远红染料探针调配物
阅读说明：本技术 远红染料探针调配物 (Far-red dye probe formulations ) 是由 S·奥宾-沃克 M·R·马杰莱西 J·范 J·布斯奎特 于 2019-02-06 设计创作，主要内容包括：公开了包含远红染料探针和非线性表面活性剂或foamban的调配物,其包括液态调配物和冻干调配物。还公开了用于制备冻干远红染料探针调配物的相关方法以及相关的试剂盒和诊断产品。(Formulations comprising a far-red dye probe and a non-linear surfactant or foamban are disclosed, including liquid formulations and lyophilized formulations. Related methods for preparing lyophilized far-red dye probe formulations are also disclosed, as well as related kits and diagnostic products.)
相关申请的交叉引用
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背景技术
包含远红荧光染料的探针广泛用于许多生物科学应用，包含例如体外检测测定、传统和超分辨率定位显微术以及活细胞成像。由于远红荧光染料与其它常用的荧光团和荧光蛋白的光谱重叠有限，因此其也特别便于复用。然而，由于在复原和/或以水性形式储存后荧光信号的显著损失，远红染料探针的配制存在重大挑战。
发明内容
在一方面，本发明提供了稳定的远红染料探针调配物。在一些实施方案中，所述调配物通常包含：远红染料探针，所述远红染料探针包括与载体分子缀合的远红染料；浓度大于约0.05％(v/v)的非线性表面活性剂；以及至少一种缓冲剂，其中所述调配物是水性溶液。在其它实施方案中，所述调配物通常包含：远红染料探针，所述远红染料探针包括与载体分子缀合的远红染料；浓度大于约0.05％(v/v)的foamban；以及至少一种缓冲剂，其中所述调配物是水性溶液。合适的缓冲剂是Tris；在一些此类变型中，Tris缓冲剂以约5mM到约50mM的浓度存在。特别合适的远红染料包含远红花青染料，如例如Cyanine5或Cyanine5.5。
在如上所述的包含非线性表面活性剂的稳定的远红染料探针调配物的某些实施方案中，所述非线性表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40或聚山梨醇酯60。在其它变型中，所述非线性表面活性剂是毛地黄皂甙。合适的非线性表面活性剂浓度包含约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、或约0.1％(v/v)到约10％(v/v)的浓度。在一些实施方案中，所述非线性表面活性剂浓度为约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)、约1％(v/v)到约10％(v/v)或约1％(v/v)到约2％(v/v)。
在如上所述的稳定的远红染料探针调配物的一些实施方案中，所述载体分子是核酸，如例如RNA。在其它非互斥的实施方案中，所述远红染料探针进一步包含猝灭剂；在一些此类变型中，所述远红染料探针是分子炬(torch)、分子信标或TaqMan探针。在一些核酸探针实施方案中，所述调配物进一步包含第一扩增寡聚物，其中(i)其中所述远红染料探针包括特异性结合于包含在靶核酸的靶区域内的第一序列的靶杂交序列，(ii)所述第一扩增寡聚物包括特异性结合于包含在所述靶区域内的第二序列的靶杂交序列，并且(iii)所述第一扩增寡聚物被配置成在包括所述靶核酸作为模板的扩增测定中产生含有所述靶区域的扩增产物。在如上所述的进一步含有第一扩增寡聚物的一些实施方案中，所述调配物进一步包含第二扩增寡聚物，所述第二扩增寡聚物包括特异性结合于包含在所述靶区域内的第三序列的靶杂交序列，其中所述第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物被配置成在所述扩增测定的多个循环中扩增所述靶区域。在进一步含有第一扩增寡聚物的调配物的一些变型中，所述第一扩增寡聚物是基于启动子的扩增寡聚物，其进一步包括位于第一靶杂交序列的5'的启动子序列。如上所述的包括核酸远红染料探针并进一步含有第一扩增寡聚物的调配物可进一步包含一种或多种适于进行扩增测定的另外的组分，例如一种或多种核苷酸三磷酸和/或一种或多种盐或辅因子。
在另一方面，本发明提供了一种制备稳定的冻干远红染料探针调配物的方法。所述方法通常包括(a)提供如上所述的稳定的远红染料探针调配物；以及(b)冻干所述水性溶液以形成所述冻干远红染料探针调配物。在另一方面，本发明提供了通过前述方法制备的稳定的冻干远红染料探针调配物。
在另一方面，本发明提供了稳定的冻干远红染料探针调配物，其使得能够复原为如上所述的水性调配物。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括(i)第一密封容器，所述第一密封容器含有如上所述的冻干远红染料探针调配物；以及(ii)第二密封容器，所述第二密封容器含有稀释剂。在一些实施方案中，所述稀释剂含有所述非线性表面活性剂或foamban；在一些此类实施方案中，所述非线性表面活性剂或foamban以大于约0.05％(v/v)的浓度存在于所述稀释剂中(例如，约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、或约0.5％(v/v)到约0.5％(v/v)到约5％(v/v))。
在仍另一方面，本发明提供了一种制备稳定的水性远红染料探针调配物的方法。在一些实施方案中，所述方法通常包括(a)提供如上所述的冻干远红染料探针调配物；以及(b)将所述冻干远红染料探针调配物溶解在稀释剂中，以提供复原的调配物。在一些实施方案中，所述稀释剂含有所述非线性表面活性剂或foamban；在一些此类实施方案中，所述非线性表面活性剂或foamban以大于约0.05％(v/v)的浓度存在于所述稀释剂中(例如，约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、或约0.5％(v/v)到约0.5％(v/v)到约5％(v/v))。
在其它实施方案中，制备稳定的水性远红染料探针调配物的方法通常包括(a)提供冻干的远红染料探针调配物，使得能够复原成包括至少一种缓冲剂和远红染料探针的水性溶液，所述远红染料探针包含与载体分子缀合的远红染料；以及(b)将所述冻干远红染料探针调配物溶解在稀释剂中以提供复原的调配物，其中所述冻干的远红染料探针调配物和所述稀释剂中的至少一种包含非线性表面活性剂或foamban，并且其中所述复原的调配物包含浓度大于约0.05％(v/v)的非线性表面活性剂或foamban。在一些实施方案中，所述冻干远红染料探针调配物和所述稀释剂两者都包含所述非线性表面活性剂或foamban。在一些实施方案中，所述方法进一步包含通过冻干包含远红染料探针和至少一种缓冲剂的水性溶液来制备所述冻干远红染料探针调配物。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括：(i)第一密封容器，所述第一密封容器含有冻干远红染料探针调配物，所述调配物使得能够复原为包含至少一种缓冲剂和远红染料探针的水性溶液，所述远红染料探针包含与载体分子缀合的远红染料；以及(ii)第二密封容器，其含有稀释剂，其中所述冻干远红染料探针调配物和所述稀释剂中的至少一种包含非线性表面活性剂或foamban，并且其中所述冻干远红染料探针调配物在所述稀释剂中的复原提供了大于约0.05％(v/v)的最终非线性表面活性剂或foamban浓度。在一些实施方案中，所述冻干远红染料探针调配物和所述稀释剂两者都包含所述非线性表面活性剂或foamban。
在仍另一个方面，本发明提供了一种诊断产品，其包括如上所述的含有稳定的远红染料探针调配物的密封容器。
参考本发明的以下详细描述，本发明的这些方面和其它方面将变得清楚。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所描述的方法和组合物相关的本领域普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，以下术语和短语具有赋予它们的含义，除非另有说明。
术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数个指示物，除非上下文中另外明确指出。
如本文所用，术语“远红染料”是指发射最大值为约630nm到约800nm的荧光分子。在一些实施方案中，远红染料的发射最大值为约630nm到约750nm、约640nm到约750nm、约630nm到约700nm、约640nm到约700nm、约630nm到约680nm或约640nm到约680nm。典型地，远红染料由长波长激发源(例如，提供约625nm到约655nm波长的激光源)激发。
如本文所用，术语“载体分子”是指可以共价键合到远红染料上的生物或非生物组分。标记的载体分子可用作用于监测或检测一个或多个体外、原位或体内生物或生物化学目标、过程或反应的探针。这些组分可以包含例如核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、多糖、药物、激素、脂质、脂蛋白、脂质组装物、合成聚合物、聚合物微粒及其组合。在一些变型中，载体分子包括能够与另一个分子进行特异性结合相互作用的部分或区域(例如，核酸载体分子的靶杂交序列，或蛋白质的结合位点(如例如，抗体的抗原结合位点))。
如本文所用，“共价键合”表示直接共价连接或通过对应于接头部分的多个原子。
在提及本文所述含有表面活性剂的冻干远红染料探针调配物时，术语“稳定的”是指在从冻干形式(第0天)复原成水性形式时和在复原的调配物在30天内在2-8℃下复原和储存30天后(第30天)用于检测测定时，远红染料探针调配物在第30天相对于第0天表现出相对荧光单位(RFU)下降小于约20％。当用于指本文所述含有表面活性剂的水性远红染料探针调配物时，术语“稳定的”是指水性远红染料探针调配物或者(a)由上述稳定的冻干调配物复原而来，或者(b)可以冻干以产生上述稳定的冻干调配物。在一些变型中，稳定的远红染料探针调配物表现出小于约15％的RFU下降、小于约12％的下降或小于约10％的RFU下降。
如本文所用，术语“非线性表面活性剂”是指具有支链结构的表面活性剂。非线性表面活性剂可以包含一个或多个环结构，其可以在例如主链和/或一个或多个支链中。示例性非线性表面活性剂包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和毛地黄皂甙。在某些变型中，非线性表面活性剂是非离子的。
如本文所用，术语“稳定化表面活性剂”是指非线性表面活性剂或foamban。
“核酸”是指包括两个或更多个共价键合的核苷或者具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚体化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其它连接而连接在一起形成多核苷酸。核酸包括RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“主链”可以由多种连接构成，包含糖-磷酸二酯连接、肽-核酸连接(在“肽核酸”或PNA中，参见PCT号：WO95/32305)、硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接或其组合中的一种或多种。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代物(例如，2'甲氧基取代物和2'卤化物取代物(例如2'-F))的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(如肌苷、5-甲基异胞嘧啶、异鸟嘌呤；《核酸的生物化学(The Biochemistry of the NucleicAcids)》,5-36,Adams等人编辑,第11版,1992；Abraham等人,《生物技术(BioTechniques)》(2007),43:617-24)，其包含嘌呤碱基或嘧啶碱基的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基、在2、6和/或8位具有改变或替代取代基的嘌呤碱基(如，2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶)以及吡唑并化合物(诸如，未取代或3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶)；美国专利第5,378,825号、第6,949,367号和PCT号：WO 93/13121)。核酸可以包含“无碱基”残基，其中主链的一个或多个残基不包含含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可以仅包含在RNA和DNA中发现的常规糖、碱基和连接，或者可以包括常规组分和取代物(例如，由2'甲氧基主链连接的常规碱基，或者包含常规碱基和一种或多种碱基类似物的混合物的核酸)。核酸可以包括“锁核酸”(LNA)，其中一个或多个核苷酸单体具有锁定在模拟糖构象的RNA中的双环呋喃糖单元，这增强了对单链RNA(ssRNA)、单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)中互补序列的杂交亲和力(Vester等人,《生物化学(Biochemistry)》,43:13233-41,2004)。核酸可以包含经修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如，添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。体外制备核酸的合成方法在本领域中是众所周知的，尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸。
如本文所用，“核苷酸”是由磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基组成的核酸的亚单位。在RNA中发现的5-碳糖是核糖。在DNA中，5-碳糖是2'-脱氧核糖。这一术语还包含这类亚单位的类似物，如核糖的2'位的甲氧基(2'-O-Me)。
如本文所用，“靶核酸”是包含待检测靶序列的核酸。靶核酸可以是本文所述的DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。除了靶序列，靶核酸还可以包含其它序列。
如本文所用，术语“靶序列”是指待检测的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包括在检测过程中(例如，基于扩增的检测测定，如例如，TMA或PCR)寡核苷酸(例如，探针寡核苷酸、引发寡核苷酸和/或启动子寡核苷酸)与之复合的复合序列。当靶核酸最初是单链时，术语“靶序列”也指与靶核酸中存在的“靶序列”互补的序列。当靶核酸最初是双链时，术语“靶序列”指有义(+)链和反义(-)链两者。在选择靶序列时，本领域技术人员将理解，应该选择“独特的”序列，以便区分不相关或密切相关的靶核酸。
“靶杂交序列”在本文中用于指被配置成与靶核酸序列杂交的寡聚物部分。优选地，靶杂交序列被配置成与靶核酸序列特异性杂交。靶杂交序列可以与靶序列的一部分100％互补，但不是必须的，该靶杂交序列配置成与该靶序列的一部分杂交。靶杂交序列也可以包含相对于靶序列的***、缺失和/或经取代的核苷酸残基。例如，当靶核酸是一个物种内的多种菌株(例如，细菌物种或病毒物种的各种菌株)时，靶杂交序列与靶序列的互补性可能低于100％。应当理解，存在其它原因将靶杂交序列配置成与靶核酸具有小于100％的互补性。
如本文所用，术语“区域”是指核酸的一部分，其中所述部分比整个核酸小。例如，当提及的核酸是基于启动子的扩增寡聚物时，术语“区域”可用于指整个寡核苷酸的较小启动子部分。类似地，也仅作为实例，当核酸是靶核酸时，术语“区域”可用于指核酸的较小区域，其中所述较小区域被一种或多种寡核苷酸靶向。
可互换的术语“寡聚物”、“寡”和“寡核苷酸”是指具有通常少于1,000个核苷酸(nt)残基的核酸，包括处于下限为约5nt残基且上限为约500至900nt残基的范围内的聚合物。在一些实施方案中，寡核苷酸处于下限为约12至15nt且上限为约50至600nt的大小范围内，而其它实施方案处于下限为约15至20nt且上限为约22至100nt的范围内。寡核苷酸可以从天然存在的来源中纯化或可以使用多种众所周知的酶或化学方法中的任何一种来进行合成。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；相反，其通常用于涵盖本文所述的所有此类试剂。寡核苷酸可以发挥各种不同的功能。例如，如果寡核苷酸对互补链具有特异性并能够与互补链进行杂交，并且可以在存在核酸聚合酶的情况下进一步延伸，则所述寡核苷酸可以用作引物；如果寡核苷酸含有被RNA聚合酶识别的序列并允许转录，则这种寡核苷酸可以用作引物并提供启动子(例如，T7引物)；以及如果寡核苷酸能够与靶核酸或其扩增子进行杂交并进一步提供可检测的部分(例如，远红染料)，则所述寡核苷酸可以起到检测靶核酸的作用。
“扩增寡聚物”是至少其3'端与靶核酸互补，并且与靶核酸或其互补序列杂交并参与核酸扩增反应的寡聚物。扩增寡聚物的实例是与靶核酸杂交的“引物”，并含有在扩增过程中通过聚合酶延伸的3'OH端。扩增寡聚物的另一个实例是不通过聚合酶延伸(例如，因为它具有3'阻断末端)但参与或促进扩增的寡聚物。例如，扩增寡核苷酸的5'区域可包含与靶核酸不互补的启动子序列(其可被称为“启动子引物”或“启动子提供物”)。本领域技术人员将理解，用作引物的扩增寡聚物可被修饰以包含5'启动子序列，并因此用作启动子引物。掺入3'阻断端进一步修饰了启动子引物，所述引物现在能够与靶核酸杂交并提供用于启动转录的上游启动子序列，但不提供用于寡核苷酸延伸的引物。这样的修饰的寡核苷酸在本文中被称为“启动子提供物”寡聚物。扩增寡核苷酸的大小范围包含约10到约70nt长的寡核苷酸(不包含任何启动子序列或聚-A尾)，并且含有与靶核酸序列(或其互补链)区域互补的至少约10个连续碱基，或者甚至至少12个连续碱基。该连续碱基与扩增寡聚物所结合的靶序列至少80％或至少90％或完全互补。扩增寡聚物可任选地包含修饰的核苷酸或类似物，或参与扩增反应但与靶核酸或模板序列不互补或不包含在靶核酸或模板序列中的另外的核苷酸。
如本文所用，“基于启动子的扩增寡聚物”是指启动子引物或启动子提供物。
如本文所用，“启动子”是被DNA依赖性RNA聚合酶(“转录酶”)识别为与核酸结合并在特定位点开始RNA转录的信号的特定核酸序列。
“扩增”是指用于获得靶核酸序列或其互补序列或其片段的多个拷贝的任何已知步骤。所述多个拷贝可以被称为扩增子或扩增产物。已知的扩增方法包含热循环方法和等温扩增方法两者。在一些实施方案中，等温扩增方法是优选的。复制酶介导的扩增、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和转录介导的或转录相关的扩增是核酸扩增方法的非限制性实例。复制酶介导的扩增使用自我复制的RNA分子和复制酶(如QB-复制酶(例如，美国专利第4,786,600号))。PCR扩增使用DNA聚合酶、引物对和热循环来合成dsDNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝(例如，美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；和第4,800,159号)。LCR扩增使用四个或更多个不同寡核苷酸，通过使用多个杂交、接合和变性的循环来扩增靶标和其互补链(例如，美国专利第5,427,930号和第5,516,663号)。SDA使用含有限制性核酸内切酶的识别位点的引物和核酸内切酶，所述核酸内切酶使包括靶序列的半修饰DNA双链的一条链产生切口，由此在一系列引物延伸和链置换步骤中进行扩增(例如，美国专利第5,422,252号；美国专利第5,547,861号；和美国专利第5,648,211号)。扩增方法包括适合于RNA靶核酸扩增的实施方案，如转录介导的扩增(TMA)或NASBA。
“转录相关的扩增”，在本文中也称为“转录介导的扩增”(TMA)，是指使用RNA聚合酶从核酸模板产生多个RNA转录物的核酸扩增。这些方法通常使用RNA聚合酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和包含启动子序列的模板互补的寡核苷酸，并且任选地可包含一个或多个其它寡核苷酸。转录相关的扩增的变型是本领域众所周知的，如先前详细公开的(例如，美国专利第4,868,105号；第5,124,246号；第5,130,238号；第5,399,491号；第5,437,990号；第5,554,516号；和第7,374,885号；以及PCT公开第WO 88/01302号、第WO 88/10315号和第WO 95/03430号)。
术语“扩增子”可与“扩增产物”互换使用，指在扩增过程中产生的核酸分子，其与靶序列中包含的序列互补或同源。这些术语可用于指单链扩增产物、双链扩增产物或双链扩增产物的链之一。
“检测寡核苷酸”和“检测探针寡聚物”在本文中可互换使用，指在促进杂交以允许检测靶序列或扩增的核酸的条件下，与核酸或扩增的核酸中的靶序列特异性杂交的核酸寡聚物。检测可以是直接的(例如，直接与其靶序列杂交的探针)或间接的(例如，通过中间分子结构与其靶标连接的探针)。检测探针寡聚物可以是DNA、RNA、其类似物或其组合。检测探针寡聚物的“靶序列”通常指通过标准碱基配对与探针寡聚物的至少一部分特异性杂交的较大核酸序列中的较小核酸序列。检测探针寡聚物可以包含靶特异性序列和其它有助于探针三维构象的序列(例如，美国专利第5,118,801号；第5,312,728号；第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号；以及美国公开第20060068417号)。
术语“
如本文所用，被称为“分子炬”的结构被设计成包含不同的自互补区域(“闭合结构域”)，该不同的自互补区域通过连接区域(“靶结合域”)连接并在预定的杂交测定条件下彼此杂交。包含靶闭合结构域的核苷酸序列的全部或一部分也可以作为靶结合结构域。因此，靶闭合序列可以包含靶结合序列、非靶结合序列及其组合。
“多肽”或“多肽链”是由肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然产生的还是合成产生的。由约25个氨基酸残基或更少的氨基酸残基构成的多肽通常被称为“肽”。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可以包括非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可由产生该蛋白质的细胞添加到该蛋白质中，并随细胞类型而变化。
“肽适体”是一种特异性结合于靶蛋白并作为环嵌入蛋白质支架中的肽。总体上参见，例如Li等人,Curr.Med.Chem.18:4215-4222,2011。
如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合于抗原的任何免疫球蛋白，以及其抗原结合片段及其工程化的变体。因此，术语“抗体”包括例如多克隆抗体、单克隆抗体和含有完整抗体的抗原互补位的抗原结合抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段)。还包括经遗传工程化改造的完整抗体和片段，如嵌合抗体、人源化抗体、单链Fv片段、单链抗体、双抗体、小抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体等。因此，术语“抗体”被广泛用于包括任何包含抗体的抗原结合位点并能够结合其抗原的蛋白质。
本文中使用的术语“稀释剂”是指适合于改变或实现本文所述的一种或多种示例性或适当浓度的溶液。
术语“容器”是指可将物体或液体放置或容纳在其中以例如进行储存的物品(例如，保持器、贮藏器、贮槽等)。
本文提到的数值范围(例如，“X到Y”或“从X到Y”)包括限定所述范围的端点和落入所述范围内的所有值。
除非从上下文中明显看出，当一个值被表示为“约”X或“近似”X时，所述的X值应理解为精确到±10％。
发明详述
本发明提供了包含选自非线性表面活性剂和foamban的表面活性剂的远红染料探针的稳定调配物。所述调配物部分基于令人惊讶的观察结果：与不含稳定化表面活性剂的调配物相比，含表面活性剂的调配物当以水性形式储存一段时间时，显示出远红染料探针的荧光信号强度(RFU)的损失减少。不受理论的束缚，本发明的诸位发明人认为，在缓冲液中不存在稳定化表面活性剂的情况下，远红染料探针倾向于随时间推移而聚集形成有组织的结构(例如，胶束)，在该有组织的结构中更非极性的荧光团分子非常紧密地接触并自猝灭，并且在存在稳定化表面活性剂(例如非极性、非线性表面活性剂)的情况下，远红染料探针的聚集被破坏，使得荧光团分子不再非常接近，因此不再能自猝灭。特别合适的非线性表面活性剂包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40和聚山梨醇酯60)和毛地黄皂甙。
在某些实施方案中，所述稳定的远红染料探针调配物是水性调配物。这种调配物可以是例如冻干前调配物或由冻干形式复原的调配物。在一些变型中，所述调配物以水性溶液的形式提供，所述水性溶液含有包含与载体分子缀合的远红染料的远红染料探针、浓度大于约0.05％(v/v)的表面活性剂(其中所述表面活性剂选自非线性表面活性剂和foamban)以及至少一种缓冲剂。在一些实施方案中，表面活性剂以约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.06％(v/v)到约3％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约3％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约0.5％(v/v)到约3％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)、约1％(v/v)到约10％(v/v)或约1％(v/v)到约3％(v/v)的浓度存在。在更具体的变型中，表面活性剂以约0.41％(v/v)、约0.62％(v/v)、约1％(v/v)、约1.24％(v/v)、约1.5％(v/v)、约1.6％(v/v)或约3％(v/v)的浓度存在。
缓冲剂通常以足以维持适于在生物系统(如体外或原位测定)中使用远红染料探针的pH的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲剂以足以维持pH在约5.5到约8.5、约6.0到约8.0、约6.5到约8.0或约6.5到约7.5的范围内的浓度存在。合适的缓冲剂包括Tris(2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇)、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和组氨酸。在某些实施方案中，Tris缓冲剂以约5mM到约50mM或约10mM到约50mM浓度存在。本领域普通技术人员可以容易地确定根据本发明的调配物的缓冲剂的其它合适浓度。
在某些变型中，调配物(例如适于冻干的调配物、由冻干形式复原的调配物，或用于复原为本文所述的水性调配物的冻干调配物)可以含有冻干保护剂。示例性冻干保护剂包括甘油；非还原糖，例如蔗糖、棉子糖或海藻糖；以及氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸或蛋氨酸。冻干保护剂的使用，包含选择合适的浓度以防止载体分子在冻干时发生不可接受的量的降解和/或聚集，在本领域中是众所周知的。在冻干保护剂为甘油的一些变型中，水性调配物中冻干保护剂浓度的范围为约1％(v/v)到约10％(v/v)、约2％(v/v)到约8％(v/v)、或约2％(v/v)到约5％(v/v)。
本文所述的稳定调配物中的远红染料探针的浓度可以根据特定的探针载体分子和期望的用途而变化，并且合适的探针浓度可以由技术人员在特定应用的背景下容易地确定。在某些变型中，远红染料探针(例如，包含核酸载体分子的远红染料探针)以约0.01μM到约50μM、约0.01μM到约5μM、约0.05μM到约500μM、约0.05μM到约100μM、约0.1μM到约100μM或约0.1μM到约50μM的浓度存在于稳定调配物中。在其它变型中，远红染料探针(例如，包括核酸载体分子的远红染料探针)以约0.001mg/mL到约100mg/mL、约0.001mg/mL到约50mg/mL、约0.01mg/mL到约25mg/mL、或约0.01mg/mL到约10mg/mL的浓度存在于稳定调配物中。
根据本发明使用的合适的远红染料包含Cyanine5(Cy5)、Cyanine5.5(Cy5.5)、ALEXA633、ALEXA
根据本发明，可以使用多种载体分子。合适的载体分子可以包含核苷、核苷酸、核酸(例如寡核苷酸)、氨基酸、蛋白质(例如肽、抗体)、多糖、激素、药物、脂质、脂蛋白、脂质组装物、合成聚合物、聚合物微粒及其组合。特别合适的载体分子是包含能够与另一个分子进行特异性结合相互作用的部分或区域的载体分子。
在某些变型中，探针载体分子是特异性结合于靶分子例如靶核酸的核酸，。特别合适的核酸载体分子包括包含靶杂交序列的寡核苷酸，所述靶杂交序列特异性结合于在靶核酸的靶区域内含有的靶序列。寡核苷酸载体分子可以是，例如，DNA或RNA寡聚物，或含有DNA和RNA核苷酸组合的寡聚物，或用修饰的主链合成的寡聚物，例如，包括一个或多个2'-甲氧基取代的核糖核苷酸的寡聚物。在一些实施方案中，包含寡核苷酸载体分子的探针除了远红染料之外还包含猝灭剂，这种组合在荧光共振能量转移(FRET)测定中特别有用；这种探针的具体变型包含，例如，TaqMan检测探针(罗氏分子诊断学公司(Roche MolecularDiagnostics))和“分子信标”(参见，例如，Tyagi等人,Nature Biotechnol.16:49-53,1998；美国专利第5,118,801号和第5,312,728号；每个都通过引用并入本文)。
包括靶杂交序列的寡核苷酸载体分子可以进一步包含非靶杂交序列。包含非靶杂交序列的寡核苷酸探针的具体实施方案包括例如形成通过分子内杂交保持的构象(例如通常称为发夹的构象)的探针。特别合适的发夹探针包括“分子炬”(参见，例如，美国专利第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号，每个都通过引用并入本文)和“分子信标”(参见，例如，Tyagi等人，见上文；US 5,118,801和US 5,312,728，见上文)。使用这种发夹探针的方法在本领域中是众所周知的。在其它实施方案中，寡核苷酸载体分子是基本上不形成由分子内键保持的构象的线性寡聚物。
在其它实施方案中，探针载体分子是蛋白质。特别合适的蛋白质载体分子包括抗体以及对另一种分子具有结合特异性的其它蛋白质，例如肽(例如神经肽、肽激素)、肽适体、抗体结合蛋白、毒素、凝集素、生长因子、细胞因子、酶和酶底物。抗体结合蛋白可以包括例如蛋白A、蛋白G、可溶性Fc受体、蛋白L、抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗IgD、抗IgE及其片段。在一些变型中，肽载体分子能够通过细胞转运机制将缀合的远红染料定位在特定的细胞亚结构中作为细胞器定位肽。在一些变型中，蛋白质载体分子(例如，抗体、肽、肽适体、凝集素)特异性结合于细胞表面分子；细胞表面结合蛋白(如抗体)可用于例如各种细胞成像和流式细胞术应用，包含例如显微镜检查、细胞计数、细胞分选和生物标记检测。
在又其它实施方案中，载体分子包括脂质(例如，具有6到25个碳的脂质)，包括糖脂、磷脂和鞘脂。在一些变型中，载体分子是脂质组装物(例如脂质体)或脂蛋白。一些亲脂性取代基可用于促进缀合远红染料向细胞或细胞器的转运。
将荧光标记与载体分子(包括生物分子如核酸和蛋白质)缀合以产生标记探针的方法在本领域中通常是众所周知的，并且本领域技术人员可以容易地用于制备根据本发明的远红染料探针。
本文所述的包含远红染料探针的稳定调配物可进一步包含一种或多种用于利用探针进行测定的另外的组分。例如，在包含寡核苷酸载体分子的稳定远红染料探针调配物的一些实施方案中，所述调配物进一步含有一种或多种扩增寡聚物，用于产生可在扩增和检测测定中与寡核苷酸特异性杂交的扩增产物。因此，在一些变型中，包含与远红染料探针缀合的寡核苷酸的远红染料探针调配物进一步包含第一扩增寡聚物，并且(i)所述寡核苷酸包含特异性结合于包含在靶核酸靶区域内的第一序列的靶杂交序列，(ii)所述第一扩增寡聚物包含特异性结合于包含在所述靶区域内的第二序列的靶杂交序列，并且(iii)所述第一扩增寡聚物被配置成在包括所述靶核酸作为模板的扩增测定中产生含有所述靶区域的扩增产物。在一些此类实施方案中，所述调配物进一步包含第二扩增寡聚物，所述第二扩增寡聚物包含特异性结合于包含在所述靶区域内的第三序列的靶杂交序列，并且所述第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物被配置成在所述扩增测定的多个循环中扩增所述靶区域。在进一步含有一种或多种扩增寡聚物的调配物的一些变型中，所述一种或多种扩增寡聚物被配置成对靶区域进行转录相关扩增；例如，在一些如上所述的进一步包括第一扩增寡聚物的实施方案中，所述第一扩增寡聚物是基于启动子的扩增寡聚物，其进一步包含位于第一靶杂交序列的5'的启动子序列(例如，T7启动子序列)。在进一步含有一种或多种扩增寡聚物的调配物的另一个非互斥的实施方案中，所述一种或多种扩增寡聚物被配置成进行包括两种或更多种不同阶段的扩增过程的不同阶段(在本文中也称为“多阶段”核酸扩增)；此类扩增系统在例如授予Nelson等人的美国专利第9,139,870号中有所描述，所述专利通过引用并入本文。如上所述的进一步含有一种或多种扩增寡聚物的调配物可以进一步包含一种或多种适合进行扩增测定的另外的组分，如例如盐、辅因子、核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP、UTP)和/或酶(例如，逆转录酶和/或RNA聚合酶)。
在一些实施方案中，如本文所述的稳定的远红染料探针调配物是远红染料探针(例如，寡核苷酸远红染料探针，任选地具有一种或多种用于进行扩增和检测测定的另外的组分)的浓缩制剂，通常用作测定中使用的本体产品(bulk product)。
在典型的变型中，所述调配物在长时间内是稳定的。例如，所述调配物可以稳定至少约两周、至少约一个月、至少约两个月、至少约三个月或至少约六个月。在一些实施方案中，所述调配物稳定至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月或至少约30个月。
如本文所述的稳定的远红染料探针调配物可储存在约-80℃到约40℃、约-20℃到约25℃、约0℃到约25℃、约0℃到约15℃、约0℃到约10℃或约2℃到约8℃的温度下。在各个实施方案中，所述调配物可以储存在约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下。通常，所述调配物在这些范围内是稳定的并保持活性。在一些变型中，调配物在约-80℃到约25℃或约4℃到约25℃下稳定。在更具体的变型中，液态调配物在约-80℃到约-20℃、约-80℃到约4℃或约-80℃到约25℃的温度下是稳定的。在其它具体的变型中，冻干调配物在约4℃到约25℃或约4℃到约40℃的温度下是稳定的。上述温度的中间范围，例如约2℃到约18℃，也是本发明的一部分。例如，打算包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
在特定的实施方案中，为了长期储存，可以将本文所述的水性调配物分装到例如小瓶、安瓿或其它容器中，并根据本领域已知的程序冻干。冻干产品通常表现为粉末或饼状物。然后将容器密封；在一些此类变型中，密封件允许稀释剂随后通过密封件注入容器。由水性调配物制备这种稳定的冻干远红染料探针调配物的方法以及通过这种方法制备的冻干调配物是本发明另外的方面。在又另一方面，本发明提供了使得能够复原为本文所述的水性远红染料探针调配物的稳定的冻干远红染料探针调配物。
本发明还涵盖由本文所述的冻干调配物制备稳定的水性远红染料探针调配物的方法；这些方法通常包括将冻干的远红染料探针调配物溶解在合适的稀释剂中，以提供复原的调配物。技术人员可以根据例如远红染料探针的预期用途容易地选择合适的稀释剂，并且所述稀释剂可以包含例如水或含有缓冲剂(例如，Tris)的水性溶液。在一些实施方案中，稀释剂包含稳定化表面活性剂，例如包含在稳定的冻干调配物中的表面活性剂。因此，在一些变型中，所述稀释剂含有非线性表面活性剂(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯或毛地黄皂甙)或foamban；在一些此类实施方案中，稳定化表面活性剂以约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.06％(v/v)到约5％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约5％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)或约0.5％(v/v)到约5％(v/v)的浓度存在于稀释剂中。
在一个相关的方面，本文所述的水性稳定的远红染料探针调配物通过通常包含以下步骤的方法制备：(a)提供冻干的远红染料探针调配物，所述调配物使得能够复原为包含至少一种缓冲剂和远红染料探针的水性溶液，所述远红染料探针含与载体分子缀合的远红染料，和(b)将(a)的冻干的远红染料探针调配物溶解在稀释剂中以提供复原的调配物，其中所述冻干的远红染料探针调配物和所述稀释剂中的至少一种含有非线性表面活性剂或foamban，并且其中所述复原的调配物含有浓度大于约0.05％(v/v)的非线性表面活性剂或foamban。在一些实施方案中，仅所述冻干调配物包含稳定化表面活性剂；在一些此类变型中，稳定化表面活性剂以约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)、约1％(v/v)到约10％(v/v)的浓度存在于所述冻干调配物衍生自的水性溶液中。在其它实施方案中，仅所述稀释剂包含稳定化表面活性剂；在一些此类变型中，稳定化表面活性剂以约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)或约1％(v/v)到约10％(v/v)的浓度存在于稀释剂中。在又另一个实施方案中，冻干远红染料探针调配物和稀释剂两者都含有非线性表面活性剂或foamban；在一些此类变型中，所述稳定化表面活性剂以被配置成在冻干调配物在稀释剂中复原时产生约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)、约1％(v/v)到约10％(v/v)的最终表面活性剂浓度的浓度存在于冻干调配物和稀释剂中。上述方法可进一步包括通过冻干包含远红染料探针和至少一种缓冲剂的水性溶液来制备所述冻干远红染料探针调配物。
在本发明的某些方面，含有如本文所述的稳定的冻干远红染料探针调配物的容器在试剂盒中提供，所述试剂盒具有含有稀释剂的第二容器。所述稀释剂可以含有非线性表面活性剂或foamban，例如如上面关于从冻干调配物制备复原的调配物所讨论的。远红染料探针调配物和稀释剂可以包装在多种不同的实施方案中，并且本领域技术人员将会理解，本发明包括许多不同的试剂盒配置。例如，对于其中远红染料探针包括含有特异性结合于核酸靶区域的靶杂交序列的寡核苷酸载体分子的实施方案，试剂盒可以进一步包含含有一种或多种用于扩增靶区域的扩增寡聚物的第三容器。在一些远红染料探针调配物包括特异性结合于靶区域的扩增寡聚物的变型中，第三容器可以包含特异性结合于靶区域并且被配置成在扩增测定中产生含有靶区域的扩增产物的第二扩增寡聚物；此类试剂盒实施方案可以用于例如多阶段扩增系统，如例如授予Nelson等人的美国专利第9,139,870号中所描述的，所述专利通过引用并入本文。用于扩增和检测测定的包含寡核苷酸远红染料探针的试剂盒可以含有适于进行体外扩增的其它试剂，如例如缓冲液、盐溶液、合适的核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP、UTP)和/或酶(例如，逆转录酶和/或RNA聚合酶)。在某些实施方案中，试剂盒进一步包含用于实践根据本发明的方法的一组说明书，其中所述说明书可以与试剂盒或其组分的包装***物和/或包装相关。
在一个相关方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括：(i)第一密封容器，所述第一密封容器含有冻干远红染料探针调配物，所述调配物使得能够复原为包含至少一种缓冲剂和远红染料探针的水性溶液，所述远红染料探针包含与载体分子缀合的远红染料；以及(ii)第二密封容器，其含有稀释剂，其中所述冻干远红染料探针调配物和所述稀释剂中的至少一种包含非线性表面活性剂或foamban，并且其中所述冻干远红染料探针调配物在所述稀释剂中的复原提供了大于约0.05％(v/v)的最终非线性表面活性剂或foamban浓度。在一些实施方案中，仅所述冻干调配物包含稳定化表面活性剂；在一些此类变型中，稳定化表面活性剂以约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)、约1％(v/v)到约10％(v/v)的浓度存在于所述冻干调配物衍生自的水性溶液中。在其它实施方案中，仅所述稀释剂包含稳定化表面活性剂；在一些此类变型中，稳定化表面活性剂以约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)或约1％(v/v)到约10％(v/v)的浓度存在于稀释剂中。在又另一个实施方案中，冻干远红染料探针调配物和稀释剂两者都含有非线性表面活性剂或foamban；在一些此类变型中，所述稳定化表面活性剂以被配置成在冻干调配物在稀释剂中复原时产生约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)、约1％(v/v)到约10％(v/v)的最终表面活性剂浓度的浓度存在于冻干调配物和稀释剂中。如前所述，远红染料探针调配物和稀释剂可以包装在多种不同的实施方案中，并且本领域技术人员将会理解，本发明包括许多不同的试剂盒配置。
在又另一个方面，本发明提供了一种诊断产品，其包含含有如上所述的稳定的远红染料探针调配物的密封容器。在一些变型中，稳定的远红染料调配物是本文所述的冻干调配物。
本发明通过以下非限制性实例进一步说明。
实施例
除非另有说明，否则本文所述基于RT-TMA的测定中常用的试剂包括以下试剂。靶 捕获试剂(TCR)配方：250mM HEPES、1.88M LiCl、310mM LiOH、100mM EDTA，pH为6.4，和250μg/ml顺磁颗粒(0.7-1.05微米颗粒，具有与其共价结合的(dT)14寡聚物(SEQ ID NO:20)的Sera-MagTM MG-CM)。洗涤溶液配方：10mM HEPES、150mM NaCl、6.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3％(v/v)乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯和0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠，pH为7.5。扩增试剂和启动子试剂配方：11.61mM Tris碱、14.94mM Tris-HCl、28.5mM MgCl2、23.30mM KCl、3.3％甘油、0.02％PRO CLIN 300、0.05mM二水合乙酸锌、0.76mM dATP、0.76mM dCTP、0.76mM dGTP和0.76mM dTTP、6.50mM ATP、6.50mM CTP和6.50mM GTP以及7.50mM UTP，向其中添加引物。酶试剂配方：57.46mM HEPES、49.58mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.98mM EDTA游离酸、0.039mM EDTA二钠二水合物、0.10v/v TRITON X-100、49.61mM KCl、0.20v/v甘油、0.03w/v海藻糖二水合物、MMLV逆转录酶(RT)和T7 RNA合酶。
扩增反应和检测反应使用Stratagene Mx3000以双相实时TMA格式进行。简单地说，将样品在62℃下用100μl含有靶捕获寡聚物(SEQ ID NO:1、7、11和16，每种15pmol/rxn)和T7引物(SEQ ID NO:3、4、9、13和18，每种5pmol/rxn)的TCR孵育30分钟，然后缓慢降至室温持续20分钟，以形成杂交复合物(磁珠-dT14:靶捕获寡聚物:靶核酸:T7引物)。将杂交复合物洗涤并洗脱到含有非T7引物(SEQ ID NO:2、8、12和17，每种15pmol/rxn)的扩增试剂中。在加入酶试剂(25μl)和随后加入启动子试剂(25μl)的过程中，将样品在43℃下孵育。启动子试剂含有T7引物(SEQ ID NO:3、4、9、13和18，每种15pmol/rxn)和炬(Torch)寡核苷酸(SEQ ID NO:5、6、10、14、15和19，每种15pmol/rxn)。每隔30秒在Stratagene仪器上实时测量荧光发射(其反映炬与靶扩增子结合并导致染料与猝灭剂分离)，持续1小时。分析靶标扩增的荧光曲线轮廓。参见例如美国专利第9,139,870B2号。每种条件下的靶核酸是来自卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、***加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta.)的裂解物，或者是体外转录物，其至少包含用于与靶捕获寡聚物、T7引物、非T7引物和靶标的炬杂交的序列，以进行捕获、扩增和检测反应。(用于制备裂解物的细菌菌株购自弗吉尼亚州马纳萨斯市的ATCC公司(ATCC,Manassas,VA)，产品目录号：ATCC 33820、ATCC 14018和ATCC 25559)。
实施例1
进行了几个实验，实验显示在含Cy5.5染料的溶液孵育30天后，Cy 5.5RFU信号下降了25％到70％。将经孵育的含Cy5.5染料的溶液用于实时(RT)TMA测定中，如上面所描述的。将此实施例中的Cy5.5染料附接到炬寡核苷酸上，以检测内部对照靶核酸。下表1中显示了一些代表性数据，这些数据说明在30天后内部对照Cy5.5炬下降了35％，而FAM、HEX和ROX炬仅下降了约10％。用不同的远红染料和替代性缓冲剂配方尝试了另外的研究，并且随着时间的推移，信号出现了类似的下降。由于不可靠的信号提供无效的测定结果，显示RFU信号显著降低的所储存的含有远红染料的试剂因此变得不可用。因此，建议不要将含有远红染料的溶液储存用于在以后的利用来自这些染料的RFU信号的测定中使用，而是丢弃未使用的部分。
表1：在孵育30天后使用含有远红染料的溶液进行实时TMA 4-plex扩增和检测测定的结果
将含Cy5.5染料的溶液孵育30天，如上所述。在将储存的溶液用于实时扩增和检测反应之前，将一部分含Cy5.5染料的溶液加热到80℃持续10分钟，而另一部分不加热。然后将每种含Cy5.5染料的条件用于扩增和检测反应，结果呈现于表2中。这些结果表明，与未加热的对照物相比，80℃/10分钟的加热步骤完全恢复了Cy5.5 RFU信号的损失。这说明在经孵育溶液中的远红染料信号损失不是由于染料的降解而造成的，而是指向胶束形成，其中Cy5.5荧光团彼此非常接近并猝灭。
表2：在孵育30天和80℃/10分钟的加热步骤后使用含有远红染料的溶液进行实时TMA 4-plex扩增和检测测定的结果
NA＝没有可检测的信号，因此没有可获得的T时间。
为了破坏随时间推移而发生的胶束形成，对于进一步含有非离子表面活性剂的含有远红染料的溶液重复进行30天的储存测量。在这一实验中，使用TRITONTM X-100或
与没有TRITON X-100的对照条件(下降了23％)(见表3)相比，在启动子试剂中加入TRITONTM X-100导致储存0天和40天之间Cy5.5 RFU信号下降了70％以上。
表3：将含有Cy5.5组分和不同浓度的TRITON X-100的启动子试剂孵育40天与孵育0天进行比较
与没有加入TWEEN 20的对照条件(其下降了29％)相比，在启动子试剂中加入TWEEN 20导致在储存的0天和38天之间Cy5.5 RFU信号的最小下降。如表4所示，与对照条件相比(即，未添加TWEEN 20)(在第0天到第38天之间下降了29％)，在第0天至第38天之间，在TWEEN 20为1％到20％时，Cy5.5 RFU信号仅下降了4.6％到10.4％。
表4：将含有Cy5.5组分和不同浓度的TWEEN 20的启动子试剂孵育38天与孵育0天进行比较
将浓度等于或低于1％的TWEEN 20加入多种启动子试剂中，并在如上所述的扩增反应和检测反应中进行测试。制备用于靶核酸扩增和检测的启动子试剂，以包含Cy5.5标记的炬寡核苷酸，并且还包含1％TWEEN 20、0.03％TWEEN 20或0.001％TWEEN 20。然后在第0天和储存42天后(第42天)，将各种启动子试剂条件用于实时等温扩增和检测反应。结果示于表5中。在其中启动子试剂含有较低浓度的TWEEN 20的条件下，从第0天到第42天的Cy5.5RFU信号的下降更为明显。
表5：将含有Cy5.5和不同浓度的Tween 20的启动子试剂孵育42天与孵育0天进行比较
在进一步的实验中，将其它表面活性剂加入到含有远红染料的溶液中。制备启动子试剂以用于扩增和检测反应。在本体溶液中制备含有Cy5.5炬的启动子试剂。然后将本体溶液分成多个条件，其中每个条件含有以下表面活性剂中的一种(1％v/v)：
表6：对在存在多种不同表面活性剂的情况下储存38天、17天和0天后的Cy5.5RFU信号进行比较
下面示出了另外的毛地黄皂甙表面活性剂和泊洛沙姆表面活性剂的结构。
毛地黄皂甙：
泊洛沙姆F108：
制备并冻干了多种含有远红染料和表面活性剂的溶液。然后用也含有表面活性剂的稀释剂复原冻干组合物。然后将复原的溶液用于实时扩增测定和检测测定。在一种配置中，制备如上所述的启动子试剂，以包含Cy5.5标记的炬和TWEEN-20，如表7所示。评价冻干小丸(pellet)的物理特性，然后用含有1％TWEEN-20的稀释剂复原那些具有可接受特性的小丸，以提供在复原的启动子试剂中含有1.41％TWEEN-20到2.24％TWEEN-20的溶液。然后，在第0天和第30天，将复原的启动子试剂用于实时扩增和检测测定，并获得强健的Cy5.5RFU信号，并且在第0天和第30天之间没有显著下降。冻干循环后观察到的不良物理特性包括：含有过量表面活性剂的冻干前溶液不能完全冻干(部分保持液态)；以及含有太少表面活性剂的冻干前溶液显示蓝点(表明远红染料组分的胶束形成)。因此，根据含有远红染料的溶液的配方，冻干前溶液中的表面活性剂浓度仅需要为最小量，，以防止在冻干前的短孵育期内形成胶束。然后，使用含有表面活性剂的复原溶液(稀释剂)来提供为远红染料组分提供长期孵育保护所需的表面活性剂的剩余部分。
表7：冻干启动子试剂和稀释剂试剂中的TWEEN-20
启动子试剂中的TWEEN-20％(冻干前)
复原的启动子试剂中的TWEEN-20％
3.0％TWEEN-20
2.24％TWEEN-20
1.5％TWEEN-20
1.62％TWEEN-20
1.0％TWEEN-20
1.41％TWEEN-20
表8：示例性序列
示例性实施方案
实施方案1.一种稳定的远红染料探针调配物，其包含：
远红染料探针，所述远红染料探针包含与载体分子缀合的远红染料；
浓度大于约0.05％(v/v)的非线性表面活性剂；以及
至少一种缓冲剂；
其中所述调配物是水性溶液。
实施方案2.根据实施方案1所述的调配物，其中所述远红染料是远红花青染料。
实施方案3.根据实施方案2所述的调配物，其中所述远红花青染料选自由Cyanine5和Cyanine5.5组成的组。
实施方案4.根据实施方案1到3中任一项所述的调配物，所述非线性表面活性剂选自由聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯和毛地黄皂甙组成的组。
实施方案5.根据实施方案4所述的调配物，所述非线性表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
实施方案6.根据实施方案5所述的调配物，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40和聚山梨醇酯60组成的组。
实施方案7.根据实施方案1到6中任一项所述的调配物，其中非线性表面活性剂浓度为约0.06％(v/v)到约20％(v/v)、约0.06％(v/v)到约10％(v/v)、约0.1％(v/v)到约20％(v/v)、约0.1％(v/v)到约10％(v/v)、或约0.1％(v/v)到约3％(v/v)。
实施方案8.根据实施方案1到6中任一项所述的调配物，其中非线性表面活性剂浓度为约0.5％(v/v)到约20％(v/v)、约0.5％(v/v)到约10％(v/v)、约1％(v/v)到约20％(v/v)、约1％(v/v)到约10％(v/v)、或约1％(v/v)到约3％(v/v)。
实施方案9.根据实施方案1到8中任一项所述的调配物，其中所述至少一种缓冲剂是Tris。
实施方案10.根据实施方案9所述的调配物，其中Tris缓冲剂以约5mM到约50mM的浓度存在。
实施方案11.根据实施方案1到10中任一项所述的调配物，其中所述载体分子是核酸。
实施方案12.根据实施方案11所述的调配物，其中所述核酸载体分子是RNA。
实施方案13.根据实施方案1到10中任一项所述的调配物，其中所述远红染料探针进一步包含猝灭剂。
实施方案14.根据实施方案13所述的调配物，其中所述远红染料探针选自由分子炬、分子信标和TaqMan探针组成的组。
实施方案15.根据实施方案10到14中任一项所述的调配物，所述调配物进一步包含第一扩增寡聚物，其中所述远红染料探针包含特异性结合于包含在靶核酸的靶区域内的第一序列的靶杂交序列，其中所述第一扩增寡聚物包含特异性结合于包含在所述靶区域内的第二序列的靶杂交序列，并且其中所述第一扩增寡聚物被配置成在包括所述靶核酸作为模板的扩增测定中产生含有所述靶区域的扩增产物。
实施方案16.根据实施方案15所述的调配物，所述调配物进一步包含第二扩增寡聚物，所述第二扩增寡聚物包含特异性结合于包含在所述靶区域内的第三序列的靶杂交序列，并且所述第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物被配置成在所述扩增测定的多个循环中扩增所述靶区域。
实施方案17.根据实施方案15或16所述的调配物，所述第一扩增寡聚物是进一步包含位于第一靶杂交序列的5'的启动子序列的基于启动子的扩增寡聚物。
实施方案18.根据实施方案15到17中任一项所述的调配物，所述调配物进一步包含一种或多种适于进行所述扩增测定的核苷酸三磷酸。
实施方案19.根据实施方案15到18中任一项所述的调配物，所述调配物进一步包含一种或多种适于进行所述扩增测定的盐或辅因子。
实施方案20.一种稳定的远红染料探针调配物，其包含：
远红染料探针，所述远红染料探针包含与载体分子缀合的远红染料；
浓度大于约0.05％(v/v)的foamban；以及
至少一种缓冲剂；
其中所述调配物是水性溶液。
实施方案21.一种制备稳定的冻干远红染料探针调配物的方法，所述方法包括：
提供根据实施方案1到20中任一项所述的调配物；并且
冻干水性溶液以形成所述冻干远红染料探针调配物。
实施方案22.一种稳定的冻干远红染料探针调配物，其通过根据实施方案21所述的方法制备。
实施方案23.一种稳定的冻干远红染料探针调配物，其使得能够复原为根据实施方案1到20中任一项所述的水性调配物。
实施方案24.一种制备稳定的水性远红染料探针调配物的方法，所述方法包括：
(a)提供根据实施方案22或23所述的冻干远红染料探针调配物；以及
(b)将所述冻干远红染料探针调配物溶解在稀释剂中，以提供复原的调配物。
实施方案25.一种试剂盒，其包含：
第一密封容器，所述第一密封容器含有根据实施方案22或23所述的冻干远红染料探针调配物；以及
第二密封容器，所述第二密封容器含有稀释剂。
实施方案26.根据实施方案25所述的试剂盒，其中所述稀释剂包含所述非线性表面活性剂。
实施方案27.一种制备稳定的水性远红染料探针调配物的方法，所述方法包括：
(a)提供冻干的远红染料探针调配物，所述调配物使得能够复原为包含至少一种缓冲剂和远红染料探针的水性溶液，所述远红染料探针包含与载体分子缀合的远红染料；以及
(b)将所述冻干远红染料探针调配物溶解在稀释剂中，以提供复原的调配物；
其中所述冻干远红染料探针调配物和所述稀释剂中的至少一种包含非线性表面活性剂，并且其中所述复原的调配物包含浓度大于约0.05％(v/v)的非线性表面活性剂。
实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中所述冻干远红染料探针调配物和所述稀释剂二者都包含所述非线性表面活性剂。
实施方案29.根据实施方案27或28所述的方法，其进一步包括通过冻干包含所述远红染料探针和所述至少一种缓冲剂的水性溶液来制备所述冻干远红染料探针调配物。
实施方案30.一种试剂盒，其包含：
第一密封容器，所述第一密封容器含有冻干远红染料探针调配物，所述调配物使得能够复原为包含至少一种缓冲剂和远红染料探针的水性溶液，所述远红染料探针包含与载体分子缀合的远红染料；以及
第二密封容器，所述第二密封容器含有稀释剂；
其中所述冻干远红染料探针调配物和所述稀释剂中的至少一种包含非线性表面活性剂，并且其中所述冻干远红染料探针调配物在所述稀释剂中的复原提供了大于约0.05％(v/v)的最终非线性表面活性剂浓度。
实施方案31.根据实施方案30所述的试剂盒，其中所述冻干远红染料调配物和所述稀释剂二者都包含所述非线性表面活性剂。
实施方案32.一种诊断产品，其包含含有根据实施方案1到20、22和23中任一项所述的稳定的远红染料探针调配物的密封容器。
根据前文，应当了解，尽管本文出于说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，但是可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下作出各种修改。因此，除所附的权利要求书之外本发明不受限制。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用以其整体特此并入。
序列表
<110> GEN-PROBE公司（GEN-PROBE INCORPORATED）
希拉•奥滨-沃克
迈赫达德R.•麦杰莱斯
约书亚•布斯凯
吉米金•彭
<120> 远红染料探针调配物
<130> DIA-0041-03
<140> TBA
<141> 2019-02-06
<150> 62/627,040
<151> 2018-02-06
<160> 20
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
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<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> 启动子
<222> (1)..(27)
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
cttacctggg cttgacatgt gcctg 25
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> 启动子
<222> (1)..(27)
<400> 9
aatttaatac gactcactat agggagacac cacctgtgaa cctgc 45
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<221> misc_feature
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<212> DNA
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<221> 启动子
<222> (1)..(27)
<400> 13
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> 启动子
<222> (1)..(27)
<400> 18
aatttaatac gactcactat agggagagat gattgacttg tgattccgc 49
<210> 19
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gcauggugcg aauugggaca ugc 23
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<223> 合成寡核苷酸
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