阅读说明：本技术 一种血管紧张素转化酶测定试剂盒、制备方法及用途 (Angiotensin converting enzyme assay kit, preparation method and application ) 是由 凡速朋 龚婷 张超 舒芹 赵愿安 于 2020-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种血管紧张素转化酶测定试剂盒,属于生物检测技术领域,所述试剂盒以单试剂构成,单试剂包含以下成分：缓冲液：50～100mmol/L、无机盐：200～500mmol/L、亚铁氰化钾：5～20mg/L、表面活性剂：0.1％～5.0％、保护剂：10～100mg/L、防腐剂：0.05％～0.1％、苯丙酰氨基双甘肽：0.5～2.0mmol/L；pH为8.20±0.05。该试剂盒与常规ACE检测试剂盒相比,具有更好的开瓶稳定性及抗胆红素干扰能力,同时试剂的重复性、线性范围、精密度、准确度均不受影响。本发明还提供了一种血管紧张素转化酶测定试剂盒的制备方法及用途。(The invention provides an angiotensin converting enzyme assay kit, which belongs to the technical field of biological detection, and the kit is composed of a single reagent, wherein the single reagent comprises the following components: buffer solution: 50-100 mmol/L, inorganic salt: 200-500 mmol/L, potassium ferrocyanide: 5-20 mg/L, surfactant: 0.1-5.0%, protective agent: 10-100 mg/L of preservative: 0.05-0.1%, phenylpropylamido diglycine: 0.5-2.0 mmol/L; the pH was 8.20. + -. 0.05. Compared with the conventional ACE detection kit, the kit has better bottle opening stability and bilirubin interference resistance, and the repeatability, linear range, precision and accuracy of the reagent are not affected. The invention also provides a preparation method and application of the angiotensin converting enzyme assay kit.)

一种血管紧张素转化酶测定试剂盒、制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种血管紧张素转化酶测定试剂盒、制备方法及用途。

背景技术

血管紧张素转化酶，简称ACE，是一种含锌离子的膜结合糖蛋白，分子量为150KD，属二肽羧肽酶，能使血管紧张素I肽链C末端的组氨酸和亮氨酸残基水解形成具有增压作用的血管紧张素II，后者通过与血管紧张素平滑肌作用引起血管支气管收缩。

血管紧张素转化酶具有降血压的作用，并与缓激肽P物质等多肽性炎性物质的灭火，血管紧张素转化酶(ACE)还能直接作用于肾上腺皮质促进醛固酮的分泌，因此，血管紧张素转化酶是肾素血管紧张素醛固酮系统以及缓激肽系统的重要调节因素，影响人体的多种生理机能。

各种血管紧张素转化酶(ACE)主要定位于毛细血管内皮细胞，由于肺组织具有丰富的血管床且肺毛细血管床内皮细胞所含的血管紧张素(ACE)位于细胞外，促使血管紧张素I转化为血管紧张素II的作用强，且肺循环是体内唯一不使血管紧张素II的含量最高，一般认为血管内皮细胞的ACE与胞膜密切结合几乎不释放ACE，而巨噬细胞和单核细胞产生的ACE大部分释放入血，故当ACE升高时应考虑为巨噬细胞、单核细胞系统的分泌亢进。

目前，血管紧张素转化酶诊断试剂盒所用方法基本原理是ACE催化苯丙酰氨基双甘肽(FAPGG)水解成苯丙酰氨和双甘肽，在340nm波长下，吸光度呈下降趋势，在一定范围内，吸光度的下降速率与标本中ACE的活性成正比，通过连续监测法检测FAPGG在340nm处吸光度下降的趋势可计算出ACE的活性。

目前，市场大部分血管紧张素转化酶测定试剂盒(连续监测法)，普遍存在着两个不足，一是稳定性差的问题，开瓶稳定性难以满足30天的要求。二是检测结果容易受胆红素的干扰。

发明内容

为了解决现有ACE检测试剂盒稳定性差的技术问题，本发明提供了一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，该试剂盒与常规ACE检测试剂盒相比，具有更好的开瓶稳定性及抗胆红素干扰能力，同时试剂的重复性、线性范围、精密度、准确度均不受影响。

本发明还提供了一种血管紧张素转化酶测定试剂盒的制备方法及用途。

本发明通过以下技术方案实现：

一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，所述试剂盒以单试剂构成，单试剂包含以下成分：

缓冲液：50～100mmol/L、无机盐：200～500mmol/L、亚铁***：5～20mg/L、表面活性剂：0.1％～5.0％、保护剂：10～100mg/L、防腐剂：0.05％～0.10％、苯丙酰氨基双甘肽：0.5～2.0mmol/L；pH为8.20±0.05。

优选的，所述单试剂包含以下成分：

缓冲液：80mmol/L、无机盐：400mmol/L、亚铁***：5mg/L、表面活性剂：0.5％、保护剂：100mg/L、防腐剂：0.05％、苯丙酰氨基双甘肽：1mmol/L；pH为8.2。

进一步的，所述缓冲液包括磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、HEPES、TOPS、PIPES和TAPSO中的任意一种。

进一步的，所述无机盐包括氯化钠，氯化钾、氯化钙，氯化铵，氯化镁，硫酸镁，硫酸锂，硫酸铵，醋酸镁，硫酸锌和硫酸钠中的任意一种或多种。

进一步的，所述表面活性剂包括聚乙二醇6000、吐温-20、Emulgen A90、吐温-80、月桂醇聚氧乙烯醚、Emulgen 209、月桂醇聚氧乙烯醚、丙三醇、Emulgen430、蓖麻油、Tritox-405、Emulgen A60、PVP-40、Tritonx114、TritonX-100、GENAPOLX-080、EmulgenB66、NP-1055、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000和Emulgen 709中的任意一种。

进一步的，所述保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、乳糖醇，山梨醇、葡萄糖、二硫苏糖醇和谷胱甘肽中的任意一种。

进一步的，所述防腐剂为叠氮钠。

一种血管紧张素转化酶测定试剂盒的制备方法，包括：

准备原料：缓冲液、无机盐、亚铁***、表面活性剂、保护剂、防腐剂、苯丙酰氨基双甘肽；

将缓冲液、无机盐、亚铁***、表面活性剂、保护剂、防腐剂和苯丙酰氨基双甘肽配制成溶液，并通过酸液或碱液调节pH至8.20±0.05，得到所述单试剂。

进一步的，所述酸液为17％盐酸，所述碱液为20％NaOH溶液。

一种血管紧张素转化酶测定试剂盒在血管紧张素转化酶检测中的用途。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，对ACE单试剂进行优化，通过在试剂中加入适当的保护剂，提高ACE试剂的开瓶稳定性；加入一定量的表面活性剂及亚铁***，提高ACE试剂抗胆红素干扰能力，同时不会对ACE试剂的重复性、灵敏度、线性范围、精密度、准确度产生影响。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

针对于常规的血管紧张素转化酶检测试剂盒存在的开瓶稳定性差、抗胆红素干扰能力不足的问题，本发明提供了一种稳定性好、抗胆红素干扰能力强的血管紧张素检测试剂盒(比色法)，该试剂盒与常规的血管紧张素转化酶试剂盒相比，稳定性及抗胆红素干扰能力均更好。

本发明提供一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，对ACE单试剂进行优化，通过在R试剂中加入适当的保护剂，提高ACE试剂的开瓶稳定性；加入一定量的表面活性剂及亚铁***，提高ACE试剂抗胆红素干扰能力，同时不会对ACE试剂的重复性、线性范围、精密度、准确度产生影响。

具体的，本发明一种血管紧张素转化酶测定试剂盒，所述试剂盒以单试剂构成，单试剂包含以下成分：

缓冲液：50～100mmol/L、无机盐：200～500mmol/L、亚铁***：5～20mg/L、表面活性剂：0.1％～5.0％、保护剂：10～100mg/L、防腐剂：0.05～0.1％、苯丙酰氨基双甘肽：0.5～2.0mmol/L；pH为8.20±0.05。

所述缓冲液包括磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES、TOPS、PIPES和TAPSO中的任意一种。所述无机盐包括氯化钠，氯化钾、氯化钙，氯化铵，氯化镁，硫酸镁，硫酸锂，硫酸铵，醋酸镁，硫酸锌和硫酸钠中的任意一种或多种。

所述表面活性剂包括聚乙二醇6000、吐温-20、Emulgen A90、吐温-80、月桂醇聚氧乙烯醚、Emulgen 209、月桂醇聚氧乙烯醚、丙三醇、Emulgen430、蓖麻油、Tritox-405、Emulgen A60、PVP-40、Tritonx114、TritonX-100、GENAPOLX-080、Emulgen B66、NP-1055、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000和Emulgen709中的任意一种。

进一步的，所述保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、乳糖醇，山梨醇、葡萄糖、二硫苏糖醇和谷胱甘肽中的任意一种。所述防腐剂为叠氮钠。

本发明通过在R试剂中加入稳定剂、氯化钠、以及防腐剂组成复合稳定剂，各组分协同作用使试剂稳定性能优异，有效的增强了试剂盒的稳定性，延长试剂的保存期限，同时不影响试剂的准确度及线性范围指标。

本发明通过加入亚铁***来消除血液样本中的胆红素的干扰，避免了黄疸样本测值不准确的结果。然而，试剂R中单独加入亚铁***，虽能消除胆红素干扰，但对试剂的准确度、线性范围存在影响。而通过加入Emulgen系列表面活性剂，可以有效避免线性及准确度下降。亚铁***能有效消除胆红素干扰，但会降低底物的反应速率，而Emulgen系列表面活性剂则对底物反应起着保护效果，二者相互作用，巧妙的解决了试剂抗胆红素干扰问题以及不影响准确度及线性性能指标。

下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请一种血管紧张素转化酶测定试剂盒进行详细说明。

实施例

1.本发明设置4个对比例和1个实施例，各对比例和实施例的试剂盒成分如表1所示：

表1 对比例1-4和实施例1的试剂盒成分

2.试剂评价

按照以下方法评价对比例1-4和实施例1试剂的性能指标：

(1)准确度：测第三方质控品，计算测定平均值与靶值的偏差，≤10％算满足要求；

(2)线性范围：测定0-200U/L范围样本，计算相关系数，r≥0.9900，同时在(0，20]U/L范围内，绝对偏差不超过±4U/L，在(20，200]U/L范围内，相对偏差不超过±10％条件算满足要求；

(3)精密度：重复测定同一样本10次，计算CV(％)，CV≤5.0％算满足要求；

(4)开瓶稳定性：将试剂开瓶放置在生化仪上，每个一天测值三次质控，计算平均值及偏差，若偏差超过10％，则不满足要求；

(5)抗胆红素干扰：分别配制5个不同浓度胆红素的血清样本，测值，与空白样本测值比较，测值偏差不超过10％偏差，表示试剂抗该浓度下胆红素干扰。

3.评价结果和结论

对比例1-4和实施例1试剂的各项性能指标如表2-7所示：

表2 性能评价数据

表3 精密度评价数据

重复性	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4	实施例1
						1	41.6	42.1	55.6	42.5	41.3
2	41.4	41.5	56.3	40.5	40.5
						3	40.9	40.3	55.1	41.8	42.5
4	41.4	40.8	55.2	41.8	41.3
						5	40.4	41.5	56.9	41.1	40.8
6	41.5	42.2	54.8	40.3	41.2
						7	41.0	41.6	54.3	41.2	41.3
8	41.8	41.8	55.8	40.5	41.2
						9	41.6	41.8	55.2	40.8	40.5
10	42.1	42.1	54.9	41.1	40.1
						AVE	41.37	41.57	55.41	41.16	41.07
SD	0.49	0.60	0.76	0.70	0.66
						CV	1.18％	1.45％	1.38％	1.69％	1.60％

表4 准确度评价数据

表5 线性范围评价数据

由表5可知：对比例3中加入亚铁***后，(0，20]U/L范围内绝对偏差超过±4％，(20，200]U/L范围内，线性相对偏差超过±10％，线性范围不满足要求。对比例4中加入亚铁***及Emulgen表面活性剂后，Emulgen表面活性剂消除了亚铁***对底物反应的干扰作用，线性范围不受影响，满足要求。

表6 开瓶稳定性评价数据

表7 抗胆红素干扰评价数据

结论：

对比例2与对比例1比较，试剂中加入100mg/L的二硫苏糖醇(DDT)，对比例2的开瓶稳定性在31天，对照1在15天，开瓶稳定性有极大改善，由此可知DDT在试剂中起着稳定剂的作用。

对比例3及对比例4与对比例1比较，分别多加入了亚铁***、亚铁***和Emulgen A90，对比例3及对比例4抗胆红素的能力达到0.5g/L，抗胆红素的能力显著增强；然而对比例3与对比例4比较，对比例3未加表面活性剂Emulgen A90，只加亚铁***虽能增强ACE试剂抗胆红素的能力，但明显影响了试剂准确度，加入Emulgen A90，则能消除准确度下降的因素。

实施例1分别加入了稳定剂及亚铁***、Emulgen A90，其准确度、开瓶稳定性和抗胆红素干扰能力均显著提高。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。