替加色罗在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用
阅读说明：本技术 替加色罗在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用 (Use of tegaserod for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of coronavirus infection ) 是由 柳晓春 徐锡明 袁文敏 赵广健 王娟 赵晨阳 杨金波 于 2020-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了替加色罗在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。所述替加色罗的分子式为C-(16)H-(23)N-5O,能够抑制新型冠状病毒PLpro蛋白的活性,且在50μmol/L浓度下的抑制率高达100％,半数抑制浓度IC-(50)＜15μmol/L。本发明经过实验验证替加色罗对多种细胞无毒性作用,能够用于制备预防或治疗新型冠状病毒感染中的药物组合物,且安全可靠。本发明新型冠状病毒的预防或治疗提供了新的化合物以及新的思路。(The invention discloses application of tegaserod in preparing a medicament for preventing or treating coronavirus infection. The molecular formula of the tegaserod is C 16 H 23 N 5 O, can inhibit the activity of a novel coronavirus PLpro protein, and has an inhibition rate of up to 100% at a concentration of 50 mu mol/L and a half inhibition concentration IC 50 < 15. mu. mol/L. Experiments prove that the tegaserod has no toxic effect on various cells, can be used for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating novel coronavirus infection, and is safe and reliable. The prevention or treatment of the novel coronavirus of the invention provides novel compounds and novel ideas.)
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及替加色罗在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，是由学名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”(sever acuterespiratory syndrme coronavirus2，SARS-CoV-2)感染引起的疾病。目前，新冠肺炎的确诊病例已在众多国家出现。COVID-19是通过吸入或与感染的飞沫接触而传播的，潜伏期为2至14天甚至更长，其常见的临床特征包括发热、咳嗽、咽喉痛、头痛、疲劳、肌痛、呼吸困难等。COVID-19在大多数人中是轻度的，但在部分老年人和合并症患者中较为严重，它能迅速发展为肺炎、急性呼吸窘迫综合征或多器官功能障碍等，甚至导致死亡；而还有部分人群属于无任何明显症状的无症状感染者。目前对COVID-19的研究涉及流行性病学调查、临床研究、病毒的检测方法等诸多方面，但有关于SARS-CoV-2病毒入侵、复制、免疫调控机制等研究仍处于探索阶段，且暂时没有疫苗能够为未患病者提供充分的保护，因此针对SARS-CoV-2的抗病毒药物的研究具有非常重要的意义。
SARS-CoV-2属于冠状病毒科β冠状病毒属，是一种包膜的非分段正向RNA病毒，其进入宿主细胞是由S蛋白介导的，S蛋白分为受体结合S1区和膜融合S2区。S1通过其受体结合域(RBD)与细胞表面血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合；S2融合宿主细胞和病毒膜，使病毒基因组能够进入宿主细胞进行复制而引发疾病。SARS-CoV-2基因组大小约29.8kb，含有14个ORFs，可编码27个蛋白，其中包括4种较为保守结构蛋白：刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M和核衣壳蛋白N；8种辅助蛋白3a，3b，p6，7a，7b，8b，9b和orf14等。SARS-CoV-2病毒基因组在5’端有2个开放阅读框orf1a和orf1b，可编码2个多聚蛋白pp1a和pp1b；该病毒内还包含两种半胱氨酸蛋白酶-主蛋白酶(Mpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)，由这两个蛋白酶水解多聚蛋白可得到15种非结构蛋白NSP(NSP1-NSP10和NSP12-NSP16)，进而参与到病毒的转录和复制过程中。
PLpro蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族中的一类，在宿主细胞内，病毒PLpro识别NSP1/2、NSP2/3及NSP3/4的界限，多聚蛋白肽键的水解裂解发生在P1后的甘氨酸位点，进而导致病毒释放NSP1、NSP2和NSP3来启动病毒介导的RNA复制。另外，PLpro在病毒肽裂解之外还通过去泛素化、去ISG15修饰等参与病毒逃避先天免疫反应等过程。因此，PLpro对于病毒生命周期至关重要，被认为是抗新型冠状病毒感染药物研发的重要靶点，而研究和发现能够有效作用于这些参与冠状病毒生命周期靶点的药物或化合物，对SARS-CoV-2的深入研究、药物研发、预防和治疗均具有非常积极的意义。
发明内容
本发明提供了替加色罗在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。所述替加色罗具有较强的抑制新型冠状病毒PLpro活性的作用，能够用于预防或者治疗SARS-CoV-2感染，并且对多种细胞无害。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了替加色罗在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用。
进一步的，所述替加色罗的分子式为C16H23N5O，结构式为
进一步的，所述冠状病毒包括新型冠状病毒。
进一步的，所述替加色罗能够抑制新型冠状病毒PLpro蛋白的活性。
进一步的，所述替加色罗在50μmol/L浓度下的抑制率为100％。
进一步的，所述新型冠状病毒PLpro蛋白为根据其原始编码序列中G/C含量和大肠杆菌密码子优化后表达的PLpro蛋白。
进一步的，所述优化后的PLpro蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述优化后的PLpro蛋白的编码序列翻译后的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
进一步的，所述替加色罗抑制PLpro蛋白的抑制浓度为IC50＜15μmol/L。
进一步的，所述替加色罗的抑制浓度的检测方法分别为：在20mmol/L、pH为6.8的磷酸盐缓冲液体系下，加入总浓度为40-200nmol/L的PLpro，在25℃的孵育温度下，再加入不同浓度的替加色罗，室温震荡孵育15min后，迅速加入荧光底物，共测定和记录30min的荧光读数，计算抑制率；然后结合替加色罗浓度的对数值和抑制率，通过四参数法计算所述替加色罗的抑制浓度IC50值。
进一步的，荧光底物包括MCA-Dnp-Lys、Cbz-RLRGG-AMC和Ub-AMC。
进一步的，所述抑制率的计算公式为IR(inhibition rate)＝(1-vi/v0)×100％，其中v0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。
进一步的，当荧光底物为MCA-Dnp-Lys，浓度为20μmol/L时，所述替加色罗的抑制浓度IC50为9.26μmol/L。
进一步的，当荧光底物为Cbz-RLRGG-AMC，浓度为2.4μmol/L时，所述替加色罗的抑制浓度IC50为1.42μmol/L。
进一步的，当荧光底物为Ub-AMC，浓度为2.4μmol/L时，所述替加色罗的抑制浓度IC50为14.01μmol/L。
进一步的，所述替加色罗对细胞无毒性作用。
进一步的，所述细胞为A549细胞、caco-2细胞、HepG2细胞、HEK293细胞和vero细胞。
进一步的，所述替加色罗能够单独使用，或者与其他药物、化合物、载体复配成药物组合物。
进一步的，所述药物组合物为口服剂、注射剂、涂剂、洗剂、气雾剂、油制剂或透皮贴剂。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明通过虚拟筛选得到替加色罗，其具有很好的抑制新型冠状病毒PLpro蛋白活性的作用，在50μmol/L浓度下的抑制率高达100％，并且替加色罗抑制PLpro蛋白的抑制浓度为IC50＜15μmol/L，说明替加色罗可以成为预防或者治疗新型冠状病毒感染的潜在药物。
2、替加色罗对多种细胞无毒性作用，其可以单独作为一种原料药，或与其他已知的药物、化合物或载体相配合制成口服剂、注射剂、涂剂、洗剂、气雾剂、油制剂或透皮贴剂等各种形式的药剂或药物组合物而预防或者治疗新型冠状病毒感染，并且使用时安全可靠，不会对细胞和机体产生毒副作用。本发明为治疗新型冠状病毒感染提供了新的化合物以及新的思路。
附图说明
图1为替加色罗的虚拟筛选流程。
图2为替加色罗与SARS-CoV-2的PLpro结合模式分析。
图3为新型冠状病毒PLpro蛋白的纯化结果图。
图4为当荧光底物为MCA-Dnp-Lys时的新型冠状病毒PLpro的米氏常数曲线。
图5为当荧光底物为Cbz-RLRGG-AMC时的新型冠状病毒PLpro的米氏常数曲线。
图6为当荧光底物为Ub-AMC时的新型冠状病毒PLpro的米氏常数曲线。
图7为当荧光底物为20μmol/L MCA-Dnp-Lys时，替加色罗对新型冠状病毒PLpro的抑制曲线。
图8为当荧光底物为2.4μmol/L Cbz-RLRGG-AMC时，替加色罗对新型冠状病毒PLpro的抑制曲线。
图9为当荧光底物为2.4μmol/L Ub-AMC时，替加色罗对新型冠状病毒PLpro的抑制曲线。
图10为不同浓度的替加色罗对A549细胞生长活性影响。
图11为不同浓度的替加色罗对caco-2细胞生长活性影响。
图12为不同浓度的替加色罗对HepG2细胞生长活性影响。
图13为不同浓度的替加色罗对HEK293细胞生长活性影响。
图14为不同浓度的替加色罗对vero细胞生长活性影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：虚拟筛选
SARS-CoV-2的Papain-like蛋白酶(PLpro)与SARS-CoV的PLpro的氨基酸序列具有极高的相似性，因此可以使用SARS-CoV的PLpro的晶体结构(PDBID：3E9S)通过SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)同源建模的方法获得SARS-CoV-2的PLpro结构模型(Model01)。采用lepro对Model01进行加氢、加电荷、质子化状态预测，以模板结构3E9S中的配体(TTT)为中心，周围的范围为分子对接的格点区间，格点区间包含了整个活性口袋，每个格点长度设为配体通过ligprep对配体进行加氢、三维结构优化和质子化状态预测，最终生成了9175个化合物构象(sdf格式)。使用ledock_go进行分子对接，分离对接结果的第一个结合构象，根据打分值(Score)计算配体效率(LE)，选取LE小于-0.3的化合物构象656个；然后用prime-mmgbsa计算这些化合物构象和受体蛋白的结合自由能(ΔG，Kcal/mol)。最后，用lewater计算氢键罚分(HBP)，并将计算结果和受体-配体复合物的结合自由能进行重新计算，以最终ΔG＜-50Kcal/mol为选择标准，获得了61种化合物作为候选活性分子，筛选流程如(图1)所示。最终发现替加色罗对SARS-CoV-2的PLpro具有很高的抑制活性。分子对接模式(图2)显示吲哚环与链状结构上的氮原子和PLpro活性口袋内的残基形成了稳定的氢键网络；由于烯氨结构的碳原子同时和三个氮原子相连，导致其带有部分正电荷，可以作为正电中心分别与ASP164、TYR264形成盐桥和π-cation相互作用，烯氨结构还与VAL165的主链氨基形成了水桥；芳香环和脂肪链与ASP164、TYR264、GLN269形成了疏水相互作用，这些有利的分子间相互作用对提高化合物和蛋白的结合亲和力发挥了关键作用。
替加色罗(Tegaserod)的化学名称是：N′-[(E)-[(5-methoxy-1H-indol-3-yl)methylidene]amino]-N-pentylguanidine，分子式为C16H23N5O，分子量为301，其结构式如下：
替加色罗为吲哚类选择性5-HT4受体部分激动剂，通过激活胃肠道5-HT4受体而刺激胃肠蠕动反射和肠道分泌，并抑制内脏的高敏感性，其具有调整胃肠道自律功能，调节多种因素引起的胃肠功能紊乱，使胃肠功能恢复正常。目前还未发现有关于替加色罗具有抗病毒活性的研究报道。
实施例2：新型冠状病毒PLpro的米氏常数测定
1、新型冠状病毒PLpro蛋白的表达纯化
新型冠状病毒PLpro蛋白的基因根据其原始编码序列中G/C含量和适用于大肠杆菌原核表达系统密码子的应用进行优化，优化后的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其翻译后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
选择PET-28作为表达载体，将测序正确的pET-28重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，挑单克隆菌扩大培养，37℃摇床培养至OD600为1.0～1.2，加入IPTG(终浓度为0.1mmol/L)，20℃诱导过夜表达；菌液4500rpm 4℃离心30min，弃上清收集菌体。用裂解液(20mM HEPES，0.5M NaCl，pH 7.4，加200μg/ml溶菌酶和0.05％Triton X-100)重悬菌体至50ml离心管，置于摇床上4℃孵育30min后冰上超声破碎，12000rpm下4℃离心取上清备用。用5倍柱体积的双蒸水清洗镍柱，10倍柱体积平衡液平衡，随后加入菌体上清，4℃摇床孵育1h，弃流出液，加入洗杂液充分洗杂蛋白，加入洗脱液洗脱并收集目的蛋白；最后，将目的蛋白倒入Millipore Amicon Ultra-15超滤管中离心浓缩除盐，即得纯化好的重组PLpro蛋白，采用考马斯亮蓝方法检测测蛋白纯度，纯化结果(图3)显示本发明所得的PLpro蛋白纯度较高。
2、PLpro米氏常数的测定
在酶总浓度为500nmol/L、底物浓度为0.195μmol/L、0.39μmol/L、0.78μmol/L、1.57μmol/L、3.13μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L的条件下，测定新型冠状病毒PLpro的酶活。新型冠状病毒PLpro活性测定的缓冲体系为：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。实验组在25℃的孵育温度下，加入500nmol/L的PLpro，迅速加入荧光底物1，每隔1.5min记录一次荧光读数，共测定30min。设置对照组加入相同体积的缓冲液，其余实验条件均保持与实验组相同。其中，荧光底物1为MCA-AKIALKGGKIVN-lys(MCA-Dnp-Lys)。用于荧光强度测定的仪器为多功能酶标仪SpectraMax iD5，激发光和发射光的波长分别为320nm和425nm；运用四参数法分析计算酶促反应的初速率，结果如图4所示，对于荧光底物1，PLpro的米氏常数Km值为105.7μmol/L，最大反应速率Vmax为0.000701μmol/(L·s)。
在酶总浓度为100nmol/L、底物浓度为0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、20μmol/L、24μmol/L、28μmol/L、32μmol/L、40μmol/L的条件下，测定新型冠状病毒PLpro的酶活。新型冠状病毒PLpro活性测定的缓冲体系为：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。实验组在25℃的孵育温度下，加入100nmol/L的PLpro，迅速加入荧光底物2或荧光底物3，每隔1.5min记录一次荧光读数，共测定30min。设置对照组加入相同体积的缓冲液，其余实验条件均保持与实验组相同。其中，荧光底物2为Cbz-RLRGG-AMC，荧光底物3为Ub-AMC。用于荧光强度测定的仪器为多功能酶标仪SpectraMax iD5，激发光和发射光的波长分别为360nm和460nm；运用四参数法分析计算酶促反应的初速率，结果如图5和图6所示，对于荧光底物2，PLpro的米氏常数Km值为32.39μmol/L，最大反应速率Vmax为0.00126μmol/(L·s)；对于荧光底物3，PLpro的米氏常数Km值为7.32μmol/L，最大反应速率Vmax为0.519nmol/(L·s)，以上结果说明本发明提取所获得的PLpro蛋白纯度和酶活均较好。
实施例3：抑制剂替加色罗活性筛选
测定50μmol/L浓度下不同化合物对新型冠状病毒PLpro的酶促反应的初速率。新型冠状病毒PLpro活性测定的缓冲体系为：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。实验组的PLpro总浓度为200nmol/L，在25℃的孵育温度下，加入不同化合物的溶解物，室温震荡孵育15min，迅速加入20μmol/L荧光底物1，每隔1.5min记录一次荧光读数，共测定30min。对照组则加入相同体积的缓冲液，其余实验条件均保持与实验组相同。用于荧光强度测定的仪器为多功能酶标仪SpectraMax iD5，激发光和发射光的波长分别为320nm和425nm。
根据酶促反应速率计算出每个化合物的剩余活性RA(residual activity)＝(vi/v0)，以及抑制率IR(inhibition rate)＝(1-vi/v0)×100％，其中v0为不加抑制剂的酶促反应的初速度；vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。实验结果见表1，在多种化合物中，替加色罗具有很高的抑制活性，在50μmol/L浓度下抑制率可达到100％，说明替加色罗能够很好的抑制PLpro蛋白的活性。
表1：不同化合物在50μM浓度下对新型冠状病毒PLpro的抑制率
实施例4：抑制剂替加色罗半数抑制浓度IC50的测定
替加色罗用DMSO配制成阶梯浓度。
对于荧光底物1，测定在不同浓度的替加色罗处理下，新型冠状病毒PLpro的酶促反应的初速率。新型冠状病毒PLpro活性测定的缓冲体系为：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)。实验组的PLpro总浓度为200nmol/L，在25℃的孵育温度下，加入1.56μmol/L，3.13μmol/L，6.25μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L，37.5μmol/L，50μmol/L，75μmol/L浓度替加色罗，室温震荡孵育15min，迅速加入20μmol/L荧光底物1，进行化合物的IC50检测；每隔1.5min记录一次荧光读数，共测定30min。对照组则加入相同体积的缓冲液，其余实验条件均保持与实验组相同。用于荧光强度测定的仪器为多功能酶标仪SpectraMax iD5，激发光和发射光的波长分别为320nm和425nm。以替加色罗浓度的对数值为横坐标，对应的抑制率的值为纵坐标，制作曲线，并通过四参数法计算出替加色罗的IC50值。结果见图7，替加色罗具有很好的抑制活性，替加色罗的抑制浓度IC50为9.26μmol/L。
对于荧光底物2和荧光底物3，测定在不同浓度的替加色罗处理下，新型冠状病毒PLpro的酶促反应的初速率。新型冠状病毒PLpro活性测定的缓冲体系为：20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)。实验组的PLpro总浓度为40nmol/L，在25℃的孵育温度下，加入0.78μmol/L，1.57μmol/L，3.13μmol/L，6.25μmol/L，12.5μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L浓度替加色罗，室温震荡孵育15min，迅速加入2.4μmol/L荧光底物2或荧光底物3，进行化合物的IC50检测；每隔1.5min记录一次荧光读数，共测定30min。对照组则加入相同体积的缓冲液，其余实验条件均保持与实验组相同。用于荧光强度测定的仪器为多功能酶标仪SpectraMaxiD5，激发光和发射光的波长分别为360nm和460nm。以替加色罗浓度的对数值为横坐标，对应的抑制率的值为纵坐标，制作曲线，并通过四参数法计算出替加色罗的IC50值。结果见图8-9，替加色罗具有很好的抑制活性，当底物为2.4μmol/L荧光底物2时，替加色罗的抑制浓度IC50为1.42μmol/L；当底物为2.4μmol/L荧光底物3时，替加色罗的抑制浓度IC50为14.01μmol/L。
实施例5：抑制剂替加色罗细胞毒性测试
测定替加色罗对多种细胞的细胞毒作用。选用了非洲绿猴肾细胞VERO、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人结直肠腺癌细胞caco-2和人胚胎肾细胞HEK-293。取对数生长期细胞，调整细胞浓度，以4000～5000/孔接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。实验组每孔加入不同浓度(20μmol/L，10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L，1.25μmol/L，0.625μmol/L，0.313μmol/L，0.157μmol/L，0.078μmol/L，0.04μmol/L，0.02μmol/L，0.01μmol/L)浓度的替加色罗，对照组则加入等倍稀释的溶剂，每组设4～5个复孔，在37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养48h，每孔加入10μl刃天青溶液(1mg/ml)，37℃孵育4h，用于荧光强度测定的仪器为多功能酶标仪SpectraMax iD5，激发光和发射光的波长分别为549nm和595nm。按下列公式计算替加色罗对多种细胞生长抑制率：
结果见图10-14，20μmol/L浓度的替加色罗对多种细胞均无细胞毒作用。
综上，PLpro作为新型冠状病毒中参与RNA复制、翻译和蛋白水解处理相关的蛋白，在新型冠状病毒生命周期至关重要，本发明通过虚拟筛选筛选获得了替加色罗，并验证替加色罗对新型冠状病毒PLpro具有很强的抑制活性，对三种不同的荧光底物的IC50各为9.26μmol/L，1.42μmol/L和14.01μmol/L，说明替加色罗可以通过抑制PLpro的活性来阻断新型冠状病毒的生命周期，进而成为一种预防或者治疗新型冠状病毒感染潜在药物或化合物。替加色罗可以单独作为一种原料药使用，或与其他已知的药物、化合物或载体相配合制成口服剂、注射剂、涂剂、洗剂、气雾剂、油制剂或透皮贴剂等各种形式的药剂而预防或者治疗新型冠状病毒感染。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
青岛海洋科学与技术试点国家实验室发展中心
青岛海洋生物医药研究院股份有限公司
<120> 替加色罗在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagtgcgta ccattaaggt gtttaccacc gttgataata ttaatctgca tacccaggtt 60
gttgatatga gcatgaccta tggtcagcag tttggcccga cctatctgga tggtgcagat 120
gtgaccaaaa ttaagccgca taatagccat gaaggtaaaa ccttttatgt tctgccgaat 180
gatgataccc tgcgtgttga agcatttgaa tattatcata ccaccgatcc gagttttctg 240
ggccgttata tgagtgcact gaatcatacc aaaaaatgga aatatccgca ggttaatggc 300
ctgaccagta ttaagtgggc agataataat tgttacctgg caaccgccct gctgaccctg 360
caacagattg aactgaaatt caatccgccg gcactgcaag atgcctatta tcgtgcacgc 420
gcaggtgaag ccgccaattt ttgtgcactg attctggcct attgcaataa gaccgttggc 480
gaactgggcg atgtgcgtga aaccatgagt tatctgtttc agcacgctaa tctggatagt 540
tgcaaacgtg ttctgaatgt tgtgtgcaaa acctgtggtc agcagcagac caccctgaaa 600
ggcgtggaag ccgtgatgta tatgggcacc ctgagttatg aacagtttaa aaaaggtgtg 660
cagattccgt gcacctgcgg taaacaggca accaaatatc tggttcagca ggaaagcccg 720
tttgttatga tgagcgcccc gccggcccag tatgaactga aacatggtac attcacttgt 780
gcaagcgaat ataccggcaa ttatcagtgc ggtcattata aacatatcac cagtaaagaa 840
accctgtatt gcattgatgg tgccctgctg acaaaaagta gtgaatataa aggcccgatt 900
accgatgtgt tttataaaga aaatagctac accaccacca tttaa 945
<210> 2
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Arg Thr Ile Lys Val Phe Thr Thr Val Asp Asn Ile Asn Leu
1 5 10 15
His Thr Gln Val Val Asp Met Ser Met Thr Tyr Gly Gln Gln Phe Gly
20 25 30
Pro Thr Tyr Leu Asp Gly Ala Asp Val Thr Lys Ile Lys Pro His Asn
35 40 45
Ser His Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Val Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu
50 55 60
Arg Val Glu Ala Phe Glu Tyr Tyr His Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu
65 70 75 80
Gly Arg Tyr Met Ser Ala Leu Asn His Thr Lys Lys Trp Lys Tyr Pro
85 90 95
Gln Val Asn Gly Leu Thr Ser Ile Lys Trp Ala Asp Asn Asn Cys Tyr
100 105 110
Leu Ala Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gln Gln Ile Glu Leu Lys Phe Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Gln Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Arg Ala Gly Glu Ala
130 135 140
Ala Asn Phe Cys Ala Leu Ile Leu Ala Tyr Cys Asn Lys Thr Val Gly
145 150 155 160
Glu Leu Gly Asp Val Arg Glu Thr Met Ser Tyr Leu Phe Gln His Ala
165 170 175
Asn Leu Asp Ser Cys Lys Arg Val Leu Asn Val Val Cys Lys Thr Cys
180 185 190
Gly Gln Gln Gln Thr Thr Leu Lys Gly Val Glu Ala Val Met Tyr Met
195 200 205
Gly Thr Leu Ser Tyr Glu Gln Phe Lys Lys Gly Val Gln Ile Pro Cys
210 215 220
Thr Cys Gly Lys Gln Ala Thr Lys Tyr Leu Val Gln Gln Glu Ser Pro
225 230 235 240
Phe Val Met Met Ser Ala Pro Pro Ala Gln Tyr Glu Leu Lys His Gly
245 250 255
Thr Phe Thr Cys Ala Ser Glu Tyr Thr Gly Asn Tyr Gln Cys Gly His
260 265 270
Tyr Lys His Ile Thr Ser Lys Glu Thr Leu Tyr Cys Ile Asp Gly Ala
275 280 285
Leu Leu Thr Lys Ser Ser Glu Tyr Lys Gly Pro Ile Thr Asp Val Phe
290 295 300
Tyr Lys Glu Asn Ser Tyr Thr Thr Thr Ile
305 310