低分子量硫酸软骨素在制备日化产品和外用制剂中的用途
阅读说明：本技术 低分子量硫酸软骨素在制备日化产品和外用制剂中的用途 (Use of low molecular weight chondroitin sulfate in preparation of daily chemical products and external preparations ) 是由 田志清 谭岸 朱水芳 丛浩龙 姜帆 朱松阳 于 2020-01-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及制药技术,具体涉及低分子量硫酸软骨素在制备日化产品或外用制剂中的用途。所述低分子量硫酸软骨素的分子量范围为500-15000,优选为1000-5000。所述低分子量硫酸软骨素在所述日化产品或外用制剂中的重量百分比含量为0.0001-99％,优选为0.001-5％。所述日化产品和外用制剂可有效缓解和预防皮肤或口腔粘膜炎症,改善相关红肿、瘙痒、疼痛等症状,促进人体皮肤痤疮消除,促进痘肌愈合,增强皮肤细胞活性,抗氧化或减少头发脱落。(The invention relates to a pharmaceutical technology, in particular to application of low molecular weight chondroitin sulfate in preparation of daily chemical products or external preparations. The molecular weight range of the low molecular weight chondroitin sulfate is 500-15000, and preferably 1000-5000. The content of the low molecular weight chondroitin sulfate in the daily chemical product or the external preparation is 0.0001-99% by weight, and preferably 0.001-5% by weight. The daily chemical product and the external preparation can effectively relieve and prevent skin or oral mucosa inflammation, improve related symptoms such as redness, itching, pain and the like, promote the elimination of acne on human skin, promote the healing of acne muscle, enhance the activity of skin cells, resist oxidation or reduce hair loss.)
本申请是以申请号2020100679111,发明名称“低分子量硫酸软骨素在制备日化产品和外用制剂中的用途”的发明申请为母案提交的分案申请，享有与母案相同的优先权。
技术领域
本发明涉及制药技术，具体涉及低分子量硫酸软骨素在制备日化产品和外用制剂中的用途。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是一种主要以β(1-3)连接N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)和葡糖醛酸(GlcA)的重复二糖单元构成的多糖。目前商品化的软骨素主要提取于猪、牛、鸡、鸭、鲨鱼、鲟鱼等动物的软骨组织中。硫酸软骨素被认为具有缓解骨关节炎、降血脂血糖、抗癌转移、促细胞生长、促皮肤愈合等多种药理活性。目前，硫酸软骨素应用于日用化妆品中主要是为了补水保湿且是未经低分子化处理的普通硫酸软骨素，分子量较大，约20k-100k之间。在药用制剂方面，现有技术中，硫酸软骨素被用于降低血脂、预防关节炎等，或者作为外用滴眼液用于治疗角膜炎。
目前尚未发现有低分子量硫酸软骨素在日化产品或外用制剂中的应用。
发明内容
一方面，本发明提供低分子量硫酸软骨素在制备日化产品或外用制剂中的用途。
所述低分子量硫酸软骨素的分子量范围为500-15000，500-14000，500-13000，500-12000，500-11000，500-10000，500-9000，500-8000，500-7000，500-6000，1000-6000，1500-6000或2000-5000。
所述低分子量硫酸软骨素在所述日化产品或外用制剂中的重量百分比含量为0.0001-99％，0.0001-90％，0.0001-80％，0.0001-70％，0.0001-60％，0.0001-50％，0.0001-40％，0.0001-30％，0.0001-20％，0.0001-10％，0.0001-9％，0.0001-8％，0.0001-7％，0.0001-6％或0.0001-5％。
在优选实施例中，所述低分子量硫酸软骨素在所述日化产品或外用制剂中的重量百分比含量为0.001-5％，0.01-5％，0.1-5％或1-5％。
所述低分子量硫酸软骨素可通过降解普通硫酸软骨素制得，降解方式主要有酸水解、酶解以及催化氧化法等。
所述硫酸软骨素提取于猪、牛、鸡、鸭、鲨鱼、鲟鱼等动物的软骨组织。
在日化产品的制备中，所述低分子量硫酸软骨素用于制备洗发产品、护发产品、护肤霜、漱口水、洗手液、沐浴产品、乳液、面膜或其他日化产品形式。
在外用制剂的制备中，所述低分子量硫酸软骨素用于制备成喷雾剂、软膏、乳膏或其他外用制剂形式。
所述低分子量硫酸软骨素在制备外用制剂和日化品中的给药方式为皮肤给药。
另一方面，本发明提供一种日化产品或外用制剂，其特征在于：包含低分子量硫酸软骨素。
所述低分子量硫酸软骨素的分子量范围为500-15000，500-14000，500-13000，500-12000，500-11000，500-10000，500-9000，500-8000，500-7000，500-6000，1000-6000，1500-6000或2000-5000。
在优选实施例中，所述低分子量硫酸软骨素的分子量范围为1000-5000，1000-4000，1000-3000或者1000-2000。
所述低分子量硫酸软骨素在所述日化产品或外用制剂中的重量百分比含量为0.0001-99％，0.0001-90％，0.0001-80％，0.0001-70％，0.0001-60％，0.0001-50％，0.0001-40％，0.0001-30％，0.0001-20％，0.0001-10％，0.0001-9％，0.0001-8％，0.0001-7％，0.0001-6％或0.0001-5％。
在优选实施例中，所述低分子量硫酸软骨素在所述日化产品或外用制剂中的重量百分比含量为0.001-5％，0.01-5％，0.1-5％或1-5％。
所述日化产品包括洗发产品(例如，洗发水)、护发产品(例如，护发素)、护肤霜、漱口水、洗手液、沐浴产品(例如，沐浴露)、乳液和面膜；所述外用制剂的剂型包括喷雾剂、软膏、乳膏、凝胶和溶液。所述日化产品或外用制剂用于施加在受试者的皮肤表面或用于漱口。
所述凝胶的配方中，如下：按重量百分比计，卡波姆0.7％，甘油5％，丙二醇5％，苯氧乙醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素0.01-2％或1％，余量为去离子水。
所述喷雾的配方如下：按重量百分比计，透明质酸0.1％，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素0.1-5％或1.2％，余量为去离子水。
所述溶液的配方如下：按重量百分比计，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素0.1-2％或0.5％，余量为去离子水。
所述漱口水的配方如下：质量百分比浓度为0.5％的低分子量硫酸软骨素水溶液。
还在另一方面，本发明提供任一前述日化产品或外用制剂的制备方法，其特征在于：在日化产品或外用制剂中加入低分子量硫酸软骨素，所述低分子量硫酸软骨素的分子量范围为500-15000，500-14000，500-13000，500-12000，500-11000，500-10000，500-9000，500-8000，500-7000，500-6000，1000-6000，1500-6000或2000-5000。
在一些实施例中，所述低分子量硫酸软骨素的制备方法如下：将硫酸软骨素溶于水中，加入硫酸铜，加热至50℃，再加入过氧化氢溶液，50℃反应4h后，停止加热，使用截留分子量为500-15000的透析袋对反应液进行透析过夜，冻干溶液得到白色低分子量硫酸软骨素。
本发明提供了低分子量硫酸软骨素在制备日化清洁、消毒类产品、个人洗护、卫生用品、药用制剂和化妆产品等日化产品和外用制剂领域中的应用。所述日化产品和外用制剂尤其适用于缓解和预防皮肤或口腔粘膜炎症和改善相关红肿、瘙痒、疼痛等症状，或促进人体皮肤痤疮消除，促进痘肌愈合，或增强皮肤细胞活性，消除自由基抗氧化，或可用于减少头发脱落。
附图说明
图1.低分子量硫酸软骨素与普通硫酸软骨素的透皮渗透作用比较，其中，横坐标为渗透时间，纵坐标为渗透率，LCS：低分子量硫酸软骨素，CS：普通硫酸软骨素。
图2.低分子量硫酸软骨素抑制炎症因子TNF-α的作用(U937细胞实验)，其中，-LPS：无LPS刺激的细胞对照组，Control：LPS刺激后无药物处理的细胞对照组，DXMS：LPS刺激后使用地塞米松(终浓度0.6mg/ml)处理细胞的对照组，LCS：LPS刺激后使用低分子量硫酸软骨素(终浓度0.6mg/ml)处理细胞的实验组，CS：LPS刺激后使用普通硫酸软骨素处理细胞(终浓度0.6mg/ml)的实验组；纵坐标为TNF-α水平(ng/L)。
图3.低分子量硫酸软骨素抑制炎症因子TNF-α的作用(RAW 264.7细胞实验)，其中，-LPS，Control，DXMS，LCS，CS所代表的对象同图2；纵坐标为TNF-α水平(ng/L)。
图4.低分子量硫酸软骨素抑制白介素-6(IL-6)的作用(U937细胞实验)，其中，其中，-LPS，Control，DXMS，LCS，CS所代表的对象同图2；纵坐标为IL-6水平(ng/L)。
图5.低分子量硫酸软骨素抑制白介素-6(IL-6)的作用(RAW 264.7细胞实验)，其中，-LPS，Control，DXMS，LCS，CS所代表的对象同图2；纵坐标为IL-6水平(ng/L)。
图6.低分子量硫酸软骨素抑制白介素-8(IL-8)的作用(U937细胞实验)，其中，-LPS，Control，DXMS，LCS，CS所代表的对象同图2；纵坐标为IL-8水平(ng/L)。
图7.低分子量硫酸软骨素抑制白介素-1(IL-1)的作用(U937细胞实验)，其中，-LPS，Control，DXMS，LCS，CS所代表的对象同图2；纵坐标为IL-1水平(ng/L)。
图8.低分子量硫酸软骨素对HSF细胞活性的增强作用，其中，Control：培养基中未加低分子量硫酸软骨素或普通硫酸软骨素的对照组，LCS：培养基中加入了低分子量硫酸软骨素(终浓度为0.3mg/ml)的实验组，CS：培养基中加入了普通硫酸软骨素(终浓度为0.3mg/ml)的实验组；纵坐标为细胞存活率(％)。
图9.低分子量硫酸软骨素对Hacat细胞活性的增强作用，其中，Control，LCS，CS所代表的对象同图8；纵坐标为细胞存活率(％)。
图10.低分子量硫酸软骨素抗氧化的作用，其中，横坐标为培养基中低分子量硫酸软骨素和普通硫酸软骨素的终浓度(0.3mg/ml、0.6mg/ml、1.2mg/ml、2.4mg/ml)，纵坐标为活性氧水平，LCS：培养基中加入了低分子量硫酸软骨素的实验组，CS：培养基中加入了普通硫酸软骨素的实验组。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅用于解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
生物材料
人巨噬细胞U937细胞由中国科学院微生物研究所提供；小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7由中国检验检疫科学研究院提供；人永生化正常角质生成细胞Hacat购买自丰晖生物，产品编号CL0114；人永生化正常皮肤成纤维细胞HSF购买自丰晖生物，产品编号CL0159。上述生物材料本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
实验试剂
硫酸软骨素(CS，或称为“普通硫酸软骨素”)购买自湖南伍星生物科技有限公司，重均分子量为4.2万。
地塞米松(DXMS)为上市药物，是公认的抗炎药物，对于TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子具有很强的抑制作用，因此抗炎实验中将地塞米松设为对照。以下实验使用的地塞米松购买自Sigma公司。
DMEM培养基、1640培养基、FBS(胎牛血清)、胰酶均购买自LIFE TECH公司。
0.25％胰酶配方：100ml PBS溶液，0.25g胰酶。配制方法：先称取8gNaCl，2.9gNa2HPO4，0.2gKCl，0.2g KH2PO4，溶于蒸馏水中，定容至1L，得到PBS溶液；然后称取0.25g胰酶(胰蛋白酶)，加入100ml PBS溶液中，放入4℃冰箱中过夜；溶解后，冰浴中调节pH7.4，过滤除菌。
硫酸铜，过氧化氢溶液，卡波姆，甘油，丙二醇，苯氧乙醇，柠檬酸，透明质酸，己二醇均购自国药试剂。
下述实施例中，如无特殊说明，实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；如无特殊说明，实验方法均为本领域常规方法，可参考相关实验手册。
实施例1.低分子量硫酸软骨素的制备
采用催化氧化法制备低分子量硫酸软骨素的步骤如下：将硫酸软骨素溶于水中，加入硫酸铜(国药试剂)，加热至50℃，再加入过氧化氢溶液(国药试剂)，50℃恒温反应4h后，停止加热。使用截留分子量为500-15000的透析袋(上海源叶生物科技有限公司)对反应液进行透析过夜，冻干溶液得到白色低分子量硫酸软骨素。
实施例2.低分子量硫酸软骨素的生物活性鉴定
首先，制备低分子量硫酸软骨素，步骤如下：将0.5g硫酸软骨素溶于100ml水中，加入硫酸铜(国药试剂)0.032g(0.2mmol)，加热至50℃，再加入5ml过氧化氢30％溶液(国药试剂)。50℃恒温反应4h后，停止加热。使用截留分子量为1000的透析袋(上海源叶生物科技有限公司)对反应液进行透析过夜。冻干溶液得到白色低分子量硫酸软骨素0.2g。委托中国科学院金属研究所使用凝胶渗透色谱仪(岛津LC-20AT)和凝胶渗透色谱柱(Viscotek,A3000,Col 300*8.0mm)对获得的低分子量硫酸软骨素进行凝胶渗透色谱(GPC)测试，结果表明，制备得到的低分子量硫酸软骨素的重均分子量约为3600。
然后，通过以下实验来说明低分子量硫酸软骨素在皮肤吸收和渗透、抗炎、增强皮肤细胞活力、抑制活性氧产生等方面有着较好的生物活性，并且显著优于普通硫酸软骨素。
1.低分子量硫酸软骨素的透皮渗透作用
溶液配制：以生理盐水为溶剂，分别配制质量百分比浓度为0.3％的低分子量硫酸软骨素(LCS)溶液和普通硫酸软骨素(CS)溶液。
皮肤制备：从市场上购买的小猪，广西种，雄性，体重8-10kg，处死后，立即剃去胸部的毛，剥离皮肤，刮去皮下脂肪组织，洗净，得离体猪胸部皮肤，厚度0.8-1mm。
渗透实验方法：采用Franz扩散池法。将制备的离体猪胸部皮肤固定于扩散池之间，对扩散池进行37℃恒温水浴。待温度恒定后，取上述质量百分比浓度0.3％LCS溶液和0.3％CS溶液各1.5mL，分别加入Franz扩散池(上海玉研科学仪器有限公司，型号TT-6)的供应室中，以离体猪胸部皮肤(厚度0.8-1mm)为皮肤模型，以生理盐水(质量分数为0.9％的氯化钠溶液)为接受液，分别于2h、6h、12h时间点抽取接受池中的接受液，测定接受液中D-葡萄糖醛酸的浓度，计算累积透过量，渗透率＝累积透过量/剂量，考察两种分子量的硫酸软骨素的透皮渗透效果。
实验结果：如图1所示，可见低分子量硫酸软骨素的透皮吸收速度和累积透过量都有十分显著的提升。2h时，普通硫酸软骨素基本没有透皮，12h后也只有约20％的透过量。而低分子量硫酸软骨素2h时就有19％的透过量，12h后达到90％以上的透过量。
2.低分子量硫酸软骨素抑制炎症因子TNF-α的作用
通过LPS(Lipopolysaccharide，脂多糖)刺激的人巨噬细胞U937和小鼠单核巨噬细胞系RAW 264.7产生TNF-α的抑制来检测抗炎作用。
U937细胞实验方法：
(1)细胞复苏及准备：从液氮中取出冻存的U937细胞，迅速置于37℃，放置5min，800rpm离心5min，去上清，在10cm培养皿中加入10ml含有10％(v/v)FBS(LIFE TECH)的1640培养基(LIFE TECH)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。调整细胞状态至对数生长期。然后吸取细胞，800rpm离心收集细胞，重悬细胞后计数。以每孔10万个细胞分至24孔板。每个样品设置三个重复孔，培养三小时。
(2)LPS刺激细胞：每孔加入50微升PMA(肉豆蔻酰佛波醇乙酯，Sigma)至终浓度为20nM。置于37℃，5％CO2培养24小时。每孔加入LPS(脂多糖，Sigma)至终浓度为1微克每毫升，与细胞共孵育。
(3)药物处理：设置无LPS刺激的细胞对照组、LPS刺激后无药物处理的细胞对照组、LPS刺激后使用地塞米松处理细胞(以终浓度0.6mg/ml加入地塞米松至细胞培养孔中)的对照组、LPS刺激后使用低分子量硫酸软骨素处理细胞(以终浓度0.6mg/ml加入低分子量硫酸软骨素至细胞培养孔中)的实验组、LPS刺激后使用普通硫酸软骨素处理细胞(以终浓度0.6mg/ml加入普通硫酸软骨素至细胞培养孔中)的实验组。各对照组和实验组均培养24小时，然后吸取细胞及上清，4℃，800rpm离心8分钟。
(4)ELISA测试：将上清液转移至新管中，使用人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(江苏酶免，产品编号MM-0122H1)按照试剂盒说明书分析测定上清液中TNF-α含量。使用该试剂盒测定人TNF-a标准品(购买自江苏酶免公司)并绘制标准曲线，以标准曲线计算样品上清液中的TNF-a含量。计算标准偏差。依据计算数据作图(图2)。
RAW 264.7细胞实验方法：
(1)细胞复苏及准备：从液氮中取出冻存的RAW 264.7细胞，迅速置于37℃，放置5min，800rpm离心5min，去上清，在10cm培养皿中加入10ml含有10％(v/v)FBS(LIFE TECH)的DMEM培养基(LIFE TECH)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。调整细胞状态至对数生长期。0.25％胰酶消化细胞，用血清FBS中和后，800rpm离心收集细胞，重悬细胞后计数。以每孔5万个细胞分至24孔板。每个样品设置三个重复孔，培养24小时。
(2)LPS刺激细胞的方法同上。
(3)药物处理方法同上。
(4)将上清液转移至新管中，使用小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(江苏酶免，产品编号MM-0132M1)按照试剂盒说明书分析测定上清液中TNF-α含量。使用该试剂盒测定小鼠TNF-a标准品(购买自江苏酶免公司)并绘制标准曲线，以标准曲线计算样品上清液中的TNF-a含量。计算标准偏差。依据计算数据作图(图3)。
实验结果：U937细胞实验证明普通硫酸软骨素(CS)和低分子量硫酸软骨素(LCS)对于TNF-α都有抑制作用(与对照相比，p<0.001)，但是低分子量硫酸软骨素相比普通硫酸软骨素具有更高的增效抑制(p<0.001)，且值得注意的是，低分子量硫酸软骨素已接近地塞米松的抑制效果。RAW 264.7细胞实验得到类似的结果，低分子量硫酸软骨素对TNF-α有明显的抑制作用，并且显著优于普通硫酸软骨素(p<0.001)，仅略差于地塞米松。
3.低分子量硫酸软骨素抑制白介素-6(IL-6)的作用
通过LPS刺激的人巨噬细胞U937和小鼠单核巨噬细胞系RAW 264.7产生IL-6的抑制来检测抗炎作用。
实验方法：细胞复苏及准备方法、LPS刺激方法以及药物处理方法同上。ELISA测试中，人巨噬细胞U937的ELISA实验采用人白细胞介素6(IL-6)ELISA试剂盒(江苏酶免，产品编号MM-0049H1)，按照试剂盒说明书测定人IL-6的含量；RAW 264.7细胞的ELISA实验采用小鼠白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(江苏酶免，产品编号MM-0163M1)，按照试剂盒说明书测定小鼠IL-6的含量。
实验结果：如图4所示，U937细胞试验证明两种软骨素对于IL-6都具有较强的抑制作用。其中，低分子量硫酸软骨素的抑制作用甚至显著强于地塞米松(p<0.001)，而普通硫酸软骨素与地塞米松的作用相当。如图5，RAW 264.7细胞实验也同样证明低分子软骨素的抑制作用明显强于普通硫酸软骨素(p<0.001)。
4.低分子量硫酸软骨素抑制白介素-8(IL-8)的作用
通过LPS刺激的人巨噬细胞U937产生IL-8的抑制来检测抗炎作用。
实验方法：细胞复苏及准备方法、LPS刺激方法以及药物处理方法同上。ELISA实验采用人白细胞介素8(IL-8/CXCL8)ELISA试剂盒(江苏酶免，产品编号MM-1558H1)，按照试剂盒说明书测定人IL-8的含量。
实验结果：如图6，U937细胞试验证明低分子量硫酸软骨素对于IL-8有很好的抑制作用，与地塞米松的作用相当，并且显著优于普通硫酸软骨素(p<0.001)。可以看出，普通硫酸软骨素对IL-8几乎没有抑制作用。
5.低分子量硫酸软骨素抑制白介素-1(IL-1)的作用
通过对LPS刺激的人巨噬细胞U937产生IL-1的抑制来检测抗炎作用。
实验方法：细胞复苏及准备方法、LPS刺激方法以及药物处理方法同上。ELISA实验采用人白细胞介素1(IL-1)ELISA试剂盒(江苏酶免，产品编号MM-0179H1)，按照试剂盒说明书测定人IL-1的含量。
实验结果：如图7，U937细胞试验证明低分子量硫酸软骨素对于IL-1有显著的抑制作用，并且显著优于普通硫酸软骨素(p<0.001)。而普通硫酸软骨素对IL-1的抑制作用较弱。
6.低分子量硫酸软骨素增强皮肤细胞活力的作用
检测低分子量硫酸软骨素和普通硫酸软骨素对于人永生化正常角质生成细胞Hacat和人永生化正常皮肤成纤维细胞HSF的活力影响。
实验方法：在10cm培养皿中加入10ml含有10％(v/v)FBS(LIFE TECH)的DMEM培养基(LIFE TECH)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养细胞。调整细胞状态至对数生长期，0.25％胰酶37℃消化细胞。细胞计数，分细胞至96孔细胞培养板，每孔2000个细胞。加入LCS或CS至终浓度为0.3mg/ml。37℃培养24小时。控制总体积200微升。每孔加入10微升CCK-8溶液(上海碧云天生物技术有限公司)。设置未加LCS或CS的对照组。在细胞培养箱内继续孵育0.5h，然后在450nm测定吸光度，630nm为参考波长。以未加LCS或CS的对照组的存活率为100％，计算细胞增殖百分比，作图。
实验结果表明：低分子量硫酸软骨素对于HSF细胞(图8)和Hacat细胞(图9)活性都具有显著的增强作用，并显著优于普通硫酸软骨素(p<0.001)，普通硫酸软骨素对于两种细胞的活力基本没有增强作用。
7.低分子量硫酸软骨素抗氧化的作用
通过低分子量硫酸软骨素和普通硫酸软骨素对于人永生化正常角质生成细胞Hacat细胞的活性氧抑制效果来检测抗氧化作用。
细胞培养：培养Hacat细胞至对数生长期，分细胞至96孔板，每孔5000个细胞。37℃培养过夜，按不同比例加入LCS或CS至终浓度分别为0.3mg/ml、0.6mg/ml、1.2mg/ml、2.4mg/ml。37℃培养24小时。
使用活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号S0033)，按照试剂盒说明书检测细胞受不同浓度LCS及CS刺激后的活性氧水平。步骤如下：用无血清DMEM培养基(LIFE TECH)稀释DCFH-DA(荧光染料2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，上海碧云天生物，S0033-1)至终浓度为10微摩尔/升。以不同浓度的LCS及CS刺激细胞，同时设置阳性对照，活性氧阳性对照试剂为Rosup(上海碧云天生物，S0033-2)，通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。去除细胞培养液，无血清DMEM培养基(LIFE TECH)洗涤两次，加入50微升稀释好的DCFH-DA溶液(上海碧云天生物)。37℃孵育30分钟。用无血清DMEM培养基(LIFE TECH)洗涤三次，充分洗去未结合探针。使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时检测刺激前后荧光的强弱。以未加LCS或CS的对照组的活性氧水平为100％，以活性氧百分比作图。
实验结果：如图10，低分子量硫酸软骨素对活性氧有明显抑制作用，并且随着浓度的增加，抑制效果逐渐增强。而普通硫酸软骨素对活性氧有一定的抑制作用，但明显弱于低分子量硫酸软骨素，并且随着浓度的增加，抑制作用没有显著增强。
实施例3.祛痘凝胶的制备
1号凝胶组方：按重量(％)计，卡波姆0.7％，甘油5％，丙二醇5％，苯氧乙醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量3000)1％，余量为去离子水。
2号凝胶组方：按重量(％)计，卡波姆0.7％，甘油5％，丙二醇5％，苯氧乙醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量800)1％，余量为去离子水。
3号凝胶组方：按重量(％)计，卡波姆0.7％，甘油5％，丙二醇5％，苯氧乙醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量15000)1％，余量为去离子水。
4号凝胶组方：按重量(％)计，卡波姆0.7％，甘油5％，丙二醇5％，苯氧乙醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，硫酸软骨素(分子量20000)1％，余量为去离子水。
制备方法：将卡波姆、甘油、丙二醇、苯氧乙醇、香精、去离子水混合均匀，加热至70℃，待全部溶解至透明状，搅拌降温至40℃，加入香精和低分子量硫酸软骨素(或硫酸软骨素)，柠檬酸调pH为6-7，搅拌缓慢降温至室温，即得。
祛痘凝胶效果评价
性别数目(每个实验组)：女10人；男10人。
年龄：20～50岁之间。
皮肤状况：皮肤有明显的粉刺和痘痘，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准。
测试方法：取适量受试样品涂在已清洁的患处，每天2次，早晚各1次，试用1周；受试者在试用期间保持以往生活作息时间和饮食，患处无其他用药。具体结果见表1。
评价结果标准如下：
很好：消肿/止痒/止疼效果明显，肉眼观察患处无明显囊肿或脓包。主动碰触或非主动碰触时，都没有痒、痛、灼烧等不适感。
较好：消肿/止痒/止疼效果较为明显，肉眼观察患处有明显消肿效果。非主动碰触时，没有痒、痛、灼烧等不适感。
一般：基本没有消肿/止痒/止疼效果，肉眼观察患处仍有明显红肿，仍有明显的痒、痛、灼烧等不适感。
差：没有任何消肿/止痒/止疼效果，红肿或痛痒感无任何减轻甚至加剧。
表1.凝胶的祛痘效果评价
实施例4.防脱发喷雾的制备
1号喷雾组方：按重量(％)计，透明质酸0.1％，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量3000)1.2％，余量为去离子水。
2号喷雾组方：按重量(％)计，透明质酸0.1％，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量800)1.2％，余量为去离子水。
3号喷雾组方：按重量(％)计，透明质酸0.1％，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量15000)1.2％，余量为去离子水。
4号喷雾组方：按重量(％)计，透明质酸0.1％，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，硫酸软骨素(分子量20000)1.2％，余量为去离子水。
制备方法：将透明质酸、己二醇、苯氧乙醇、香精、去离子水混合均匀，加热至70℃，待全部溶解至透明状，搅拌降温至40℃，加入香精和低分子量硫酸软骨素(或硫酸软骨素)，柠檬酸调pH为6-7，搅拌缓慢降温至室温，即得。
防脱发喷雾效果评价
性别数目(每个实验组)：女8人；男12人。
年龄：30～70岁之间。
头发状况：头发细软无光泽，日脱发量高于正常脱落水平，符合受试者志愿入选标准。
测试方法：清洁头发并擦干后，取适量受试样品喷于头皮表面，吹干或自然晾干，每天1次，使用4周。具体结果见表2。
评价结果标准如下：
很好：相比于使用前，头发明显变黑有光泽，韧性强度明显增大。梳头或者主动用手轻抓头发，或者清洗完头发后，发现头发脱落的数目明显减少。
较好：相比于使用前，头发无光泽或枯黄的情况有一定程度改善，韧性强度有一定程度增大。梳头或者主动用手轻抓头发，或者清洗完头发后，发现头发脱落的数目有一定减少。
一般：相比于使用前，头发光泽、韧性强度等方面没有明显改善，头发脱落情况没有明显改善。
差：相比于使用前，头发光泽、韧性强度等方面无任何效果，甚至更差。头发脱落的情况更为明显。
表2.喷雾的防脱发效果评价
实施例5.消炎脱敏溶液的制备
1号溶液组方：按重量(％)计，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量3000)0.5％，余量为去离子水。
2号溶液组方：按重量(％)计，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量800)0.5％，余量为去离子水。
3号溶液组方：按重量(％)计，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，低分子量硫酸软骨素(分子量15000)0.5％，余量为去离子水。
4号溶液组方：按重量(％)计，苯氧乙醇0.3％，己二醇0.5％，香精0.05％，柠檬酸0.05％，硫酸软骨素(分子量20000)0.5％，余量为去离子水。
制备方法：将己二醇、苯氧乙醇、香精、去离子水混合均匀，加热至40℃，待全部溶解至透明状，加入香精和低分子量硫酸软骨素(或硫酸软骨素)，柠檬酸调pH为6-7，搅拌缓慢降温至室温，即得。
消炎脱敏溶液效果评价
性别数目(每个实验组)：女10人；男10人。
年龄：20～60岁之间。
发炎状况：过敏、蚊虫叮咬等因素造成的皮肤局部炎症，表观情况为皮肤发红发痒，可能有部分轻微发肿。
测试方法：取适量受试样品喷于已清洁的患处，使用一次，3h后观察效果。具体结果见表3。
评价结果标准：
很好：消肿/止痒效果明显，肉眼观察红肿现象有明显减轻。主动碰触或非主动碰触情况下，都没有明显痒、痛等不适感。
较好：消肿/止痒效果较为明显，肉眼观察红肿现象有明显减轻。非主动碰触时，痒、痛等不适感明显减轻。
一般：基本没有或较少有消肿/止痒效果，肉眼观察红肿现象无明显减轻，仍有痛痒感。
差：没有任何消肿/止痒效果，红肿或痛痒感无任何减轻甚至加剧。
表3.溶液的消炎脱敏效果评价
实施例6.缓解口腔溃疡漱口水的制备及其评价效果
1号漱口水：用去离子水配制质量百分比浓度为0.5％的低分子量硫酸软骨素(分子量3000)水溶液，现配现用。
2号漱口水：用去离子水配制质量百分比浓度为0.5％的低分子量硫酸软骨素(分子量800)水溶液，现配现用。
3号漱口水：用去离子水配制质量百分比浓度为0.5％的低分子量硫酸软骨素(分子量15000)水溶液，现配现用。
4号漱口水：用去离子水配制质量百分比浓度为0.5％的硫酸软骨素(分子量20000)水溶液，现配现用。
评价人群(每个实验组)：女5人；男5人。
年龄：20～50岁之间。
溃疡状况：复发性阿弗他性口炎，发于唇内侧、颊黏膜、前庭沟、软腭等部位，患处为白色，直径0.2-0.5cm，疼痛、灼痛感明显，溃疡产生1-2天，身体健康，符合受试者志愿入选标准。
使用方法：使用受试溶液反复漱口3次，不吞咽，每日使用3次，使用2日。
表4.漱口水缓解口腔溃疡的效果评价
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