剂盒：TransDetect Cell Counting Kit(CCK)购于北京全式金生物。
实施例1：
3-吲哚乙腈对细胞的毒性试验
本发明中使用Caco-2细胞，接种96孔板，待细胞密度达80％，用3-吲哚乙腈(终浓度为：0μM、3.5μM、7μM、17.5μM、35μM、70μM、175μM、350μM、700μM)孵育细胞48小时。使用TransDetect细胞计数盒测定细胞活性，按试剂盒说明书进行操作，测定OD450nm处的吸光度。具体实施过程如下：
1、细胞培养
取冻存复苏后的Caco-2细胞经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)的DMEM培养基扩大培养。
2、3-吲哚乙腈对细胞的毒性试验
取生长良好的Caco-2细胞进行消化传代，用细胞生长液(DMEM培养基+10％胎牛血清+双抗)调整细胞密度为2×106/ml，接种96孔板，每孔接种100μl；每孔再加入100μl用培养液(DMEM培养基+10％血清+双抗)配制的3-吲哚乙腈药物，混匀。药物设定6个浓度梯度，每个梯度浓度设3个复孔，其终浓度分别为0μM、3.5μM、7μM、17.5μM、35μM、70μM、175μM、350μM、700μM。同时设置细胞对照，放置于37℃，5％CO2培养箱培养。培养48h后，使用TransDetect细胞计数盒测定细胞活性，向处理培养后的96孔板细胞中加入含有CCK试剂10μl，37℃避光孵育2h，酶标仪检测OD450nm读数，计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝药物处理组OD450nm/未处理对照组OD450nm*100％
试验结果：
结果如图1，测定细胞存活率能反应3-吲哚乙腈对Caco-2细胞的毒性作用，从图中可以看出，3-吲哚乙腈在350μM浓度下处理Caco-2细胞48h后，细胞活力与对照组相比维持在88％以上，说明3-吲哚乙腈在此浓度下对细胞毒性较低。
实施例2：
3-吲哚乙腈在细胞水平对新型冠状病毒的抑制作用：
采用Western Blot以及噬斑形成单位(plaque forming unit)检测3-吲哚乙腈在细胞水平对SARS-COV-2病毒(WBP-1)增殖的影响，具体步骤如下：
1、3-吲哚乙腈处理细胞并感染新冠病毒WBP-1
1)将生长状态良好的Caco-2细胞进行消化传代，用细胞培养基调整细胞密度为1×105/ml，每孔1ml接种于12孔板长至单层。
2)添加不同含量的3-吲哚乙腈，3-吲哚乙腈作用终浓度分别为0μM、75μM、150μM、300μM，0μM工作浓度即为无药物对照。
3)不同浓度3-吲哚乙腈处理24h后感染新冠病毒，病毒(MOI为1)孵育细胞1h，弃去病毒液，用上述含有不同浓度3-吲哚乙腈的DMEM细胞维持液继续培养细胞。
4)感染病毒后24h收集上清液以及细胞裂解液，Western Blot检测裂解液中SARS-COV-2病毒NP蛋白，空斑实验检测上清中的病毒滴度。
2、Western Blot检测3-吲哚乙腈作用下SARS-COV-2在细胞上的增殖
感染新冠病毒后的细胞裂解液采用Western Blotting实验检测3-吲哚乙腈对新冠病毒增殖的影响，具体步骤如下：
1)将上述收集的病毒感染细胞裂解液，加5x蛋白loading，沸水煮10min，短暂离心待用。
2)SDS-PAGE电泳：配制分离胶为10％的聚酰胺凝胶，点样电泳，浓缩胶恒压80V，30min，分离胶恒压120V，1-1.5h。
3)转膜：转膜时，提前将转膜液预冷，将电泳完成的PAGE胶放入转膜槽，恒压100V转膜1h。
4)封闭：转膜完成后取出NC膜用封闭液封闭1h。
5)一抗二抗孵育完成后进行显色：采用Thermo的ECL显色试剂盒进行显色。
3、空斑实验测定新冠病毒增殖液中的病毒滴度
1)将生长状态良好的Caco-2细胞传代至12孔细胞培养板，3×105/ml～5×105/ml/孔，第二天长成致密单层。
2)在24孔板内用无血清DMEM培养基连续10倍稀释新冠病毒感染细胞后收集的细胞培养上清液，具体步骤如下：
(1)在每孔加900μl DMEM.
(2)加100μl步骤1，4)中的上清液至第一列孔内，即每孔内液体的总体积为1000μl，轻轻震荡混匀。
(3)用排枪从第一列取100μl至第二列，吹打并震荡混匀；更换枪头，从第二列取100μl至第三列，重复操作直到第六列。
3)吸去Caco-2细胞培养板中的培养基，加入500μl病毒稀释液；置于培养箱内37℃温育1h，吸去混合液，每孔加入1ml DMEM+2.5％FBS+0.9％甲基纤维素，置于培养箱内3天。
4)每孔加入1ml 8％formaldehyde-PBS，固定1h以上。
5)倒去固定液，用单蒸水清洗一遍。
6)加0.5％结晶紫染色10min，单蒸水清洗三遍后数噬斑。
试验结果：
结果如图2所示3-吲哚乙腈明显抑制了新冠病毒的复制。病毒感染后，300μM浓度的3-吲哚乙腈处理细胞液中病毒NP蛋白的灰度值显著低于不添加药物的对照组，并且从图2中可以得知，3-吲哚乙腈对新型冠状病毒的抑制效果呈剂量依赖性，随着药物浓度的增加，对病毒的抑制效果越好。另外，噬斑计数结果也表明，3-吲哚乙腈对新冠病毒的增殖有显著性抑制作用，且随着3-吲哚乙腈药量的增加，对新冠病毒增殖的抑制效果也会相应提高(表1和图3)。
表1不同浓度3-吲哚乙腈对SARS-CoV-2病毒增殖的影响
3-吲哚乙腈(μM)
SARS-CoV-2含量(PFU/ml)
0
2.07×10<sup>5</sup>
75
1.40×10<sup>5</sup>
150
7.83×10<sup>4</sup>
300
1.00×10<sup>4</sup>
实施例3：
3-吲哚乙腈在小鼠致死性感染模型中的抗病毒效果评价
小鼠实验步骤：
1)将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为2个大组，第一大组为不感染新冠病毒组，分别为对照组(PBS)(5只)、3-吲哚乙腈组(5只)；第二大组为感染SARS-CoV-2病毒组，分别为PBS+SARS-CoV-2感染组(10只)、3-吲哚乙腈+SARS-CoV-2感染组(10只)。
2)3-吲哚乙腈配制成4mg/mL水溶液，每只小鼠每次尾静脉注射PBS或3-吲哚乙腈溶液100μL。
3)感染SARS-CoV-2前2h，尾静脉注射3-吲哚乙腈(3-吲哚乙腈+SARS-CoV-2感染组)或PBS(PBS+SARS-CoV-2感染组)一次，后进行滴鼻感染5个半数致死量(5LD50)的新型冠状病毒鼠适应株SARS-CoV-2/WBP-1(CCTCC NO：V202031)，感染剂量50μl/只，小鼠感染新冠病毒后隔一天尾静脉注射一次药物(3-吲哚乙腈+SARS-CoV-2感染组)或PBS(PBS+SARS-CoV-2感染组)，共注射4次。并且在感染新冠病毒后每天观察并记录小鼠的体重和存活情况。
4)另将20只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为2组，分别为PBS感染组(10只)、3-吲哚乙腈感染组(10只)，感染前给药和感染操作同上，试验组感染新冠病毒后隔一天尾静脉注射一次3-吲哚乙腈，对照组感染新冠病毒后隔一天尾静脉注射一次PBS，共计2次，每次每只小鼠注射剂量为100μL，在感染SARS-CoV-2病毒后第5天解剖小鼠取肺部样品，采集的肺部组织样品剪成两半，一半肺部组织样品加入1ml无菌PBS(1mLPBS/肺)，匀浆仪匀浆破碎，取0.1mL匀浆液提取RNA，用于病毒载量检测；另一半肺部组织样品用组织固定液固定，做成组织病理切片，用于组织病理学分析。
5)根据统计结果，绘制出体重变化曲线、存活率曲线和组织病毒载量图。
试验结果：
小鼠体重变化结果如图4和表2所示，不感染病毒小鼠中，3-吲哚乙腈注射组小鼠体重和PBS组无明显差异，表明3-吲哚乙腈在动物体内毒性很低。感染SARS-CoV-2病毒小鼠中，小鼠给药后，PBS组小鼠平均体重下降程度在第3天时开始高于3-吲哚乙腈处理组，在感染后的第7天PBS组小鼠全部死亡，体重下降达到30％以上。然而，3-吲哚乙腈处理组小鼠在感染后第7天开始，体重下降变缓，第9天开始体重停止降低，到感染后第10天，体重开始回升。
表2 3-吲哚乙腈对SARS-CoV-2病毒感染小鼠体重的影响
小鼠存活率结果如图5和表3所示，病毒感染对照组小鼠在感染后第7天全部死亡，而3-吲哚乙腈处理组小鼠感染新冠后存活率为40％。
表3 3-吲哚乙腈对SARS-CoV-2病毒感染小鼠生存率的影响
肺脏组织病毒载量检测结果如图6所示：3-吲哚乙腈可显著降低机体感染新型冠状病毒SARS-CoV-2后的肺组织中的病毒含量。
小鼠感染SARS-CoV-2病毒后第5天，对照组小鼠肺中观察到严重的炎症细胞浸润，肺脏充血，而尾静脉注射吲哚-3-乙腈组的明显减弱(图7)，因此，尾静脉注射3-吲哚乙腈可以减轻感染新冠病毒小鼠的肺脏病理损害。
上述结果说明，3-吲哚乙腈在小鼠体内有明显的抗病毒效果。鉴于上述结果，3-吲哚乙腈可用于制备治疗SARS-CoV-2感染的药物。