基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量muc1荧光检测方法
阅读说明：本技术 基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量muc1荧光检测方法 (Trace MUC1 fluorescence detection method based on chain type hybridization reaction and fluorescent carbon quantum dots ) 是由 杨大威 缪鹏 陈锡峰 孟凡渝 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量MUC1荧光检测方法,具体为：先合成碳量子点,然后将颈环DNA H1、H2修饰至碳量子点上,再与氧化石墨烯混合；MUC1不存在时,修饰有碳量子点的H1、H2吸附至氧化石墨烯表面,由于荧光共振能量转移效应,碳量子点荧光猝灭；当MUC1存在时,MUC1与适配体结合,并促发H1、H2发生链式杂交反应形成链式杂交产物,脱离氧化石墨烯的表面,最终碳量子点荧光得到恢复；从而通过荧光检测实现MUC1含量的测定。本方法通过链式杂交反应实现的信号的放大,大大提高了MUC1检测的灵敏度；同时本方法合成的荧光碳量子点荧光性质稳定,极大提高了本方法的稳定性和重复性。(The invention discloses a trace MUC1 fluorescence detection method based on chain type hybridization reaction and fluorescent carbon quantum dots, which comprises the steps of firstly synthesizing the carbon quantum dots, then modifying neck ring DNAs H1 and H2 on the carbon quantum dots, and then mixing the carbon quantum dots with graphene oxide, adsorbing H1 and H2 modified with the carbon quantum dots to the surface of the graphene oxide when MUC1 does not exist, quenching the fluorescence of the carbon quantum dots due to fluorescence resonance energy transfer effect, combining MUC1 with an aptamer and promoting H1 and H2 to perform chain type hybridization reaction to form a chain type hybridization product when MUC1 exists, separating from the surface of the graphene oxide, and finally recovering the fluorescence of the carbon quantum dots, so that the determination of the MUC1 content is realized through the fluorescence detection.)
技术领域
本发明涉及痕量MUC1检测领域，特别涉及一种基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量MUC1荧光检测方法。
背景技术
粘蛋白(MUC1)是一类高分子量、高糖基化的蛋白，存在于上皮细胞，通过凝胶基质形成完整的跨膜结构域。粘蛋白(MUC1)是其中一种细胞表面糖蛋白，其多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞内段3部分组成，跨膜段和胞内段分别含有31和69个氨基酸；胞外段含有多个连续重复序列，每个重复序列含有20个氨基酸。MUC1在信号传导过程中发挥重要作用，此外，MUC1可使E-钙粘蛋白下调表达，后者是一种钙离子依赖的细胞粘附分子，介导细胞间的结合，在肿瘤转移中起抑制作用，E-钙粘蛋白的下调表达是肿瘤细胞侵袭性增强的步骤之一。MUC1在人上皮细胞腺癌中高度表达，如乳腺癌、胃癌、肺癌、***癌、卵巢癌以及胰腺癌中均高度表达，当其到达一定程度，血液中也可以检测到其存在。因此，MUC1在可以作为一种有效的肿瘤早期诊断标志物，实现其快速、灵敏检测对于肿瘤的早期诊断具有重要意义。目前，传统的MUC1检测方法主要包括酶联免疫吸附法、电化学法、质谱法、比色法以及荧光法。然而，传统方法面临着灵敏度低，操作复杂等诸多问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量MUC1荧光检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量MUC1荧光检测方法，该方法具体为：首先合成碳量子点，然后将颈环DNAH1、H2修饰至碳量子点上，再与氧化石墨烯混合；当MUC1不存在时，修饰有碳量子点的H1、H2吸附至氧化石墨烯表面，由于荧光共振能量转移效应，碳量子点荧光猝灭；当MUC1存在时，MUC1与适配体结合，并促发H1、H2发生链式杂交形成链式杂交产物，脱离氧化石墨烯的表面，最终荧光得到恢复；从而通过荧光检测实现MUC1含量的测定。
优选的是，其中，MUC1与适配体结合后，引起适配体构象上的变化，适配体暴露出识别序列，识别序列促发H1、H2发生链式杂交反应，形成链式杂交产物。
优选的是，该方法包括以下步骤：
1)合成碳量子点；
2)颈环DNA H1、H2预处理；
3)将预处理后的颈环DNA H1、H2修饰至碳量子点上；
4)修饰有碳量子点的H1、H2与氧化石墨烯混合；
5)向MUC1待测样本中加入MUC1适配体，然后将步骤4)得到的混合物加入MUC1待测样本及MUC1适配体混合液中，并进行荧光强度检测。
优选的是，所述步骤1)具体为：首先将柠檬酸和半胱氨酸按摩尔比2:1，研磨混合，微波炉中反应4min后获得碳量子点。
优选的是，所述步骤2)具体为：将颈环DNA H1、H2及MUC1适配体溶于Tris缓冲液中，然后金属浴加热至95℃，保持5分钟，自然降至室温；然后将DNA稀释至所需浓度，储存备用。
优选的是，所述步骤3)具体为：首先将合成好的碳量子点用EDC、NHS活化，25℃震荡30分钟；然后将末端氨基化的H1、H2加至活化后的碳量子点溶液中，室温震荡2个小时，然后4℃放置过夜，以水解未反应的EDC，最终得到修饰H1、H2的碳量子点。
优选的是，所述步骤4)具体为：将H1、H2修饰的碳量子点与氧化石墨烯混合，25℃孵育15min，使荧光淬灭。
优选的是，所述步骤5)具体为：向MUC1待测样本中加入适量的MUC1适配体，并在37℃混合孵育30分钟；然后向其中加入步骤4)得到的混合物，孵育15分钟，检测其荧光强度。
优选的是，荧光强度检测采用FLS-1000荧光光谱仪，其中激发波长为355nm，发射波长为420nm，狭缝宽度分别为3nm、4nm。
本发明的有益效果是：本发明的方法通过链式杂交反应实现的信号的放大，大大提高了MUC1检测的灵敏度；同时本方法中合成的荧光碳量子点荧光性质稳定，极大提高本方法的稳定性和重复性，且成本大大降低；此外，本方法同样适用于血清等复杂生物样品中MUC1的检测。
附图说明
图1为本发明的一种实施例中的MUC1荧光检测原理示意图；
图2为本发明的一种实施例中的检测体系可行性的验证结果图；
图3为本发明的一种实施例中对不同浓度MUC1的荧光强度检测结果图；
图4为本发明的一种实施例中的干扰验证结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量MUC1荧光检测方法，该方法具体为：首先合成荧光强度高、稳定性好的碳量子点，然后将颈环DNA H1、H2修饰至碳量子点上，再与氧化石墨烯混合；当MUC1不存在时，修饰有碳量子点的H1、H2吸附至氧化石墨烯表面，由于荧光共振能量转移效应，碳量子点荧光猝灭；当MUC1存在时，MUC1与适配体结合，引起适配体构象上的变化，适配体暴露出识别序列，识别序列促发H1、H2发生链式杂交反应，形成链式杂交产物，进而脱离氧化石墨烯的表面，最终碳量子点荧光得到恢复；从而通过荧光检测实现MUC1含量的测定。
通过链式杂交反应介导的信号放大效应，本检测体系的检测限低至10fg/mL。本方法通过链式杂交反应实现的信号的放大，大大提高了MUC1检测的灵敏度；同时本方法中合成的荧光碳量子点荧光性质稳定，极大提高本方法的稳定性和重复性。
在一种实施例中，基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量MUC1荧光检测方法，具体包括以下步骤：
1)合成荧光强度强且荧光稳定的碳量子点：首先将柠檬酸和半胱氨酸按摩尔比2:1，充分研磨混合，微波炉中反应4min后获得荧光强度强且荧光稳定的碳量子点。
2)颈环DNA H1、H2预处理：将颈环DNA H1、H2及MUC1 Aptamer(适配体)溶于Tris缓冲液中，然后金属浴加热至95℃，保持5分钟，自然缓慢降至室温；然后将DNA稀释至所需浓度，储存备用。
3)将预处理后的颈环DNA H1、H2修饰至碳量子点上：首先将合成好的碳量子点用EDC、NHS活化，25℃缓慢震荡30分钟；然后将末端氨基化的H1、H2加至活化后的碳量子点溶液中，室温缓慢震荡2个小时，然后4℃放置过夜，以水解未反应的EDC，最终得到修饰H1、H2的碳量子点。
4)修饰有碳量子点的H1、H2与氧化石墨烯混合：将H1、H2修饰的碳量子点与氧化石墨烯混合，25℃孵育15min，使荧光淬灭。
5)向MUC1待测样本中加入MUC1适配体，然后将步骤4)得到的混合物加入MUC1待测样本及MUC1适配体混合液中，并进行荧光强度检测，本实施例中，MUC1待测样本为预先配制的不同浓度的MUC1溶液：向不同浓度的MUC1中分别加入适量的MUC1适配体，并在37℃混合孵育30分钟；然后向其中分别加入步骤4)得到的混合物，孵育15分钟,检测其荧光强度。检测结果参照图3。
在优选的实施例中，荧光强度检测采用FLS-1000荧光光谱仪，其中激发波长为355nm，发射波长为420nm，狭缝宽度分别为3nm、4nm。
参照图1为本实施例的MUC1荧光检测原理示意图，其中，图1a部分为碳点制备和碳点修饰H1、H2的原理示意，其中，碳点上的-COOH来源于柠檬酸上未反应的-COOH；图1b部分为修饰H1、H2的碳点进行MUC1的原理示意。
参照图2为本实施例的检测体系可行性的验证结果图，本实施例对检测体系可行性进行了验证，其中图2a为体系中加入有1ng/mL MUC1测得的荧光光谱图；图2b为体系中不存在MUC1(加入与图2a中等量的缓冲液)时测得的荧光光谱图。从图中可以证明检测体系对MUC1检测的可行性。
参照图3为本实施例的上述步骤5的荧光强度检测结果。图3a为不同浓度MUC1得到的荧光光谱图。其中进行检测的不同浓度的MUC1溶液浓度分别为10fg/mL，100fg/mL，1pg/mL，10pg/mL，100pg/mL，1ng/mL，10ng/mL；其曲线为图中波峰处由下向上依次对应。图3b不同浓度MUC1所对应的荧光强度的线性范围内统计图。靶蛋白MUC1与适配体结合，引起适配体构象的改变，进而暴露处识别序列，促发链式杂交反应，荧光得到恢复。因此可以通过荧光光谱仪测得的荧光强度的变化量来评估MUC1的含量。图3a显示了不同浓度MUC1得到的荧光光谱图。在一定范围内荧光信号强度随着MUC1浓度的增加逐渐增强。如图3b所示，荧光强度与10fg/mL至100pg/mL的范围内MUC1浓度的对数呈线性关系。回归方程为y＝3527x+14721(R2＝0.997，n＝3)，其中y是荧光信号强度值，x是MUC1浓度的对数。
参照图4为本发明的体系的干扰验证结果图。其中，图4a为靶蛋白MUC1检测量(10pg/mL)相对于其他过量(100pg/mL)的干扰蛋白：牛血清白蛋白，人血清白蛋白，PDGF-BB得到的荧光强度对比图；图4b为不同浓度MUC1在缓冲液及血清中的荧光强度对比图。误差条表示三次独立测量的相对标准偏差。图4a通过使用一些过量的干扰蛋白来验证所本方法的特异性。在MUC1测定和对照实验之间存在显著的荧光信号差异。因此，实验结果表明本方法具有高度的特异性，进一步证实了所提出方法的高选择性。图4b通过检测不同浓度MUC1在缓冲液(Buffer)及血清(Serum)中的荧光强度，证实了本检测方法在血清样品中与缓冲液中具有相似的检测效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。