一种RNA甲基化m6A检测方法及试剂盒
阅读说明：本技术 一种RNA甲基化m6A检测方法及试剂盒 (RNA methylation m6A detection method and kit ) 是由 林锦梅 陈少锐 于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种RNA甲基化m6A检测方法及试剂盒。本发明的检测方法采用抗体捕获和RNA逆转录相结合的方法,利用逆转录过程中以RNA为模板合成DNA的过程,针对目标基因m6A位点区域,设计特异寡核苷酸引物并偶连生物素检测指定基因m6A水平,及随机引物检测总RNAm6A水平。利用被m6A抗体捕获的RNA片段结合,并用带有HRP标记的链霉亲和素结合生物素进行二级信号放大,通过TMB显色检测吸光度并计算得到目标基因m6A的水平。本发明首次提供了一种不完全依赖抗体免疫酶联的系统性检测m6A的方法,具有高效、灵敏等优点,同时检测成本低、操作简便、适用于多种RNA样本,解决了传统检测方法分辨率有限、无法进行m6A定量、RNA样本需求量大的问题。(The invention relates to a method and a kit for detecting RNA methylation m 6A. The detection method of the invention adopts a method combining antibody capture and RNA reverse transcription, utilizes the process of synthesizing DNA by taking RNA as a template in the reverse transcription process, designs specific oligonucleotide primers aiming at the site region of the target gene m6A and couples biotin to detect the level of the designated gene m6A, and detects the level of total RNAm6A by random primers. The level of the target gene m6A was calculated by detecting absorbance through TMB color development using RNA fragment binding captured by the m6A antibody and secondary signal amplification using streptavidin-conjugated biotin with HRP label. The invention provides a method for systematically detecting m6A without completely depending on antibody immunoenzyme coupling for the first time, which has the advantages of high efficiency, sensitivity and the like, is low in detection cost, simple and convenient to operate, is suitable for multiple RNA samples, and solves the problems that the traditional detection method is limited in resolution, cannot carry out m6A quantification and is large in RNA sample requirement.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种RNA甲基化m6A检测方法及试剂盒。
背景技术
N6-methyladenosine(m6A)，是一种腺嘌呤核苷酸在腺苷酸甲基转移酶催化下发生的修饰，普遍的分布于不同类型的RNA中。众所周知，RNA甲基化在RNA的可变剪切、转录起始和翻译中发挥重要作用。RNA甲基化水平与新陈代谢、遗传发育、疾病发生发展等生物学过程密切相关。
目前已经开发出在整个转录组中有效定位m6A的多种方法。最初的研究使用免疫沉淀法，该类方法利用特异性高的m6A抗体进行新一代测序。这些方法被称为MeRIP-seq。MeRIP已经得到改进，现可用于单核苷酸分辨率m6A定位。这一操作可以通过与免疫沉淀反应相结合的极小RNA片段(100-200nt)来实现，改进后的方法被称为miCLIP，由Linder等人于2015年最先描述。miCLIP现已应用于许多不同细胞类型和生物中m6A的定位，揭示了其新的潜在功能。
一直以来，在单碱基分辨率水平检测m6A存在诸多技术难点。再加上携带m6A的mRNA/lncRNA丰度较低、m6A甲基基团的反应惰性以及m6A附近RNA结构的干扰等因素，使得在单碱基水平检测m6A愈发困难。目前广泛应用的m6A/MeRIP-seq技术利用m6A抗体对携带m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，然后进行RNA测序，将m6A定位在200nt范围以内。尽管这些技术使得分析m6A表观转录谱成为可能，但它们既不能精确定位MeRIP-Seq peak里实际发生m6A修饰的腺苷酸，也不能对每个修饰位点进行定量。因此，为了进一步深入了解m6A表观转录组学的生物学功能与分子机制，亟待新的技术，能够在单碱基水平确定m6A的修饰状态和修饰比例。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种具高效、灵敏、可定量分析的RNA甲基化m6A检测方法及试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种RNA甲基化m6A检测方法，包括以下步骤：
(1)将RNA样品加到抗体包被的实验孔中，室温孵育；
(2)弃去实验孔中的液体，加入洗涤液，使用移液枪吹打后弃去洗涤液，重复三次；
(3)取逆转录引物加入到实验孔中，进行逆转录反应；
(4)将带有标记的链霉亲和素加入到实验孔中，链霉亲和素与生物素发生结合反应；
(5)弃去实验孔中的液体，加入洗涤液，使用移液枪吹打后弃去洗涤液，重复三次；
(6)将显色剂加入到实验孔中并孵育，再加入终止液；
(7)检测实验孔中混合物的吸光值并计算得出m6A含量。
利用逆转录中以RNA为模板合成DNA的过程，将逆转录随机引物偶连生物素，随机引物将于被m6A免疫沉淀的RNA片段结合，在利用链霉亲和素与生物素结合，进而通过TMB显色法即可以检测目的基因m6A的含量。
优选地，所述抗体为m6A重组抗体。
优选地，所述逆转录引物为寡聚胸腺嘧啶引物、随机引物或基因特异性引物。
根据实验目的不同逆转录随机引物可以从寡聚胸腺嘧啶引物(Oligo dT)，随机引物(Random hexamers)和基因特异性引物(GSP)中进行选择。
如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT，与真核生物mRNA的3’PolyA尾配对，适合长链甚至全长mRNA的逆转录。其对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
选择随机引物时，第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断裂、全长产物的降低。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源的时候，使用Oligo dT或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。
优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。
优选地，所述孵育的温度为20～25℃，孵育的时间为1h。
优选地，所述检测吸光度的检测波长为450nm。
一种RNA甲基化m6A检测试剂盒，其特征在于，包括以下材料：洗涤液、样品提取液、逆转录试剂、阴性对照液、阳性对照液、辣根过氧化物酶标记亲和素、终止液。
优选地，所述洗涤液为氯化钠、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、吐温20中的至少一种。
优选地，所述样品提取液为为苯酚、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇中的至少一种。
优选地，所述逆转录试剂为随机引物标记生物素、目标基因引物标记生物素、多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸、脱氧核糖核苷三磷酸、RNA酶抑制剂、RNase inhibitor、DNA逆转录聚合酶中的至少一种。
优选地，所述阴性对照液中不含m6A的RNA的浓度为100μg/mL。
优选地，所述阳性对照液中m6A寡核苷酸的浓度为2μg/mL。
优选地，所述终止液中硫酸的浓度为2mol/L。
辣根过氧化物酶催化TMB显蓝色后可以使用2mol/L H2SO4终止反应；加入硫酸后，溶液呈黄色，此时可以在450nm测定吸光度。
优选地，所述RNA甲基化m6A检测试剂盒还包括酶标板、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液。
优选地，所述辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液为平衡盐溶液。
平衡盐溶液是溶液中电解质含量与血浆内含量相仿的盐溶液。
优选地，所述底物溶液包含底物显色A液和底物显色液B，所述底物显色液A为醋酸钠、柠檬酸、双氧水中至少一种，所述底物显色液B为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、甘油、3,3',5,5'-四甲基联苯胺中的至少一种；使用前将A液与B液1:1混合即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)检测成本低，使用试剂是标记生物素随机引物、生物素标记目标基因引物合成费用比较低廉，节省实验经费。
(2)操作简便，仅需要离心机、生化恒温箱盒、酶标仪等简单的设备，可实现在基础实验室进行，实现稳定的重复性和可靠性。
(3)检测结果可以绝对定量。
(4)采用了m6A抗体和检测基因标记引物相结合原理，可将信号特异性放大，提高检测样品真实可靠性，使得检测试剂盒具有效率高、灵敏度高、特异性强的优点。
(5)适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞裂解液等有游离RNA多种标本。如果样品中游离RNA量不足也可以进行提取浓缩后进行检测。
附图说明
图1为RNA甲基化m6A检测方法原理图。
图2为效果例1中对实施例1～3的RNA样品m6A相对定量分析图。
图3为效果例2中m6A标准曲线图。
图4为效果例2中对实施例1～3的RNA样品m6A绝对定量分析图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
从血清中提取人类乳腺癌细胞RNA，取人类乳腺癌细胞RNA 200ng，采取以下的步骤进行处理：
1样品的采集和制备
1.1取人类乳腺癌细胞，裂解并抽提RNA。
1.2纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染；
1.3总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
2实验前处理步骤
2.1试验前将试剂和待测样本放置室温下平衡(20-25℃)充分混匀。并确定本次检测所需的酶标板孔数目，将所需要的微孔放置到配套板架上；
2.2按照要求用蒸馏水或纯净水来稀释浓缩清洗液，充分混匀后备用。
2.3将待测样本用稀释液,适当稀释，放于室温备用。
3加样及温育步骤
3.1 m6A标准品配置
3.1.1 m6A标准品溶解
冻干的标准品回复至室温后，小心打开瓶盖，避免粉末散失。加入1.0mL去离子水溶解冻干粉，获得标准品储备液。标准品储备液在稀释前平衡至少15min，轻轻涡旋至充分混匀。
3.1.2 m6A标准品分装使用
重新溶解后，立刻将标准品储备液分装至EP管中，每管50μl，并在-80℃冷冻保存最长6个月。如有必要，在分装/冷冻前，2-8℃最长保存8h，不要让重新溶解的标准品置于室温。
3.1.3 m6A标准曲线配置
(1)用标准品储备液配置成1ng/mL的标准品工作液，涡旋混匀；
(2)在6个EP管中加入300μl Assay Diluent，依次标注1ng/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、15.6pg/ml和7.8pg/ml；
(3)通过向下一管加入300μl的每管标准品进行连续的稀释，每次转移之间需充分涡旋混匀。用Assay Diluent作为空白标曲(0ng/mL)。
3.2工作检测试剂准备
(Note:One-step incubation of Biotin/Streptavidin reagents)加入所需体积的Detection Antibody至Assay Diluent检测稀释液中。在使用前15min，加入所需量的Enzyme Reagent酶制剂，涡旋充分混匀。有关推荐的稀释度，查阅特定批次的Instruction/Analysis Certificate。对于完整的96孔板，需要准备12mL Working Detector。丢弃使用后剩余的Working Detector。
3.3检测步骤
(1)在96孔板上进行实验的孔中加入100μl用Coating Buffer稀释好的捕获抗体--Anti-N6-methyladenosine(m6A)，用于包被孔板，密封孔板并4℃孵育过夜。推荐测抗体包被稀释度，查阅特定批次的Instruction/Analysis Certificate；
(2)包被后，弃去孔中液体，加入300μL/孔的Wash Buffer，洗涤3次。最后一次清洗后，将孔板倒扣于吸水纸上，尽量去除残留液体；
(3)加入200μL/孔的Assay Diluent封闭孔板。室温孵育1h；
(4)按步骤(2)进行洗涤；
(5)加入100μL标准品、样品和对照至相应的孔中，密封孔板，室温孵育2h；
(6)参照步骤(2)进行洗涤，需洗涤5次；
(7)加入样品进行逆转录，将样品和标准品溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；
(8)在孔板中加入逆转录试剂，将上述反应溶液在30℃保温10min；在42℃保温60min；在85℃保温10mn；
(9)每孔加入100μL Working Detector(Detection Antibody+SAv-HRPreagent)，密封孔板，室温孵育1h；
(10)按步骤(2)进行洗涤，需洗涤7次；
(11)每孔加入100μL Substrate Solution，室温避光孵育30min；
(12)每孔加入50μL Stop Solution；
实施例2
对脑组织进行研磨并提取RNA，取获得的脑细胞RNA 200ng，采取以下的步骤进行处理：
1样品的采集和制备
1.1取人脑组织细胞，裂解并抽提RNA。
1.2纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染；
1.3总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
2实验前处理步骤
参考实施例1中的步骤进行操作。
3加样及温育步骤
参考实施例1中的步骤进行操作。
实施例3
取200ng酵母tRNA，采取以下的步骤进行处理：
1样品的采集和制备
1.1纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染；
1.2总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
2实验前处理步骤
参考实施例1中的步骤进行操作。
3加样及温育步骤
参考实施例1中的步骤进行操作。
效果例1
取实施例1～3处理的样品，在处理30min之内测定450nm处的吸光值，并进行波长校正。计算出m6A的相对含量，计算方法如下：
S为样品RNA总量，P为试剂盒标准品或者阳性对照RNA量。
结果如图2所示。
效果例2
m6A绝对定量检测：
(1)制作m6A标准曲线；
(2)取实施例1～3处理的样品，在处理30min之内测定450nm处的吸光值，并进行波长校正。根据标准曲线计算出m6A的含量。
制作标准曲线如图3所示，实施例1～3样品的RNA含量结果如图4所示。
效果例1和效果例2分别对实施例1～3的样品中m6A进行了相对定量和绝对定量分析，并且实施例1～3中的RNA样品分别来源于血清、组织以及微生物。综合上述分析，本发明具有对m6A绝对定量检测，同时可检测样品范围广的优点。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。