阅读说明：本技术 一种在不同植物病害系统中通过病原物的接种即可鉴定抗病基因的技术体系 (Technical system capable of identifying disease-resistant genes by inoculating pathogens in different plant disease systems ) 是由 潘庆华 文健强 张瑞洁 赖琪 王玲 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种在不同植物病害系统中通过病原物的接种即可鉴定抗病基因的技术体系。该方法根据植物病害系统存在的“基因对基因”互作关系,在不同的植物病害系统中鉴定寄主植物抗病基因,具体是从病原物供体菌株中分离克隆其无毒基因并导入受体菌株中而获得重组菌株,将供体菌株、受体菌株及重组菌株分别接种于寄主植物品种上而获得“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之“三连反应型”；再通过比较、确认“三连反应型”之间具有的遗传背景的逻辑性及无毒基因的特异性,由此以既具有遗传背景逻辑性又具有无毒基因特异性的“三连反应型”来鉴定与无毒基因互作的抗病基因。本技术体系具有泛用性,可应用于在不同的植物病害系统中发掘、鉴定及导入抗病基因；本技术体系无需分子生物学实验的条件、经验及技术,通过常规的病原物接种方法即可简易而准确地鉴定抗病基因。(The invention discloses a technical system for identifying disease-resistant genes by inoculating pathogens in different plant disease systems. The method identifies host plant disease-resistant genes in different plant disease systems according to the gene-gene interaction relationship existing in the plant disease systems, and specifically comprises the steps of separating and cloning avirulence genes from pathogen donor strains and introducing the avirulence genes into acceptor strains to obtain recombinant strains, and respectively inoculating the donor strains, the acceptor strains and the recombinant strains on host plant varieties to obtain a triple reaction type of 'donor strains-acceptor strains-recombinant strains'; and comparing and confirming the logicality of the genetic background and the specificity of the avirulence gene between the three-linked reaction types, thereby identifying the disease-resistant gene interacting with the avirulence gene by the three-linked reaction type with the logicality of the genetic background and the specificity of the avirulence gene. The technical system has universality and can be applied to the discovery, identification and introduction of disease-resistant genes in different plant disease systems; the technical system can simply and accurately identify the disease-resistant gene by a conventional pathogen inoculation method without the conditions, experience and technology of molecular biology experiments.)

一种在不同植物病害系统中通过病原物的接种即可鉴定抗病 基因的技术体系

技术领域

本发明属于农业生物技术领域。更具体地，涉及一种在不同植物病害系统中鉴定抗病基因的技术体系。

背景技术

在寄主植物与病原物漫长的协同进化过程中，二者究竟处于什么关系？对此，植物遗传学、微生物学以及植物病理学界进行了长期的探索。二十世纪四十年代著名的美国学者弗洛尔通过对亚麻锈病抗性的遗传研究，提出二者存在“基因对基因”的关系(gene-for-gene；Flor 1942,Phytopathology,32:653-669)。亦即，在寄主植物中，存在抗病基因(resistance gene，R)及感病等位基因(r)；在病原物中，存在无毒基因(avirulence gene，Avr)及毒性等位基因(avr)；只有当抗病基因与无毒基因产生互作时，寄主植物才能表达抗病性。对于如此奇妙的“基因对基因”互作关系，作物遗传育种学、植物病理学以及微生物学等多学科的科学家进行了长期的争论及探索。直至二十世纪九十年代，当植物抗病基因以及与之对应的病原物无毒基因的分离克隆成为可能，二者的互作通过蛋白质互作技术被证明之后，“基因对基因”关系才被认为是二者之间最重要的关系之一(Kearney et al.1990,Nature,346:285-286；Van Kan et al.1991,Molecular Plant-Microbe Interactions,4:52-59；Meeley et al.1992,Plant Cell,4:71-77；Martin et al.1993,Science,262:1432-1436；Mindrinos et al.1994,Cell,78:1089-1099；Jia et al.2000,The EMBOJournal,19:4004-4014；Keen 2000,Annual Review of Phytopathology,338:31-48)。由此，弗洛尔的此项研究也被认为是二十世纪植物病理学领域里程碑的工作，而“基因对基因”学说则被认为是研究寄主植物与病原物相互作用的核心理论之一(Valent 1990,Phytopathology,1990,80:33-36；Keen 2000,Annual Review of Phytopathology,338:31-48)。

自“基因对基因”学说及其原理提出以后，植物病害系统的抗病基因鉴定可以大致分为2个发展阶段：

第一个发展阶段(二十世纪四十～八十年代)：此阶段分子生物学技术(含基因工程学、功能基因组学、蛋白质组学等)尚未充分发展，人们只能根据“基因对基因”学说及其原理，通过构建植物病害系统的鉴别体系【含鉴别品种(differential cultivar)及鉴别菌株(differential isolate)】来推进抗病基因及无毒基因相关的基础性研究(凌忠专等，2004，中国农业科学，37:1849-1859；Atkins et al.1967,Phytopathology,57:297-301；Kiyosawa 1981,Oryza 18:196-203；Kiyosawa 1984,Rice Genetics Newsletter 1:95-97)。所谓的鉴别品种指的是，具有不同抗病基因型的一套代表性品种，以根据其反应型来划分供试菌株的致病型(生理小种)；所谓的鉴别菌株指的是，具有不同无毒基因型的一套代表性菌株，以根据其反应型来划分供试品种的抗病基因型(Atkins et al.1967,Phytopathology,57:297-301；Kiyosawa 1981,Oryza 18:196-203；Kiyosawa 1984,RiceGenetics Newsletter 1:95-97；Wang et al.2017,Molecular Plant-MicrobeInteractions,30:803-812；Zhang et al.2017,Rice,10:46)。

以水稻的稻瘟病模式病害系统为例来作说明。以清泽茂久为首的稻瘟病学者首先利用日本全国稻瘟病生理小种协作组长达7年的调查数据，遴选了具有代表性的7个菌株作为日本稻瘟病系统的鉴别菌株；然后利用该套鉴别菌株对日本全国3000余个水稻品种进行了抗病基因型的分类(12种类型)；继而从各个类型中选择代表性品种，通过常规的遗传杂交后代的分离分析等手段，鉴定了12个抗病基因；最终遴选了9个(尔后升级为12个)具有不同抗病基因型的代表性品种作为日本稻瘟病系统的鉴别品种(清泽茂久1974，农技研报告，D1,pp1-58；清泽茂久及安东郁男1990，稻学大成第三卷(遗传编)，pp361-385；Zhang etal.2017,Rice,10:46)。至二十个世纪八十年代，清泽茂久及其合作者一共鉴定了8个位点14个稻瘟病抗病基因，使之成为整个植物病害系统遗传学研究的先行者及典范(清泽茂久及安东郁男1990，稻学大成第三卷(遗传编)，pp361-385；Zhang et al.2017,Rice,10:46；Zhang et al.2019,Plant Disease,103:2759-2763)。

此阶段的技术局限性在于：(1)利用鉴别体系只能进行大量品种的抗病基因型分类；(2)抗病基因的鉴定主要依赖于常规的遗传分离分析，极少数涉及基于形态性状标记的连锁分析。

第二个发展阶段(二十世纪八十年代～现在)：此阶段分子生物学技术，特别是分子标记技术，功能基因组学技术等领域取得了实质性的进展，基因克隆技术以及测序技术已经逐步成为一般实验室的日常技术。抗病基因的研究进入了崭新的时代。因此，在众多抗病基因的遗传规律已经弄清楚，而且已被定位的情况下，以植物全基因组序列以及由此产生的海量生物信息为基础的抗病基因的克隆及功能研究已经全面展开。一方面，这个时期定位及发掘的抗病基因(含等位基因)数量不断上升，另一方面，这个时期抗病基因克隆的数量也大幅上升(International Rice Genome Sequencing Project 2005,Nature,436:793-800；Sharma et al.2012,Agriculture Research,1:37-52；The 3,000Rice GenomesProject 2014,GigaSci,3:7；Liu and Wang 2016,National Science Review,3:295-308)。

还是以稻瘟病模式病害系统为例来作说明。相对于第一发展阶段，定位的抗病基因由4个(Pis,Pita/Pita-2,Pia,Piz/Piz-t)大幅上升为近100个；克隆的抗病基因由0个大幅上升为30余个(清泽茂久1974，农技研报告，D1,pp1-58；Sharma et al.2012,Agriculture Research,1:37-52；Liu and Wang 2016,National Science Review,3:295-308；Kalia et al.2019,3Biotech,9:209)。在此基础上，人们通过开发并利用抗病基因的连锁标记(针对未克隆的基因)，或者功能特异性标记(针对已克隆的基因)，大大提高了抗病基因发掘、鉴定及导入的效率及准确度(Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321-334；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics 125:1047-1055；Kitazawa etal.2019,Breeding Science,69:68-83)。

此阶段的技术局限性在于：虽然抗病基因连锁标记或功能特异性标记等分子标记技术的应用提高了抗病基因的发掘、鉴定及导入的效率及准确度。但是该类技术操作相对较为复杂、对操作研究人员要求较高；对于田间生产实践仍然需要开发一套更加简易、精确且不依赖于分子标记的常规技术体系来推进抗病基因的发掘、鉴定及导入。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有抗病基因发掘鉴定技术的缺点与不足，首要目的是提供一种更加简易、精确且不依赖于分子标记的常规技术体系以鉴定抗病基因。并对该技术体系的思路及原理，以及利用该技术体系鉴定抗病基因的应用实例进行了展示验证。

本发明的第二个目的是提供上述技术体系在不同的植物病害系统中发掘、鉴定及导入抗病基因的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种在不同的植物病害系统中通过病原物的接种即可鉴定抗病基因的技术体系，包括如下3个基因型清晰的病原物供试菌株：

(1)供体菌株：含有目的基因(特指无毒基因AvrX，下同)，遗传背景为供体(donor)，其基因型(目的基因/遗传背景；下同)记为:AvrX/dn；

(2)受体菌株：含有毒性基因avrX，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:avrX/rp；

(3)重组菌株：含有无毒基因AvrX，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:AvrX/rp；

所述重组菌株是从供体菌株中分离克隆其无毒基因并导入受体菌株中而获得；

(4)由此，可以在该技术体系中对上述供试菌株之间的遗传背景及目的基因进行比较验证，以鉴别寄主植物品种的表型究竟是由供试菌株的目的基因，还是目的基因以外的遗传背景(其他无毒基因)决定的。

本发明上述技术体系的原理及特征在于：

(1)将供体菌株、受体菌株及重组菌株分别接种于寄主植物品种上而获得“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之“三连反应型”；

(2)在任何3个菌株的组合中，全部可能的“三连反应型”都是8个(2³＝8；记为R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-R-S,R-S-S,S-R-S,S-S-R,S-S-S；其中，R,resistant/抗病性；S,susceptible/感病性；下同)；

(3)根据上述3个供试菌株的目的基因及其遗传背景推断，其中3个“三连反应型”(R-R-S,S-R-S,S-S-R)在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间都未能表现具有遗传背景的逻辑性，因此是实际上不可能存在的反应型；

(4)在5个实际存在的“三连反应型”(R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-S-S,S-S-S)中，其中4个(R-R-R,S-R-R,R-S-S,S-S-S)在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间都能表现具有遗传背景的逻辑性，但不具有目的基因的特异性，因此这些反应型是实际上存在但不能推定目的基因对应的抗病基因；

(5)只有“R-S-R”在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间表现既具有遗传背景的逻辑性又具有目的基因的特异性，由此可以推定供试品种含有与AvrX对应的功能性抗病基因X。

进一步地，在本发明上述技术体系中，所述“三连反应型”之间具有遗传背景的逻辑性是指3个供试菌株之间除了特定的无毒基因AvrX之外，遗传背景(包括但不限于其他无毒基因)决定寄主植物表型的可能性。

进一步地，在本发明上述技术体系中，所述“三连反应型”之间具有无毒基因的特异性是指3个供试菌株之间由特定的无毒基因AvrX与对应的抗病基因X互作而决定寄主植物表型的必然性。

同时，本发明上述技术体系在不同的植物病害系统中进行抗病基因的发掘、鉴定及导入等方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

其中，所述植物病害系统包括病原菌及其寄主品种。具体地，所述不同的植物病害系统包括但不限于水稻病害系统。

基于本发明上述提供的技术体系，具体而言：

本发明涉及在植物病害系统中存在的“基因对基因”互作关系的学说(Flor1942,Phytopathology,32:653-669)(图2)。其中，

在寄主植物中，存在抗病基因及其感病等位基因，一般地，抗病基因对感病基因为显性；

在病原物中，存在无毒基因及其毒性等位基因，一般地，无毒基因对毒性基因为显性；

只有当抗病基因与无毒基因产生互作时，寄主植物才能表达抗病性；

反过来推断，在任何植物病害系统中只要寄主植物表达抗病性，则寄主植物的抗病基因与病原物的无毒基因都是具有功能性的，而且二者产生了直接或者间接的互作；

特别地，由于抗病基因对感病基因为隐性，或者无毒基因对毒性基因为隐性的条件下，二者之间的“基因对基因”互作关系迄今尚未被发现、验证，此等案例被排除于本申请专利中。

本发明提供一种在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用无毒基因鉴定抗病基因的原理及技术体系(图3)。其中，

(1)假定8个寄主植物品种(分别含有8个不同的抗病基因I～VIII)参加了试验。其中，抗病基因III与无毒基因AvrIII存在“基因对基因”的特异性互作；

(2)假定3个病原物菌株参加了试验。其中，

供体菌株：含有目的基因(特指无毒基因AvrIII，下同)，遗传背景为供体(donor)，其基因型(目的基因/遗传背景；下同)记为:AvrIII/dn；

受体菌株：含有毒性基因avrIII，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:avrIII/rp；

重组菌株：含有无毒基因AvrIII，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:AvrIII/rp。

因此，在“供体菌株与受体菌株”之间，目的基因及遗传背景皆不相同；在“供体菌株与重组菌株”之间，目的基因相同而遗传背景不相同；而在“受体菌株与重组菌株”之间，则目的基因不相同而遗传背景相同。由此，可以在该技术体系中对供试菌株之间的遗传背景及目的基因进行比较验证，以鉴别寄主植物品种的表现型究竟是由供试菌株的目的基因，还是目的基因以外的遗传背景(包括但不限于其他无毒基因)决定的。

(3)在任何3个菌株的组合中【以“供体菌株-受体菌株-重组菌株”为例来作说明，三者之间的顺序并不影响其中的逻辑关系及推理结果，下同】，全部可能的“三连反应型”都是8个(2³＝8；R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-R-S,R-S-S,S-R-S,S-S-R,S-S-S)；因此，针对8个供试品种则是每个品种对应1个“三连反应型”；

然而，根据上述3个供试菌株的目的基因及其遗传背景推断，其中3个“三连反应型”(R-R-S,S-R-S,S-S-R)在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间都未能表现具有遗传背景的逻辑性，因此是实际上不可能存在的反应型。

进一步地，在5个实际存在的“三连反应型”(R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-S-S,S-S-S)中，其中4个(R-R-R,S-R-R,R-S-S,S-S-S)在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间都能表现具有遗传背景的逻辑性，但不具有目的基因的特异性，因此这些反应型是实际上存在但不能推定目的基因对应的抗病基因；

只有“R-S-R”在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间表现既具有遗传背景的逻辑性又具有目的基因的特异性，由此可以推定供试品种III含有与AvrIII对应的功能性抗病基因III。

综上所述，本发明的原理及技术体系要点在于：

(a)无毒基因是鉴定抗病基因的必要条件；

(b)“供体菌株-受体菌株-重组菌株”三位一体由来的、具有遗传背景逻辑性的“三连反应型”是鉴定其互作的抗病基因的充分条件；

(c)“供体菌株-受体菌株-重组菌株”三位一体由来的、既具有遗传背景逻辑性、又具有目的基因特异性的“三连反应型”则是鉴定其互作的抗病基因的充分必要条件。

本发明提供了基于与稻瘟病菌无毒基因AvrPit的“基因对基因”互作关系，鉴定其对应的抗病基因Pit的实例(图4)。其中，

(1)假定5个水稻品种(分别含有5个不同的抗病基因)参加了试验。其中，无毒基因AvrPit与抗病基因Pit存在“基因对基因”的特异性互作；

(2)假定3个稻瘟病菌株参加了试验。其中，

供体菌株【CHL357；含有无毒基因AvrPit，遗传背景为供体(donor)，其基因型记为:AvrPit/dn】；

受体菌株【Guy11；含有毒性基因avrPit，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:avrPit/rp】；

重组菌株【At13-9；含有无毒基因AvrPit，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:AvrPit/rp】。

(3)在5个实际存在的“三连反应型”中，只有“R-S-R”才能推定供试品种K59含有与AvrPit对应的抗病基因Pit，而其余4个供试品种则不含有目的基因，亦即其他抗病基因。

(4)上述结果通过利用抗病基因的特异性分子标记Pit^A2338G而获得了鉴证。

本发明提供了在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用鉴别体系鉴定抗病基因的原理比较实例(图5)。其中，

(1)假定7个寄主鉴别品种(分别含有7个不同的抗病基因型I～VII)，以及3个病原物鉴别菌株(分别含有不同的无毒基因型但是其遗传背景及目的基因皆不明)参加了试验；

(2)7个鉴别品种与3个鉴别菌株互作产生的、具有至少1个抗病反应的“三连反应型”则为7个(R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-R-S,R-S-S,S-R-S,S-S-R)。

(3)进一步假定，抗病基因(型)之间具有加性效应，由上述7个“三连反应型”推定的抗病基因(型)如下：

由“R-R-R”推定可能的抗病基因(型)为14个，由此不能推定任何特定的抗病基因(型)；

由“S-R-R”,“R-S-R”或者“R-R-S”推定可能的抗病基因(型)都是4个，由此不能推定任何特定的抗病基因(型)；

由“R-S-S”,“S-R-S”或者“S-S-R”推定可能的抗病基因(型)都是只有1个，由此虽然可以推定对应于鉴别品种的各个抗病基因型。但是，由于鉴别菌株之间的目的基因(无毒基因)及遗传背景皆不明而不能最终确认特定的抗病基因。

综上所述，由于鉴别菌株之间的目的基因及遗传背景皆不明了，因此，此技术体系可以应用于寄主植物品种抗病基因型的分类(全部29种类型)，但不能应用于鉴定特定的抗病基因。

本发明提供了在植物病害系统中利用抗病基因特异性分子标记鉴定抗病基因的比较实例(图6)。其中，

(1)根据稻瘟病Pib抗/感等位基因的序列及结构比较差异开发其特异性的分子标记2个；

(2)1个对照品种(CK:IRBLb-B，携带Pib)，12个日本鉴别品种(Shin 2,AichiAsahi,Fujisaka 5,Kusabue,Tsuyuake,Fukunishiki,K1,PiNo.4,Toride 1,K60,BL1,K59)，以及1个普感品种(CO39)参加了试验；

(3)标记Pib-1^P/A检测的结果显示，对照品种IRBLb-B以及2个供试品种(BL1及CO39)都含有目的基因；

(4)标记Pibdom^P/A检测的结果显示，对照品种IRBLb-B以及1个供试品种(BL1)含有目的基因，而CO39则不含有目的基因；

实际情况是只有对照品种IRBLb-B及供试品种BL1含有目的基因。由此说明，Pib-1^P/A即使是基因特异性分子标记，其鉴定的结果也存在假阳性。

本发明提供的“在不同的植物病害系统中简易而准确地鉴定抗病基因的原理及技术体系”具有重要的应用价值：利用该原理及技术体系，通过常规的病原物接种方法，在不同的植物病害系统中发掘、鉴定及导入抗病基因的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供了一种在不同的植物病害系统中鉴定抗病基因的技术体系：

(1)本发明具有泛用性，不仅适用于稻瘟病病害系统，可以是任何植物病害系统，可应用于在不同的植物病害系统中发掘、鉴定及导入抗病基因；

(2)本发明无需分子生物学实验的条件、经验及技术，通过常规的病原物接种方法即可简易而准确地鉴定抗病基因；

(3)本发明相对于鉴别体系鉴定技术，不仅可以进行寄主植物品种的抗病基因型分离，还可以准确地鉴定功能性的抗病基因；

(4)本发明相对于分子标记鉴定技术，可以准确地鉴定功能性的抗病基因，避免出现非功能性的抗病基因(标记假阳性)。

附图说明

图1.在植物病害体系中简易而准确地鉴定抗病基因的技术路线图。

图2.在植物病害系统中存在的“基因对基因”互作关系；其中，

在寄主植物中，存在抗病基因(R)及其感病等位基因(r)，一般地，抗病基因对感病基因为显性；

在病原物中，存在无毒基因(Avr)及其毒性等位基因(avr)，一般地，无毒基因对毒性基因为显性；

只有当抗病基因与无毒基因产生互作时，寄主植物才能表达抗病性；

反过来推断，在任何植物病害系统中只要寄主植物表达抗病性，则寄主植物的抗病基因与病原物的无毒基因都是具有功能性的，而且二者产生了直接或者间接的互作；

特别地，由于抗病基因对感病基因为隐性，或者无毒基因对毒性基因为隐性的条件下，二者之间的“基因对基因”互作关系迄今尚未被发现、验证，此等案例被排除于本申请专利中。

R,resistance gene(抗病基因)；r,allele of resistance gene(抗病基因之感病等位基因)；

Avr,avirulence gene(无毒基因)；avr,allele of avirulence gene(无毒基因之毒性等位基因)；

R,resistant(抗病性)；S,susceptible(感病性)。

图3.在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用无毒基因鉴定抗病基因的原理及技术体系；

图3a：假定8个寄主植物品种(分别含有8个不同的抗病基因I～VIII)参加了试验，其中抗病基因III与无毒基因AvrIII存在“基因对基因”的特异性互作；

图3b：供体菌株【含有无毒基因AvrIII，遗传背景为供体(donor)，其基因型记为:AvrIII/dn】对8个供试品种的反应型；

图3c：受体菌株【含有毒性基因avrIII，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:avrIII/rp】对8个供试品种的反应型；

图3d：重组菌株【含有无毒基因AvrIII，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:AvrIII/rp】对8个供试品种的反应型；

图3e-f：在任何3个菌株的组合中【以“供体菌株-受体菌株-重组菌株”为例】，全部可能的“三连反应型”都是8个(2³＝8)；因此，针对8个供试品种则是每个品种对应1个“三连反应型”；然而，根据上述3个供试菌株的目的基因及其遗传背景推断，其中3个“三连反应型”(R-R-S,S-R-S,S-S-R)在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间都未能表现具有遗传背景的逻辑性，因此是实际上不可能存在的反应型。进一步地，在5个实际存在的“三连反应型”中(据此可进行寄主品种的抗病基因型分类)，其中4个(R-R-R,S-R-R,R-S-S,S-S-S)在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间都能表现具有遗传背景的逻辑性，但不具有目的基因的特异性，因此这些反应型是实际上可能存在但不能推定目的基因对应的抗病基因；只有“R-S-R”在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间表现既具有遗传背景的逻辑性又具有目的基因的特异性，由此推定供试品种III含有与AvrIII对应的功能性抗病基因III。

R，resistant(抗病性)；S，susceptible(感病性)。

图4.基于与稻瘟病菌无毒基因AvrPit的“基因对基因”互作关系，鉴定其对应的抗病基因Pit的实例；

图4a：假定5个水稻品种(分别含有5个不同的抗病基因)参加了试验；

图4b-c：供体菌株【CHL357；含有无毒基因AvrPit，遗传背景为供体(donor)，其基因型记为:AvrPit/dn】对5个供试品种的反应型；

图4d-e：受体菌株【Guy11；含有毒性基因avrPit，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:avrPit/rp】对5个供试品种的反应型；

图4f-g：重组菌株【At13-9；含有无毒基因AvrPit，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:AvrPit/rp】对5个供试品种的反应型；

在5个实际存在的“三连反应型”中，只有“R-S-R”才能推定供试品种K59含有与AvrPit对应的抗病基因Pit，而其余4个供试品种则不含有该抗病基因，亦即含有其他抗病基因。

图4h：利用抗病基因的特异性分子标记Pit^A2338G对抗病基因Pit的鉴证。左侧为DNA分子量标记，DNA ladder-500bp。

R，resistant(抗病性)；S，susceptible(感病性)。

图5.在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用鉴别体系鉴定抗病基因的原理比较实例；

图5a-d：假定7个寄主植物鉴别品种(分别含有7个不同的抗病基因I～VII)，以及3个病原物鉴别菌株(分别含有不同的无毒基因型但是其遗传背景及目的基因皆不明)参加了试验；由此，7个鉴别品种与3个鉴别菌株互作产生的、具有至少1个抗病反应的“三连反应型”则为7个(R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-R-S,R-S-S,S-R-S,S-S-R)；

图5e：进一步假定，抗病基因(型)之间具有加性效应，由上述7个“三连反应型”推定的抗病基因(型)如下：

由“R-R-R”推定可能的抗病基因(型)为14个，由此不能推定任何特定的抗病基因(型)；

由“S-R-R”,“R-S-R”或者“R-R-S”推定可能的抗病基因(型)都是4个，由此不能推定任何特定的抗病基因(型)；

由“R-S-S”,“S-R-S”或者“S-S-R”推定可能的抗病基因(型)都是只有1个，由此虽然可以推定对应于鉴别品种的各个抗病基因型，但是由于鉴别菌株之间的目的基因(无毒基因)及遗传背景皆不明而不能最终确认特定的抗病基因。亦即鉴别品种抗病基因型中的任一抗病基因都可以控制其抗病性反应。

综上所述，由于鉴别菌株之间的目的基因及遗传背景皆不明了，因此，该技术体系可以应用于寄主植物品种抗病基因型的分类(全部29种类型)，但不能应用于鉴定特定的抗病基因。

R，resistant(抗病性)；S，susceptible(感病性)。

图6.在植物病害系统中基于抗病基因特异性分子标记鉴定抗病基因的比较实例；

图6a:Pib抗/感等位基因的序列及结构比较图及其特异性分子标记的开发；

图6b:1个对照品种(CK:Pib,IRBLb-B)，12个日本鉴别品种(Shin 2,Aichi Asahi,Fujisaka 5,Kusabue,Tsuyuake,Fukunishiki,K1,PiNo.4,Toride 1,K60,BL1,K59)，以及1个普感品种(CO39)参加了试验；

图6c:抗病基因Pib特异性分子标记Pib-1^P/A之PCR扩增产物电泳图。结果表明，对照品种IRBLb-B以及供试品种BL1及CO39都含有Pib；

图6d:抗病基因Pib特异性分子标记Pibdom^P/A之PCR扩增产物电泳图。结果表明，对照品种IRBLb-B以及供试品种BL1含有Pib，而CO39则不含有Pib。

实际情况是只有对照品种IRBLb-B及供试品种BL1含有目的基因。由此说明，标记Pib-1^P/A即使是基因特异性分子标记，其鉴定的结果也存在假阳性。

综上所述，由于抗/感等位基因序列及结构差异的多样化，即使是基因特异性分子标记也难免出现假阳性的鉴定结果。

M,DNA分子量标记，DNA ladder-2000bp。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但是，本发明的实施方式包括但不限于下述的实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，在实施例中所用的技术手段皆为本领域技术人员所熟知的常规手段。

在本发明的实施例部分，阐述了在植物病害系统中存在的“基因对基因”互作关系；在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用无毒基因鉴定抗病基因的原理及技术体系；基于与稻瘟病菌无毒基因AvrPit的“基因对基因”互作关系，鉴定其对应的抗病基因Pit的实例；在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用鉴别体系鉴定抗病基因的原理比较实例；以及在植物病害系统中利用抗病基因特异性分子标记鉴定抗病基因的比较实例。本发明采用的技术路线如图1所示。

在实施例中所用的AvrPit的供体菌株CHL357,以及受体菌株Guy11(Zeng etal.2009,Plant Disease,93:238-242；Hua et al.2012,Theoretical and AppliedGenetics,125:1047-1055；Li et al.2018,BMC Microbiology 18:47；附件图表可在杂志网站获得)；所用的水稻品种：IRBLzt-T,IRBLb-B,IRBLz5-CA,IRBLi-F5,IRBLt-K59，以及Shin 2,Aichi Asahi,Fujisaka 5,Kusabue,Tsuyuake,Fukunishiki,K 1,PiNo.4,Toride1,K60,BL1,K59,CO39(Table S3 inZhai et al.2011,New Phytologist,189:321-334；Table 4 in Zhang et al.2017,Rice,10:46)；所用的稻瘟病抗病基因特异性的分子标记：Pit^A2338G,Pib-1^P/A,Pibdom^P/A(赖琪2019，华南农业大学硕士学位论文；Robert et al.2004,Crop Science,44:1790-1798)皆为本研究领域常用且已在上述文献中公开；AvrPit的重组菌株At13-9则是发明人分离、克隆了AvrPit之后将其导入受体菌株Guy11而构建，已经在发明人申请的“稻瘟病菌无毒基因AvrPit及其应用”专利中公开(201911024985.0)。

实施例1：在植物病害系统中存在的“基因对基因”互作关系(图2)

在植物病害系统中，寄主植物与病原物之间存在“基因对基因”的互作关系(Flor1942,Phytopathology,32:653-669)。其中，

在寄主植物中，存在抗病基因(R)及其感病等位基因(r)，一般地，抗病基因对感病基因为显性；

在病原物中，存在无毒基因(Avr)及其毒性等位基因(avr)，一般地，无毒基因对毒性基因为显性；

只有当抗病基因与无毒基因产生互作时，寄主植物才能表达抗病性；

反过来推断，在任何植物病害系统中只要寄主植物表达抗病性，则寄主植物的抗病基因与病原物的无毒基因都是具有功能性的，而且二者产生了直接或者间接的互作；

特别地，由于抗病基因对感病基因为隐性，或者无毒基因对毒性基因为隐性的条件下，二者之间的“基因对基因”互作关系迄今尚未被发现、验证，此等案例被排除于本申请专利中。

实施例2：在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用无毒基因鉴定抗病基因的原理及技术体系(图3)

(1)假定8个寄主植物品种(分别含有8个不同的抗病基因I～VIII)参加了试验。其中，抗病基因III与无毒基因AvrIII存在“基因对基因”的特异性互作。

(2)假定3个病原物菌株参加了试验。其中，

供体菌株：含有无毒基因AvrIII，遗传背景为供体(donor)，其基因型记为:AvrIII/dn；该菌株为对携带抗病基因III的寄主植物品种表现非致病性(对寄主植物而言则是抗病性)的自然菌株，在“基因对基因”互作明确的条件下，通过常规的接种鉴定即可筛选获得；

受体菌株：含有毒性基因avrIII，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:avrIII/rp；该菌株为对携带抗病基因III的寄主植物品种表现致病性(对寄主植物而言则是感病性)的自然菌株，在“基因对基因”互作明确的条件下，通过常规的接种鉴定即可筛选获得(一般选择对本地区主要抗病品种具有广谱致病性的菌株)；

重组菌株：含有无毒基因AvrIII，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:AvrIII/rp；该菌株为对携带抗病基因III的寄主植物品种表现非致病性(对寄主植物而言则是抗病性)的重组菌株，通过菌株遗传杂交后的多次回交或者转基因等手段，将无毒基因AvrIII导入受体菌株而获得；

因此，在“供体菌株与受体菌株”之间，目的基因及遗传背景皆不相同；在“供体菌株与重组菌株”之间，目的基因相同而遗传背景不相同；而在“受体菌株与重组菌株”之间，目的基因不相同而遗传背景相同。由此，可以在该技术体系中对供试菌株之间的遗传背景及目的基因进行比较验证，以鉴别寄主植物品种的表现型究竟是由供试菌株的目的基因，还是目的基因以外的遗传背景(包括但不限于其他无毒基因)决定的。

(3)因为在任何三位一体的组合中【以“供体菌株-受体菌株-重组菌株”为例来作说明，三者不同顺序的其他组合的推理相同，下同】，全部可能的“三连反应型”都是8个(2³＝8；R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-R-S,R-S-S,S-R-S,S-S-R,S-S-S)，因此，针对8个供试品种则是每个品种对应1个“三连反应型”。各个“三连反应型”的含义及推理如下：

“R-R-R”：寄主品种I对供体菌株、受体菌株及重组菌株都表现抗病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间具有遗传背景的逻辑性但不具有无毒基因的特异性；因此该反应型是实际上可能存在的，但不能据此推定其对应的抗病基因；亦即，该抗病性是由供体菌株及受体菌株共同的其他无毒基因型与寄主品种的其他功能性抗病基因型互作而产生的。

“S-R-R”：寄主品种II对供体菌株表现感病性而对受体菌株及重组菌株表现抗病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间具有遗传背景的逻辑性但不具有无毒基因的特异性；因此该反应型是实际上可能存在的，但不能据此推定其对应的抗病基因；亦即该抗病性是由受体菌株的其他无毒基因与寄主品种的其他功能性抗病基因互作而产生的。

“R-S-R”：寄主品种III对供体菌株及重组菌株都表现抗病性而对受体菌株表现感病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间既具有遗传背景的逻辑性又具有无毒基因的特异性，因为无毒基因相对于毒性基因是显性遗传的，导入受体菌株后将使之从原来的毒性基因型(寄主感病性)转化为无毒性基因型(寄主抗病性)；因此该反应型是实际上可能存在的，而且据此可以推定其对应的抗病基因；亦即寄主品种III对供体菌株及重组菌株都表现抗病性恰恰是由供体菌株的无毒基因III控制的。由此推定寄主品种III含有与AvrIII对应的功能性抗病基因III。

“R-R-S”：寄主品种IV对供体菌株及受体菌株表现抗病性而对重组菌株表现感病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间既不具有遗传背景的逻辑性也不具有无毒基因的特异性，因为在无毒基因显性遗传的条件下，将其导入无毒性的受体菌株也不可能产生毒性的重组菌株，因此该反应型是实际上不可能存在的；亦即如果寄主品种IV对受体菌株表现抗病性，则对重组菌株也一定表现抗病性，反之则不然(如“R-S-R”个案，寄主品种IV对受体菌株表现感病性，而对重组菌株表现抗病性)。

“R-S-S”：寄主品种V对供体菌株表现抗病性，而对受体菌株及重组菌株都表现感病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间具有遗传背景的逻辑性但不具有无毒基因的特异性；因此该反应型是实际上可能存在，但不能据此推定其对应的抗病基因；亦即该抗病性是由供体菌株的其他无毒基因与寄主品种的其他功能性抗病基因互作而产生的。

“S-R-S”：寄主品种VI对供体菌株及重组菌株表现感病性而对受体菌株表现抗病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间既不具有遗传背景的逻辑性也不具有无毒基因的特异性，因为在无毒基因显性遗传的条件下，即使导入的是隐性的毒性基因(而不是无毒基因)，也不能把受体菌株原来的无毒性基因型(寄主抗病性)转化为重组菌株的毒性基因型(寄主感病性)，因此该反应型是实际上不可能存在的；亦即如果寄主品种VI对受体菌株表现抗病性，则对重组菌株也一定表现抗病性(如“R-R-S”个案)。

“S-S-R”：寄主品种VII对供体菌株及受体菌株表现感病性而对重组菌株表现抗病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间既不具有遗传背景的逻辑性也不具有无毒基因的特异性，因为在无毒基因显性遗传的条件下，即使导入的是隐性的毒性基因(而不是无毒基因)，也不能把受体菌株原来的毒性基因型(寄主感病性)转化为重组菌株的无毒性基因型(寄主抗病性)，因此该反应型是实际上不可能存在的；亦即如果寄主品种VII对供体菌株及受体菌株都表现感病性，则对重组菌株也一定表现抗感病性(如“S-S-S”个案)。

“S-S-S”：寄主品种VII对供体菌株、受体菌株及重组菌株都表现感病性，说明该反应型在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间具有遗传背景的逻辑性但不具有无毒基因特异性；因此该反应型是实际上可能存在，但不能据此推定其对应的抗病基因；亦即该品种对3个供试菌株而言论，不含有具有功能性的抗病基因(对其他菌株而言则可能是功能性的抗病基因)。

综上所述，本发明的原理及技术体系要点在于：

(a)无毒基因是鉴定抗病基因的必要条件；

(b)“供体菌株-受体菌株-重组菌株”三位一体由来的、具有遗传背景逻辑性的“三连反应型”是鉴定其互作的抗病基因的充分条件；

(c)“供体菌株-受体菌株-重组菌株”三位一体由来的、既具有遗传背景逻辑性、又具有目的基因特异性的“三连反应型”则是鉴定其互作的抗病基因的充分必要条件。

实施例3：基于与稻瘟病菌无毒基因AvrPit的“基因对基因”互作关系，鉴定其对应的抗病基因Pit的实例(图4)

(1)5个水稻品种分别含有5个不同的抗病基因参加了试验；其中，

品种IRBLzt-T携带稻瘟病抗病基因Piz-t；品种IRBLb-B携带稻瘟病抗病基因Pib；品种K59携带稻瘟病抗病基因Pit；品种IRBLz5-CA携带稻瘟病抗病基因Pi2；品种IRBLi-F5携带稻瘟病抗病基因Pii。

(2)3个稻瘟病菌株参加了试验；其中，

供体菌株CHL357：含有无毒基因AvrPit，遗传背景为供体(donor)，其基因型记为:AvrPit/dn；

受体菌株Guy11：含有毒性基因avrPit，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:avrPit/rp；

重组菌株At13-9：含有无毒基因AvrPit，遗传背景为受体(recipient)，其基因型记为:AvrPit/rp；

因此，从遗传逻辑上推断，只有在无毒基因AvrPit与抗病基因Pit之间产生特异性的“基因对基因”互作。

(3)通过本领域常规的稻瘟病菌接种方法(Pan et al.1996,Phytopathology,1071-1075)将3个供试菌株分别接种于5个供试品种的叶片上，结果表明，

品种IRBLzt-T对“供体菌株-受体菌株-重组菌株”产生的“三连反应型”为“R-R-R”；

品种RBLb-B对“供体菌株-受体菌株-重组菌株”产生的“三连反应型”为“S-R-R”；

品种K59对“供体菌株-受体菌株-重组菌株”产生的“三连反应型”为“R-S-R”；

品种IRBLz5-CA对“供体菌株-受体菌株-重组菌株”产生的“三连反应型”为“R-S-S”；

品种IRBLi-F5对“供体菌株-受体菌株-重组菌株”产生的“三连反应型”为“S-S-S”；

在上述5个实际存在的“三连反应型”中，只有“R-S-R”在“供体菌株-受体菌株-重组菌株”之间既具有遗传背景的逻辑性又具有无毒基因的特异性，因此推定供试品种K59含有与AvrPit互作的抗病基因Pit，而其余4个供试品种则不含Pit，亦即携带其他抗病基因。此推断与实际情况相符。

(4)利用抗病基因的特异性分子标记Pit^A2338G，通过下述的实验程序，对5个供试品种进行了抗病基因Pit的鉴证，结果表明，只有供试品种K59显示抗病基因Pit的特异性条带。由此验证了上述结果的正确性。

稻瘟病抗病基因Pit特异性分子标记Pit^A2338G检测的实验程序：

(a)Pit特异性分子标记的设计：根据NCBI发布的稻瘟病抗病基因Pit的序列，通过多个抗、感品种序列比对，针对其突变位点Pit^A2338G设计dCAPS标记。简言之，其引物先利用在线软件dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行设计，再利用引物设计软件Primer Primer 5.0进行确认(赖琪2019，华南农业大学硕士学位论文)。引物序列如下：

SEQ ID NO.1(Pit^A2338G-F；5’-3’):CTTGTCGGGTTCCCTGGTGTAA

SEQ ID NO.2(Pit^A2338G-R；5’-3’):ATCTGGCCTACTGGTGGAAGCT

(b)Pit特异性分子标记Pit^A2338G的PCR扩增：利用上述引物对5个水稻供试品种进行PCR扩增。PCR扩增体系(20.0μL)如下：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)：2.0μL

dNTP Mixture(2.5mM each)：2.0μL

正向引物(10μM)：1.0μL

反向引物(10μM)：1.0μL

TaKaRarTaq(5U/μL)：0.1μL

DNA模板(30ng/μL)：1.0μL

ddH₂O：12.9μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸5min)，最后72℃延伸5min，10℃产物保存备用。

(c)Pit特异性分子标记Pit^A2338G的检测：各个品种的PCR产物按照如下程序进行酶切检测。dCAPS标记酶切反应体系(10μL)如下：

10×酶切缓冲液：1.0μL

PCR扩增产物：2.0μL

限制性内切酶(Hind III；3Unit/μl)：0.3μL

ddH₂O：6.7μL

将上述混合液置于恒温金属浴中37℃进行酶切反应，时间3h。

在每管酶切产物中加入10μL的上样缓冲液并混匀，用微量进样器取1μL产物，通过常规的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法(赖琪2019，华南农业大学硕士学位论文)进行分子标记的检测、记录。

结果表明，在上述5个供试品种中，只有K59显示Pit特异性的条带。由此验证了基于本发明的原理及技术体系检测抗病基因的可靠性。

实施例4：在植物病害系统中基于“基因对基因”互作关系，利用鉴别体系鉴定抗病基因的原理比较实例(图5)

(1)一般地，植物病害系统的鉴别体系包含7个以上的寄主鉴别品种，以及7个以上的病原物鉴别菌株(Liu et al.2017,Plant Disease,101:1522-1532；Zhang et al.2017,Rice,10:46；Fernando et al.2018,Plant Disease,102:790-798；Jindal et al.2019,Plant Disease,103:1450-1457；Paczos-Grzede et al.2019,Plant Disease,103:1559-1564)。为了原理比较的简单化，在此假定7个寄主鉴别品种(分别含有7个不同的抗病基因型I～VII)，以及3个病原物鉴别菌株(A，B，C分别含有不同的无毒基因型但是其遗传背景及目的基因皆不明)参加了试验；

(2)7个鉴别品种与3个鉴别菌株互作产生全部可能的“三连反应型”则为8个(2³＝8；R-R-R,S-R-R,R-S-R,R-R-S,R-S-S,S-R-S,S-S-R,S-S-S)，为了原理比较的简单化，排除没有任何1个抗病反应的“三连反应型”(S-S-S)；

(3)进一步地，为了原理比较的简单化，假定抗病基因(型)之间只有加性效应，7个至少含有1个抗病反应的“三连反应型”的含义及推理如下：

“R-R-R”：寄主品种I对3个鉴别菌株都表现抗病性，由此推定可能的抗病基因(型)为14个，亦即除了鉴别品种I携带的抗病基因I之外，还可能包括其他13种基因(型)组合(I+II,I+III,I+IV,I+V,I+VI,I+VII,II+III,II+IV,II+V,III+IV,III+VI,IV+VII,V+VI+VII)，因为这些组合的“三连反应型”都是一样的(以下同理)；

“S-R-R”：寄主品种II对鉴别菌株A表现感病性而对鉴别菌株B及C都表现抗病性，由此推定可能的抗病基因(型)为4个，亦即除了鉴别品种II携带的抗病基因II之外，还可能包括其他3种基因(型)组合(II+VI,II+VII,VI+VII)，因为这些组合的“三连反应型”也都是一样的；

“R-S-R”：寄主品种III对鉴别菌株A及C都表现抗病性而对鉴别菌株B表现感病性，由此推定可能的抗病基因(型)为4个，亦即除了鉴别品种III携带的抗病基因III之外，还可能包括其他3种基因(型)组合(III+V,III+VII,V+VII)，因为这些组合的“三连反应型”也都是一样的；

“R-R-S”：寄主品种IV对鉴别菌株A及B都表现抗病性而对鉴别菌株C表现感病性，由此推定可能的抗病基因(型)也是4个，亦即除了鉴别品种IV携带的抗病基因IV之外，还可能包括其他3种基因(型)组合(IV+V,IV+VI,V+VI)，因为这些组合的“三连反应型”也都是一样的；

“R-S-S”：寄主品种V对鉴别菌株A表现抗病性而对鉴别菌株B及C都表现感病性，由此推定可能的抗病基因(型)只有1个，亦即鉴别品种V携带的抗病基因V，或者该品种含有的其他抗病基因，因为与之对应的无毒基因及其遗传背景不确定(下同)；

“S-R-S”：寄主品种VI对鉴别菌株A及C都表现感病性而对鉴别菌株B都表现抗病性，由此推定可能的抗病基因(型)只有1个，亦即鉴别品种VI携带的抗病基因VI，或者该品种含有的其他抗病基因；

“S-S-R”：寄主品种VII对鉴别菌株A及B都表现感病性而对鉴别菌株C都表现抗病性，由此推定可能的抗病基因(型)只有1个，亦即鉴别品种VII携带的抗病基因VII，或者该品种含有的其他抗病基因；

综上所述，由于鉴别菌株之间的无毒基因及其遗传背景皆不明晰，导致该试验推定的全部可能的抗病基因型达到29个，因此，此技术体系可以应用于寄主植物品种抗病基因型的分类，但不能应用于鉴定特定的抗病基因。

实施例5：在植物病害系统中利用抗病基因特异性分子标记鉴定抗病基因的比较实例(图6)

(1)根据稻瘟病Pib抗/感等位基因的序列及结构比较差异，按照上述实验程序开发其特异性的分子标记2个(Pib-1^P/A,赖琪2019，华南农业大学硕士学位论文；Pibdom^P/A,Robert et al.2014,Crop Science,44:1790-1798)。

引物序列如下：

SEQ ID NO.2(Pib-1^P/A-F；5’-3’):TGTTCGTCTGTTCCACTCGTGA

SEQ ID NO.3(Pib-1^P/A-R；5’-3’):ATATCACCACTTGTTCCCCAGAC

SEQ ID NO.4(Pibdom^P/A-F；5’-3’):GAACAATGCCCAAACTTGAGA

SEQ ID NO.5(Pibdom^P/A-R；5’-3’):GGGTCCACATGTCAGTGAGC

(2)上述2个Pib特异性分子标记的PCR扩增及检测：利用上述引物对14个水稻供试品种(下述)进行PCR扩增及基因型分析。PCR扩增体系(20.0μL)如下：

2×TSINGKE Master Mix(北京擎科)：10.0μL

dNTP Mixture(2.5mM each)：2.0μL

正向引物(10μM)：1.0μL

反向引物(10μM)：1.0μL

DNA模板(30ng/μL)：1.0μL

ddH₂O：15.0μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1～2min)，最后72℃延伸5min，10℃产物保存备用。

在每管酶切产物中加入10μL的上样缓冲液并混匀，用微量进样器取1μL产物，通过常规的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法(赖琪2019，华南农业大学硕士学位论文)进行分子标记的检测、记录。

结果表明，在14个供试品种【1个对照品种(CK:IRBLb-B)，12个日本鉴别品种(Shin2,Aichi Asahi,Fujisaka 5,Kusabue,Tsuyuake,Fukunishiki,K1,PiNo.4,Toride 1,K60,BL1,K59)，以及1个普感品种(CO39)】中，标记Pib-1^P/A显示对照品种IRBLb-B以及2个供试品种(BL1及CO39)都含有目的基因；而标记Pibdom^P/A显示对照品种IRBLb-B以及1个供试品种(BL1)含有目的基因，而CO39则不含有目的基因；实际情况是只有对照品种IRBLb-B及供试品种BL1含有目的基因。由此说明，标记Pib-1^P/A即使是基因特异性分子标记，其鉴定的结果也存在假阳性。因此，由于抗/感等位基因序列及结构差异的多样化，即使是基因特异性分子标记也难免出现假阳性的鉴定结果。

采用本发明的构思、原理及技术体系可以应用于在任何植物病害系统中发掘、鉴定及导入抗病基因。

上述实施例1为在任何植物病害系统中普遍存在并获得了验证的“基因对基因”互作关系；实施例2为本发明的原理及技术体系；实施例3为本发明的原理及技术体系的应用实例；实施例4及5为本发明原理及技术体系的比较实例。本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。