一种用于人miR-34a基因甲基化快速检测的特异性引物组合、试剂盒及方法
阅读说明：本技术 一种用于人miR-34a基因甲基化快速检测的特异性引物组合、试剂盒及方法 (Specific primer combination, kit and method for quickly detecting methylation of human miR-34a gene ) 是由 刘枭男 张佳幸 华恺 崔亚丽 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于人miR-34a基因甲基化快速检测的特异性引物组合、试剂盒及方法。该方法采集的样本经过转化使其DNA甲基化的差异转化为DNA的序列差异；基于LAMP核酸扩增以及引物错配对扩增阻滞的原理,LAMP反应过程中实现对DNA序列差异的识别；利用扩增片段上标记的地高辛和金磁纳米微粒表面标记的地高辛单抗相互识别偶联,结合侧向流层析技术,实现特定基因甲基化的快速检测。本发明以LAMP技术执行核酸的扩增,极大地缩短了核酸扩增的时间并且降低了对于仪器设备的依赖,提高了灵敏度；并使扩增产物的检测彻底避免了引物二聚体造成的假阳性现象,提高了特异性；省去核酸扩增产物鉴定而导致的高成本、费时、费力等问题,使检测方法更易普及。(The invention discloses a specific primer combination, a kit and a method for quickly detecting human miR-34a gene methylation. The method comprises the steps of converting DNA methylation differences of samples collected by the method into DNA sequence differences; based on the principle of LAMP nucleic acid amplification and primer mismatching amplification block, the identification of DNA sequence difference is realized in the LAMP reaction process; the rapid detection of the methylation of the specific gene is realized by utilizing mutual recognition and coupling of the digoxin marked on the amplified fragment and the digoxin monoclonal antibody marked on the surface of the gold magnetic nanoparticle and combining a lateral flow chromatography technology. The invention uses LAMP technology to amplify nucleic acid, greatly shortens the time of nucleic acid amplification, reduces the dependence on instrument and equipment, and improves the sensitivity; the detection of the amplification product thoroughly avoids the false positive phenomenon caused by primer dimer, and improves the specificity; the problems of high cost, time consumption, labor consumption and the like caused by the identification of nucleic acid amplification products are saved, so that the detection method is easier to popularize.)
技术领域
本发明属于基因甲基化检测技术领域，特别涉及一种用于人miR-34a基因甲基化快速检测的特异性引物组合、试剂盒及方法。
背景技术
癌症在全球范围内对人类的健康造成了严重的威胁，是导致人类疾病死亡的最主要因素。癌症诊断的主要依据包括临床症状、影像学检测和组织病理学检查等，许多癌症患者的临床症状出现较晚，绝大多数的早期癌症患者无任何明显的临床症状。对于癌症的早期筛查，目前包括许多方法，比如低剂量CT诊断、组织细胞层面的癌症诊断和基因层面的癌症诊断等。但是这些手段存在诸多弊端：低剂量CT检测存在假阳性问题，且检测成本高；组织层面的癌症诊断在取样方面会给患者带来较大痛苦，且有可能导致癌细胞扩散或转移；基因层面的肿瘤特异性分子标志物检测可以作为癌症早期诊断的一种手段，但技术尚未成熟。
目前，疾病的基因检测方法受到了广泛的关注。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，不仅维持正常细胞功能，而且在癌症发生中也起着重要的作用，甲基化状态的改变是引起癌症的一个重要因素。采用DNA甲基化作为疾病诊断的标志物，优势主要为：其一，在肿瘤形成过程中，启动子超甲基化的发生频率很高，甚至高于基因突变，其中不乏与肿瘤形成相关的重要基因；其二，甲基化是肿瘤发生早期的重要事件；其三，DNA甲基化稳定存在，可以通过基因扩增放大效应进行检测。因此，甲基化检测对肿瘤早期诊断具有潜在的应用价值。
尽管现有技术已经发现了多种与癌症相关的甲基化基因，但是在早期癌症中，不同基因发生甲基化的频率、不同基因的高甲基化位点均不相同，适用的检测方法需要进一步研究。在外周血中，发生异常甲基化的DNA只占全部DNA的约0.1％-1％，这些非甲基化DNA与甲基化DNA只存在微小的差异，需要从高度复杂的干扰背景中检测出痕量的异常甲基化DNA，对检测方法提出了高要求。此外，实验室层面的甲基化检测高度依赖于精密复杂的仪器设备和专业人员繁琐的操作步骤，在精准医疗的背景下严重地阻碍了个体化医疗的普及。因此，有必要提供一种快速、灵敏且方便的基因甲基化检测手段，在癌症的早期筛查及普及方面具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种用于人miR-34a基因甲基化快速检测的特异性引物组合、试剂盒及方法，主要解决了现有方法仅能局限于实验室应用，检测成本高，无法快速灵敏检测的问题。
本发明的具体技术解决方案如下：
该用于人miR-34a基因甲基化快速检测的特异性引物组合，包括甲基化特异性引物组和未甲基化特异性引物组，
所述甲基化特异性引物组的核苷酸序列如下：
甲基化特异性引物组中上游内引物FIP的核苷酸序列为：
5'-biotin-CACGTGAAATTTATTGCGTTGGAGGTCCGTTAGTGCGATGTACCC
甲基化特异性引物组中下游内引物BIP的核苷酸序列为：
5'-biotin-ATTGCAAAAATCCAAGAAGCAGCGAGATGTGCCAATCACATAA
甲基化特异性引物组中上游外引物F3的核苷酸序列为：
GGAGAAAGTGTTGGAGGGTGAA
甲基化特异性引物组中下游外引物B3的核苷酸序列为：
ACTCAAACTAACCATATCACAACA；
所述未甲基化特异性引物组中上游内引物FIP的核苷酸序列为：
5'-biotin-ACATTAAAACATTACATCAATCGAGGGTTACCGATTAATCCTAGAATGTAAG
未甲基化特异性引物组中下游内引物BIP的核苷酸序列为：
5'-biotin-AAATAACCAAACTGGAATTGAACTTATGTGTTAGAAATGTCAAATGTGGTT
未甲基化特异性引物组中上游外引物F3的核苷酸序列为：GGTGGAGAGAATTTGAGGAGGA
未甲基化特异性引物组中下游外引物B3的核苷酸序列为：CTAAACCCAACTAACATACATCAA。
应用前述特异性引物组用于人miR-34a基因甲基化快速检测的试剂盒，该试剂盒包括特异性引物组合和试纸条。
进一步的，试纸条的质控线喷涂有质控用羊抗兔IgG、检测线喷涂有捕获用链霉亲和素、结合垫喷涂有地高辛单抗修饰的金磁微粒。
进一步的，地高辛单抗修饰的金磁微粒为核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米Fe3O4磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗，形成地高辛单抗修饰的金磁微粒。
进一步的，金表面修饰有地高辛单抗中地高辛标记的碱基为dATP、dTTP、dCTP、dDTP或dUTP。
一种人miR-34a基因甲基化的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1】获取组织基因组DNA和/或游离DNA样本；
2】对经步骤1】获取到的DNA样本进行修饰液处理，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶不发生改变；
3】对经步骤2处理的任一样本，平行做两支LAMP反应，其中一支反应使用前述甲基化特异性引物组，另一支反应使用前述未甲基化特异性引物；
4】在同一样本的两支LAMP反应体系中均加入地高辛标记的碱基以标记扩增产物，两支LAMP反应体系和反应条件相同并同时置于恒温条件下，获得扩增产物；
5】使用前述用于人miR-34a基因甲基化快速检测的试剂盒中的试纸条对经步骤4】处理得到的扩增产物进行快速检测，判读样本甲基化模式。
进一步的，所述步骤1】中游离DNA样本为外周血游离DNA、尿液游离DNA或其他组织液游离DNA。
进一步的，所述步骤2】中修饰液均为5mM-5M的无机盐溶液或有机溶液。
进一步的，所述无机盐溶液或有机溶液为KOH溶液、NaOH溶液、Ca(OH)2溶液、NaHSO3溶液、NaHSO4溶液、Na2SO3溶液或C6H6O2溶液。
进一步的，所述步骤5】具体是：
将步骤4】完成同一样本的两管扩增产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测，由于获得的扩增产物同时标记有生物素和地高辛，滴加至样品垫上后，扩增产物上的地高辛与地高辛单抗修饰的金磁微粒特异性结合，层析上移至检测线处，扩增产物上的生物素与检测线上的链霉亲和素特异结合显色，而未甲基化特异性引物扩增的反应溶液在试纸条的检测线上不显色，则表明完全甲基化；反之为未甲基化；若两支试纸条的检测线均显色，则表明部分甲基化。
本发明的有益效果体现在以下方面：
(1)降低检测成本，便于推广使用
已有的DNA甲基化的检测技术，如荧光定量PCR法、基因芯片杂交法、PCR结合凝胶电泳法、PCR结合毛细管电泳法、PCR结合酶切方法、DNA直接测序法等，通常需要配备一些特殊仪器，如基因测序仪，芯片点样仪，荧光定量PCR仪，电泳及成像设备等，或者需要复杂的扩增产物酶处理过程，需要耗费高额成本以完成检测。本发明不仅节省了DNA纯化试剂成本，还无需特殊仪器设备，仅通过试纸条目视化判读结果，大大降低了整个检测的成本，便于在各级医疗机构推广使用。
(2)提高检测灵敏度
相对已有的基于PCR的甲基化检测方法，本发明采用LAMP核酸扩增技术，通过优化引物、优化LAMP反应体系等条件在保证准确性、操作简便性的同时获得了高灵敏度，痕量的目的序列在总检测模板中的比例为0.1％时仍然可准确检测到。
(3)提高检测特异性
已有的基于核酸扩增的DNA甲基化检测方法为了提高检测的灵敏度而提高引物浓度时会由于引物二聚体的因素导致严重的假阳性。使用本发明进行DNA甲基化检测时，由于只有一种生物标记的寡聚核苷酸参与扩增反应，即使有引物二聚体的产生也不会导致在层析试纸条上显色进而造成误判。本发明的设计使检测方法具有高灵敏度的同时还能保持高特异性。
(4)提高检测效率
已有的基于核酸扩增的技术大都依赖于PCR的方法，但依赖于PCR的方法需要热循环而使整个核酸扩增过程的时间长达90min。本发明采用LAMP核酸扩增技术，不仅不需要热循环，而且在等温环境下30min即可完成核酸扩增过程，极大地提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明甲基化模式为完全甲基化时的试纸条显色结果示意图；
图2为本发明甲基化模式为未甲基化时的试纸条显色结果示意图；
图3为本发明甲基化模式为部分甲基化时的试纸条显色结果示意图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供了一种人miR-34a基因甲基化的快速检测方法，包括以下步骤：
1】样本的获取：样本类型可以是组织基因组DNA、外周血游离DNA、尿液游离DNA或其他组织液游离DNA。
2】样本的处理：步骤一中得到的DNA需经过一套修饰液处理使未甲基化的胞嘧啶发生转化为尿嘧啶而甲基化的胞嘧啶不发生改变。
3】针对每一个样本，平行做两支LAMP反应，其中一支反应使用甲基化特异性引物，另一支反应使用未甲基化特异性引物；特异性引物主要是针对待检测miR-34a基因的启动子及第一外显子区域进行设计，分别设计一组甲基化特异性引物和一组未甲基化特异性引物进行识别与扩增；在两组特异性引物中FIP和BIP引物上均有5′端标记的生物素；
4】在两支LAMP反应体系中均加入地高辛标记的碱基以标记扩增产物，两支LAMP反应体系和反应条件相同并同时置于恒温条件下，获得扩增产物，扩增反应体系为：
5】利用金磁微粒特有的可目视化特性，采用层析技术并以地高辛和地高辛单抗作用、生物素和链亲和素作用，利用层析试纸条对步骤(5)得到的扩增产物进行快速检测，判读样本甲基化模式。滴加甲基化特异性引物扩增的反应溶液在试纸条的检测线上显色，而未甲基化特异性引物扩增的反应溶液在试纸条的检测线上不显色，则表明完全甲基化；反之为未甲基化；若两支试纸条的检测线均显色，则表明部分甲基化。
其中，步骤一中所述样本类型是组织基因组DNA、外周血游离DNA、尿液游离DNA或其他组织液游离DNA。
步骤2】中所述的修饰液均为5mM-5M的无机盐溶液或有机溶液，其可以是KOH溶液、NaOH溶液、Ca(OH)2溶液、NaHSO3溶液、NaHSO4溶液、Na2SO3溶液或C6H6O2溶液。
步骤4】中所述的地高辛标记的碱基为dATP、dTTP、dCTP、dDTP或dUTP。
步骤5】中的层析技术采用的试纸条满足以下条件：
a.试纸条的质控线喷涂有质控用羊抗兔IgG；
b.试纸条的检测线喷涂有捕获用链霉亲和素；
c.试纸条的结合垫喷涂有地高辛单抗修饰的金磁微粒；
步骤5】中分型检测，是指将步骤五完成的两支扩增产物分别滴至两支试纸条的样品垫上进行检测。获得的扩增产物同时标记有生物素和地高辛，滴加至样品垫上后，地高辛与地高辛单抗偶联的金磁微粒特异性结合后，层析上移至检测线处，扩增产物上的生物素与检测线上的链霉亲和素特异结合显色，依此判断样本的甲基化模式。
步骤六所述的地高辛单抗修饰的金磁微粒，是指一种核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米Fe3O4磁性粒子，表面是金壳层，金表面修饰有地高辛单抗，形成地高辛单抗修饰的金磁微粒。
下面以实施例阐述本发明提供的一种人miR-34a基因甲基化快速检测方法的实施过程。
实施例1、引物的设计与优化
针对miR-34a基因启动子区域以及第一外显子区域设计引物：通过NCBI数据库确认miR-34a的基因序列，据此设计合成引物。针对待检测的miR-34a基因分别设计一组甲基化特异性引物和一组未甲基化特异性引物进行识别与扩增，每组引物与相应的模板碱基互补。为了利于后续层析检测技术，针对设计的引物和碱基进行生物标记。其中FIP和BIP进行生物素标记，碱基进行地高辛标记。为增加扩增特异性和检测分辨率，同时设计多组引物进行试验筛选。
根据以下目标筛选最优引物：(1)扩增特异性高：完全甲基化、未甲基化特异性引物均只能对相应的模板扩增出特异的目的条带。(2)扩增灵敏度高，能在样本中存在低至0.1％目的序列的情况下有效扩增出目的片段。(3)对样本类型的适应度高，不仅适用于常见的基因组DNA样本，而且对外周血游离DNA、尿液游离DNA或其他组织液游离DNA也能有效特异地扩增。
其中，对于扩增准确性和灵敏度，按照下述步骤进行筛选：用已知确定的完全甲基化和未甲基化的人基因组DNA作为模板进行梯度稀释，使得目的序列占总模板中的比例为：50％、25％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％。利用设计的多套备选引物上述各个比例的模板进行扩增，同时设置阳性质控和阴性质控。将扩增后的产物分为2部分，分别进行琼脂糖凝胶电泳检测和本申请的试纸条层析系统检测，确定所设计的引物准确性与灵敏度。
实验结果表明，优化后的引物对样品进行LAMP扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳和试纸条层析系统均能检测出比例低至0.1％的突变。另外，用肉眼判断层析试纸条对于0.1％模板的检测信号强度明显高于琼脂糖凝胶电泳的信号强度且没有假阳性的出现，与预期的结果相吻合。
实施例2、基因组DNA样本的检测
取10例石蜡包埋组织样本，纯化基因组DNA后用修饰液处理转化备用；取A、B两支离心管中分别加入以下物质(A管中加入甲基化特异性引物组，B管中加入未甲基化特异性引物组)：
将A、B两管放入金属浴，65℃恒温孵育30min。
将A、B两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，按照如下原则进行突变与否的判断：如果结果如图1所示，A管甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线显色、而B管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线不显色则表明位点为完全甲基化。结果如图2所示A管甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线不显色、而B管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线显色则表明位点为未甲基化，结果如图3所示两个管对应的试纸条的T线均显色则表明位点为部分甲基化。
实施例3、外周血游离DNA样本的检测
取10例新鲜外周血样本，纯化外周血游离DNA后用修饰液处理转化备用；取A、B两支离心管中分别加入以下物质(A管中加入甲基化特异性引物组，B管中加入未甲基化特异性引物组)：
将A、B两管放入金属浴，65℃恒温孵育30min。
将A、B两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，按照如下原则进行突变与否的判断：如果结果如图1所示，A管甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线显色、而B管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线不显色则表明位点为完全甲基化。结果如图2所示A管甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线不显色、而B管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线显色则表明位点为未甲基化，结果如图3所示两个管对应的试纸条的T线均显色则表明位点为部分甲基化。
实施例4、尿液游离DNA样本的检测
取10例新鲜尿液样本，纯化尿液游离DNA后用修饰液处理转化备用；取A、B两支离心管中分别加入以下物质(A管中加入甲基化特异性引物组，B管中加入未甲基化特异性引物组)：
将A、B两管放入金属浴，65℃恒温孵育30min。
将A、B两管的扩增产物分别滴加至两支试纸条上，按照如下原则进行突变与否的判断：如果结果如图1所示，A管甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线显色、而B管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线不显色则表明位点为完全甲基化。结果如图2所示A管甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线不显色、而B管未甲基化特异性引物组对应的试纸条的T线显色则表明位点为未甲基化，结果如图3所示两个管对应的试纸条的T线均显色则表明位点为部分甲基化。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
<110>西安金磁纳米生物技术有限公司
<120>一种人miR-34a基因甲基化的快速试纸条检测方法及试剂盒
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CTAAACCCAACTAACATACATCAA 24
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