一种高密度脂蛋白3的测定试剂、方法和试剂盒
阅读说明：本技术 一种高密度脂蛋白3的测定试剂、方法和试剂盒 (High-density lipoprotein 3 determination reagent, method and kit ) 是由 王贤理 池万余 王伊琳 苗准 邓慰 卢强 于 2020-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域。目的是提供一种HDL3胆固醇的直接测定试剂、方法和试剂盒,即在第一试剂中添加除HDL3以外的脂蛋白保护剂；在第二试剂添加针对水解HDL3-C的表面活性剂与酶的组合的方法。技术方案是：一种测定HDL3的第一试剂,第一试剂包括除HDL3以外的脂蛋白保护剂,还包括Trinder’s色原化合物、二价金属离子、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、缓冲液、稳定剂、防腐剂；其中所述的除HDL3以外的脂蛋白保护剂,是指作用于除HDL3以外的化合物组合。众所周知,血清样本中的HDL3是最致密的脂蛋白,与特定的脂蛋白相关的表面活性剂、环糊精、抗体、聚阴离子、二价金属离子等化合物的组合的反应性极低。(The invention relates to the field of biomedicine. Aims to provide a reagent, a method and a kit for directly measuring HDL3 cholesterol, namely, a lipoprotein protective agent except HDL3 is added into a first reagent; a method of adding a combination of a surfactant and an enzyme directed to hydrolyzing HDL3-C at a second reagent. The technical scheme is as follows: a first reagent for assaying HDL3, which comprises a lipoprotein protectant other than HDL3, a Trinder's chromogen compound, divalent metal ions, cholesterol oxidase, catalase, a buffer, a stabilizer, and a preservative; wherein the lipoprotein protective agent other than HDL3 is a compound combination acting on HDL 3. It is known that HDL3 in a serum sample is the most dense lipoprotein, and the reactivity of a combination of compounds such as a surfactant, cyclodextrin, an antibody, a polyanion, and a divalent metal ion, which are related to a specific lipoprotein, is extremely low.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高密度脂蛋白3(以下称为HDL3)中胆固醇 (以下称为HDL3-C)含量的测定试剂、方法和试剂盒。
背景技术
血液中存在的脂蛋白根据其比重大致分为高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)以及乳糜微粒(CM)。其中高密度脂蛋白(HDL)是由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成。一般将HDL亚组分中颗粒较小密度较大的HDL称为高密度脂蛋白3(HDL3)，密度范围为1.125～1.210g/mL；将颗粒较大、密度较小的HDL称为高密度脂蛋白2(HDL2)，密度范围为1.063～1.125g/mL。近来研究发现，HDL3在动脉硬化的恶化或恢复方面有重要作用。临床实践表面，胆固醇、HDL、LDL和甘油三酯的标准检测通常只能检出约20％的心血管疾病患者，其余约80％的患者只能通过区分亚组分和进一步的脂类检测来鉴别。进一步研究证明HDL3与增加心肌梗死疾病风险系数直接相关。
目前在临床检测应用中，测定HDL3的方法有电泳法、超速离心法和分级沉淀法等。但这些方法检测时间很长，操作步骤繁琐，不能进行大规模自动化检测，且需要昂贵的仪器设备和专门的技术人员，故不能应用于一般的临床医学检测。
在全自动生化分析仪应用领域，测定HDL3的方法有清除法、遮蔽法，其通过采用特征性的化合物清除或遮蔽非HDL3或全部脂蛋白与胆固醇脂酶的反应，但清除法容易清除部分 HDL3，遮蔽法不能完全遮蔽胆固醇酯，从而使测定不准确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏专门针对HDL3的检测方法的不足，提供一种HDL3胆固醇的直接测定试剂、方法和试剂盒，即在第一试剂中添加除HDL3以外的脂蛋白保护剂；在第二试剂添加针对水解HDL3-C的表面活性剂与酶的组合的方法。本发明所述的测定方法，能够特定、专一地检测HDL3，并且该测定方法可靠性高、成本低、效率高，能够大规模自动化检测，优于遮蔽法。本发明所述的试剂盒操作简便。
本发明通过广泛深入的研究，发现将血清样品与包括适宜浓度的表面活性剂，和除HDL3 以外的脂蛋白保护剂，和其他成分组成的第一试剂反应，能够较为完全地保护除HDL3以外的脂蛋白胆固醇；再与组分及其含量经特殊选择的第二试剂反应，从而进一步准确测定血清标本中HDL3的含量。
本发明的技术方案之一是提供一种测定HDL3的第一试剂，第一试剂包括除HDL3以外的脂蛋白保护剂，还包括Trinder’s色原化合物、二价金属离子、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、缓冲液、稳定剂、防腐剂；其中所述的除HDL3以外的脂蛋白保护剂，是指作用于除HDL3以外的化合物组合。众所周知，血清样本中的HDL3是最致密的脂蛋白，与特定的脂蛋白相关的表面活性剂、环糊精、抗体、聚阴离子、二价金属离子等化合物的组合的反应性极低。通过深入的选择性研究，本发明中第一工序溶液包含这种组合；该组合与HDL3不反应或反应度极低。本发明中的这种组合，在血清样本的脂蛋白测定中，无需进行预先分离处理，即可进行高密度脂蛋白3的分类测定。
本文中“保护”的含义，是指降低和分解或阻止和分解第一试剂中特定的脂蛋白胆固醇及其与胆固醇脂酶的反应。
所述除HDL3以外的脂蛋白保护剂，包括非HDL3的表面活性剂、非HDL3的环糊精、非HDL3的聚阴离子、非HDL3的抗体；
在第一试剂中作用于非HDL3的表面活性剂，可例举的包括花王公司的EmulgenA500， Emulgen LS-114，Emulgen 109P，巴斯夫公司的Pluronic F68，聚氧乙烯月桂醚BrijL23、聚氧乙烯(100)十八烷基醚Brij S100和十二烷基苯磺酸钠等。所述表面活性剂可单独使用，也可多种组合使用。所述表面活性剂的用量，Emulgen A500为0.1％～2.0％，更佳的0.3％～1.5％； Pluronic F68为0.1％～3.0％，更佳的0.5％～2.0％；Brij L12和S100为0.01％～1.0％，更佳的 0.03％～0.50％。
在第一试剂中作用于非HDL3的环糊精包括二甲基-β-环糊精、α-环糊精硫酸盐。所述环糊精的用量并无特殊要求，只要能保护非HDL3脂蛋白即可，较佳的用量为0.01％～0.5％，更佳的0.1～0.2％。
在第一试剂中作用于非HDL3的聚阴离子是指葡聚糖及其盐，较佳的为葡聚糖硫酸盐。葡聚糖硫酸盐的分子量并无特殊要求，常用的是5万或50万；较佳的用量为0.05％～1.0％，更佳的0.2％～0.7％。
在第一试剂中作用于非HDL3的抗体包括抗载脂蛋白B100抗体、抗载脂蛋白B48抗体，简称为抗载脂蛋白B抗体。所述抗体的用量并无特殊要求，只要能保护非HDL3脂蛋白即可，较佳的用量为0.10g/L～10.0g/L，更佳的1.0g/L～5.0mg/L。
本发明所述第一试剂中，所述Trinder’s色原化合物为本领域常规的Trinder’s色原化合物，较佳地为3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠(TOOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基) -3-甲基苯胺(TOPS)或N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)，更佳地为TOOS。所述Trinder’s色原化合物的含量为0.3～20mmol/L，较佳地为0.75～5.0mmol/L，更佳地为 1.25～2.5mmol/L。
本发明所述的第一试剂中，所述二价金属离子为本领域常用的金属离子(例如硫酸镁)，其用量为2.0～50mmol/L，较佳地为5～20mmol/L，更佳地为6～10mmol/L。
本发明所述的第一试剂中，所述胆固醇氧化酶的含量为1～5KU/L，较佳地为1.0～3.0KU/L。
本发明所述的第一试剂中，所述过氧化氢酶的含量为1～10MU/L，较佳地为1～3MU/L。
本发明中，较佳地，所述第一试剂还包括缓冲液。所述缓冲液为本领域常规的缓冲液，较佳地为MOPS缓冲液或MOPSO缓冲液，更佳地为MOPS缓冲液。所述缓冲液的含量为本领域常规的含量，较佳地为25～120mmol/L，更佳地为30～50mmol/L。
本发明中，较佳地，所述第一试剂还包括稳定剂。所述稳定剂为本领域常规的稳定剂，较佳地选自抗坏血酸氧化酶、牛血清白蛋白、氯化钠或EDTA中的一种或多种，更佳地为牛血清白蛋白、氯化钠或EDTA中的一种或多种，最佳地为牛血清白蛋白、氯化钠和EDTA。所述稳定剂的含量为本领域常规的含量，其中，较佳地抗坏血酸氧化酶的含量为1～10KU/L；所述牛血清白蛋白的含量较佳地为0.1～10g/L，更佳地为1～5g/L；所述氯化钠的含量较佳地为 5～155mmol/L，更佳地为25～55mmol/L；较佳地，所述EDTA的含量为0.1～2mmol/L。
本发明中，较佳地，所述第一试剂还包括防腐剂。所述防腐剂为本领域常规的防腐剂，较佳地为Proclin-300。所述防腐剂的含量为本领域常规的含量，较佳地为0.01～0.5％，所述百分比为质量百分比。
本发明中，更佳地，所述的第一试剂包括以下的组分：
1.25～2.5mM Trinder’s色原化合物，
3.0～10mM二价金属离子，
除HDL3以外的HDL3脂蛋白保护剂，
1.0～3.0KU/L胆固醇氧化酶，
1.0～3.0MU/L过氧化氢酶，
30～50mM MOPS缓冲液，
154mM氯化钠、2.0mM EDTA、1.0g/L～6.0g/L BSA，稳定剂；
0.02％Proclin-300防腐剂，
其余为水；
所述百分比为质量百分比；
本发明还提供了所述第一试剂的制备方法，其包括以下步骤：将上述试剂组分加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入除HDL3以外的HDL3脂蛋白保护剂，HDL3 脂蛋白保护剂、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶，即得第一试剂。
本发明中，较佳地，所述缓冲液、所述稳定剂和所述防腐剂中的一种或多种在调节pH 之前添加。
本发明所述第一试剂的形态为澄清液体。
本发明的技术方案之二是提供一种测定高密度脂蛋白3的第二试剂，其包括以下的组分：
30～50mmol/L缓冲液，
0.5～10.0KU/L胆固醇酯酶，
1.0～20.0KU/L过氧化物酶，
0.5～0.8g/L 4-氨基安替比林，
0.2～5g/L牛血清白蛋白，
0.1～0.3％叠氮钠，
0.02～2.0％表面活性剂，
其余为水；
所述百分比为质量百分比。
本发明所述第二试剂中，所述过氧化物酶的含量为1.0～20KU/L，较佳地为2.0～10KU/L，更佳地为2.5～5KU/L。
本发明所述第二试剂中，所述表面活性剂为花王公司的Emulgen B66、EmulgenA90，陶氏公司的Tergitol NP-7，Triton X-100，巴斯夫公司的Pluronic L123中的一种或多种。其含量为0.02％～2.0％，更佳的0.1％～1.5％。
本发明所述第二试剂还包括缓冲液；所述缓冲液为本领域常规的缓冲液，较佳地为 MOPS缓冲液或MOPSO缓冲液，更佳地为MOPS缓冲液。所述缓冲液的含量为本领域常规的含量，较佳地为30～75mmol/L，更佳地为30～50mmol/L。
本发明所述的第二试剂中，胆固醇酯酶的作用并无特殊要求，只要能与所述表面活性剂共同水解HDL3都可以使用。所述胆固醇脂酶的含量为0.5～10KU/L，较佳地为1.0～5.0KU/L。
本发明所述第二试剂中，所述叠氮钠的含量为0.1～0.3％，较佳地为0.1％，所述百分比为质量百分比。
本发明中，较佳地，所述第二试剂还包括稳定剂。所述稳定剂为本领域常规的稳定剂，较佳地为牛血清白蛋白。所述稳定剂的含量为本领域常规的含量，较佳地为0.2～5g/L。
本发明中，所述的活性成分选自作用于HDL3的表面活性剂，可列举的包括花王公司的Emulgen B66、Emulgen A90，陶氏公司的Tergitol NP-9、Triton X-100，巴斯夫公司的Pluronic L123。所述表面活性剂可单独使用，也可组合使用，浓度范围为0.2％～2.0％，更佳的 0.5％～1.5％。所述百分比为质量百分比。
通过第一试剂和第二试剂的共同作用，本发明公开的技术方案能有效地检测血清样本中的HDL3。
本发明所述第二试剂的形态为澄清液体。
本发明还提供了所述第二试剂的制备方法，其包括以下步骤：将4-氨基安替比林、表面活性剂、牛血清白蛋白、缓冲液和叠氮钠加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入过氧化物酶、胆固醇氧化酶，即得第二试剂。
本发明中，较佳地，所述缓冲液、所述稳定剂和所述防腐剂中的一种或多种在调节pH 之前添加。
本发明的技术方案之三是，提供一种高密度脂蛋白3的测定方法，其包括以下的步骤：
(1)、将样品与上述第一试剂混合反应，得反应液1；
(2)、将步骤(1)所得的反应液1与上述第二试剂混合反应，得反应液2；
(3)、读取步骤(2)所得的反应液2在600nm和800nm波长处的吸光度值，计算高密度脂蛋白3的含量。
上述测定方法所使用的仪器是本领域常规的仪器，较佳地为本领域常规的全自动生化分析仪，更佳地为日立7180全自动生化分析仪或贝克曼系列全自动生化分析仪。
其中，步骤(1)为：将样品与上述第一试剂混合反应，得反应液1。其中，所述混合反应的时间为本领域常规的条件。所述混合反应的温度为本领域常规的温度，较佳地为37℃。所述样品与上述第一试剂的体积比为本领域常规的体积比，较佳地为1:75～1:120，更佳地为 1:100。
步骤(2)为：将步骤(1)所得的反应液1与上述第二试剂混合反应，得反应液2。其中，所述混合反应的时间为本领域常规的条件。所述混合反应的温度为本领域常规的温度。所述反应液1与上述第二试剂的体积比为本领域常规的体积比，较佳地为5:1～3:1，更佳地为3:1。
步骤(3)为：读取步骤(2)所得的反应液2在546nm和660nm波长处的吸光度值，通过与同样参数定标的标准液样品进行计算，从而得出高密度脂蛋白3的含量。其中，所述计算的方法是本领域自动生化分析仪中的常规计算方法，较佳地，spline方法。
所述步骤(1)即为前述的第一工序；所述步骤(2)即为前述的第二工序；
较佳地，所述的测定方法是以非疾病诊断或治疗目的的测定方法。
本发明的技术方案之四是提供一种测定高密度脂蛋白3的试剂盒，其包括上述的第一试剂和上述的第二试剂。
本发明中，较佳地，所述的试剂盒还包括标准品，所述的试剂盒标准品可为本领域常规使用的商品化试剂盒标准品，较佳地为朗道血脂标准液。
本发明所述的试剂盒操作简便，能够高效、准确地特异性检测高密度脂蛋白3。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的测定方法，能够特定、专一地检测高密度脂蛋白3(HDL3)，并且该检测方法可靠性高、成本低、效率高，能够大规模自动化特异性检测HDL3。所述的测定高密度脂蛋白3的试剂配制简单方便，能够高效、准确地应用于所述方法中进行特异性测定HDL3。本发明所述的试剂盒操作简便。
附图说明
图1是本发明实施例1与采用沉淀法的测试结果对照示意图。
图2是本发明实施例2与采用沉淀法的测试结果对照示意图。
图3是本发明实施例3与采用遮蔽法的测试结果对照示意图。
图4是本发明实施例4与采用遮蔽法的测试结果对照示意图。
图5是本发明实施例5与采用遮蔽法的测试结果对照示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述缓冲液购自苏州贝克生物科技有限公司、Trinders色原购自东仁化学科技 (上海)有限公司、所有的酶购自日本旭化成株式会社、4-氨基安替比林购自美国西格玛奥德里奇公司，其它试剂购自上海化学试剂商店。
实施例1
第一试剂：
将MOPS缓冲液、硫酸镁、氯化钠、EDTA、BSA、TOOS、聚乙二醇6000、Eumlgen LS-114、二甲基-β-环糊精加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入抗载脂蛋白B抗体、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶，并使上述物质达到下列的浓度：
35mM MOPS缓冲液，
15mM硫酸镁，
0.20％Emulgen LS-114，
0.07％二甲基-β-环糊精，
2.5g/L聚乙二醇6000
3.0g/L抗载脂蛋白B抗体，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
1.0MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.02％Proclin-300
0.2mM EDTA，和5.0g/L BSA，
所述百分比为质量百分比。
第二试剂：
将MOPS缓冲液、4-氨基安替比林、牛血清白蛋白、叠氮钠和Eumlgen B66和EmulgenA90加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入胆固醇脂酶、过氧化物酶入水中混合，并使上述物质达到下列的浓度：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清样品反应5 分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副600nm/800nm波长处采用两点终点法，读点14～34 点。并与参见Kostner GM,Molinari E,Pichler P.Evaluation of a new HDL2/HDL3quantitation method based on precipitation with polyethylene glycol.Clin ChimActa 1985；146:139–47.)对照，如图1所示，实施例1测定的相关系数R2为0.9437，说明采用实施例1所述的第一试剂和第二试剂能够有效地检测出高密度脂蛋白3。
实施例2
第一试剂：
将MOPS缓冲液、硫酸镁、氯化钠、EDTA、BSA、TOOS、硫酸葡聚糖钠盐50、Emulgen109P、α-环糊精硫酸盐、抗载脂蛋白B抗体、Proclin-300加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入胆固醇氧化酶和过氧化氢酶，并使上述物质达到下列的浓度：
70mM MOPS缓冲液，
20mM硫酸镁，
0.05％α-环糊精硫酸盐，
0.30％Emulgen 109P，
3.0g/L硫酸葡聚糖钠盐50
2.50g/L抗载脂蛋白B抗体，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
2MU/L过氧化氢酶，
100mM氯化钠，
0.2mM EDTA，和5.0g/L BSA，
所述百分比为质量百分比。
第二试剂：
将MOPS缓冲液、4-氨基安替比林、BSA、叠氮钠、TritonX-100和Pluronic L23加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入胆固醇脂酶、过氧化物酶至溶液中溶解，并使上述物质达到下列的浓度：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清样品反应5 分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副600nm/800nm波长处采用两点终点法，读点14～34 点。并与沉淀法对照，如图2所示，实施例2测定的相关系数R2为0.957，说明采用实施例2所述的第一试剂和第二试剂能够有效地检测出高密度脂蛋白3。
实施例3
第一试剂：
将MOPS缓冲液、硫酸镁、氯化钠、Proclin-300、EDTA、BSA、TOOS、硫酸葡聚糖钠盐、Pluronic F68、α-环糊精硫酸盐、加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入胆固醇氧化酶、抗载脂蛋白B抗体、和过氧化氢酶，并使上述物质达到下列的浓度：
80mM MOPS缓冲液，
10.0mM硫酸镁，
2.55g/L硫酸葡聚糖钠盐，
0.5g/Lα-环糊精硫酸盐
1.0％Pluronic F68，
3.5g/L抗载脂蛋白B抗体，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
4MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.03％Proclin-300
0.2mM EDTA，和5.0g/L BSA，
所述百分比为质量百分比。
第二试剂：
将MOPS缓冲液、4-氨基安替比林、BSA、叠氮钠和Tergitol NP-9加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入2.0KU/L胆固醇酯酶，过氧化物酶入水中混合，并使上述物质达到下列的浓度：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清样品反应5 分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副600nm/800nm波长处采用两点终点法，读点16～34 点。并与遮蔽法对照，如图3所示，实施例3测定的相关系数R2为0.9437，说明采用实施例3所述的第一试剂和第二试剂能够有效地检测出高密度脂蛋白3。
实施例4
第一试剂：
将MOPS缓冲液、硫酸镁、氯化钠、Proclin-300、EDTA、BSA、TOOS、Brij-L123、硫酸葡聚糖钠盐和二甲基-β-环糊精加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入抗载脂蛋白B抗体、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶，并使上述物质达到下列的浓度：
30mM MOPS缓冲液，
5.5mM硫酸镁，
3.50g/L硫酸葡聚糖钠盐，
0.3g/L二甲基-β-环糊精，
0.35％Brij-L123，
2.2g/L抗载脂蛋白B抗体，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
3MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.03％Proclin-300
0.2mM EDTA，和5.0g/L BSA，
所述百分比为质量百分比。
第二试剂：
将MOPS缓冲液、4-氨基安替比林、BSA、叠氮钠、Emulgen B66和Tergitol NP-9加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入胆固醇脂酶、过氧化物酶入水中混合，并使上述物质达到下列的浓度：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清样品反应5 分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副600nm/800nm波长处采用两点终点法，读点16～34 点。并与遮蔽法对照，如图4所示，实施例4测定的相关系数R2为0.9422，说明采用实施例4所述的第一试剂和第二试剂能够有效地检测出高密度脂蛋白3。
实施例5
第一试剂：
将MOPS缓冲液、硫酸镁、氯化钠、Proclin-300、EDTA、BSA、TOOS、二甲基-β-环糊精、硫酸葡聚糖钠盐和Brij-S100加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.40-6.60，然后加入抗载脂蛋白B抗体、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶，并使上述物质达到下列的浓度：
24mM MOPS缓冲液，
13.0mM硫酸镁，
2.80g/L硫酸葡聚糖钠盐，
0.27g/L二甲基-β-环糊精
0.20％Brij S100
3.0g/L抗载脂蛋白B抗体，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
4MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.03％Proclin-300
0.2mM EDTA，和5.0g/L BSA，
所述百分比为质量百分比。
第二试剂：
将MOPS缓冲液、4-氨基安替比林、BSA、叠氮钠、Emulgen B66和Tergitol NP-9加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至6.50-7.50，然后加入胆固醇脂酶、过氧化物酶入水中混合，并使上述物质达到下列的浓度：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清样品反应5 分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副600nm/800nm波长处采用两点终点法，读点16～34 点。并与遮蔽法对照，如图5所示，实施例5测定的相关系数R2为0.9495，说明采用实施例5所述的第一试剂和第二试剂能够有效地检测出高密度脂蛋白3。
以上实施例清晰地说明，采用本发明所述方法，能够准确地测定血清样本中HDL3。所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。
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