阅读说明：本技术 通过衔接子序列定量ngs dna (quantification of NGS DNA by adaptor sequences ) 是由 A.迪克斯 J.莫内特 于 2018-03-29 设计创作，主要内容包括：本公开涉及在下一代测序(NGS)应用中使用的用于检测和/或定量核酸如双链DNA的方法和试剂盒。还提供了基于核酸的探针,例如肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标、DNA闪耀和锁定核酸(LNA)寡聚体,用于本公开的方法和试剂盒中。(The present disclosure relates to methods and kits for detecting and/or quantifying nucleic acids, such as double stranded DNA, for use in Next Generation Sequencing (NGS) applications. Also provided are nucleic acid-based probes, such as Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers, molecular beacons, DNA blaze, and Locked Nucleic Acid (LNA) oligomers, for use in the methods and kits of the present disclosure.)

通过衔接子序列定量NGS DNA

交叉参考

本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求2017年3月30日提交的美国临时申请no.62/478,825的权益。上述申请的全部内容以引用的方式并入本文中

技术领域

本公开一般涉及核酸定量领域，更具体地，涉及用于下一代测序(NGS)应用的核酸定量方法。

发明内容

本文提供了用于定量用于下一代测序(NGS)应用的核酸的方法，以及用于此类方法的基于核酸的探针和试剂盒。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于检测样品中的核酸的方法，所述方法包括：

a)将核酸探针与所述样品组合以制备探针-核酸混合物；

b)将所述探针-核酸混合物温育足够量的时间以使所述核酸探针与样品中的核酸杂交以创建探针-核酸复合物；

c)用适当波长的光照射所述探针-核酸复合物，以产生可检测的光学响应；和

d)检测所述可检测的光学响应，从而检测核酸。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于定量样品中的核酸的方法，所述方法包括：

a)将核酸探针与所述样品组合以制备探针-核酸混合物；

b)将所述探针-核酸混合物温育足够量的时间以使所述核酸探针与样品中的核酸杂交以创建探针-核酸复合物；

c)用适当波长的光照射所述探针-核酸复合物，以产生可检测的光学响应；

d)检测所述可检测的光学响应；和

e)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的核酸。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含至少一个边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；和

c)将所述靶-探针混合物温育足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以形成探针-靶复合物。

在某些实施方案中，该方法还包括：

d)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；和

e)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端区域或5'-末端区域互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶-探针混合物的样品，其中所述靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含至少一个边合成边测序衔接子序列，和ii)衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；和

c)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在本公开的某些另外的实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有一种或多种靶-探针混合物的样品，其中所述一种或多种靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含至少一个边合成边测序衔接子序列，和ii)一种或多种衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述一种或多种靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；和

c)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些实施方案中，所述样品包含两种靶-探针混合物。在某些实施方案中，所述样品包含三种靶-探针混合物。在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端区域互补。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含至少一个边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；和

d)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物温育足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以创建第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物；

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括：

e)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

f)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应，从而检测样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；和

c)将所述靶-探针混合物温育足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以创建探针-靶复合物。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括：

d)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；

e)检测所述可检测的光学响应；和

f)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含至少一个边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；和

d)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物温育足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以形成第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物；

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括：

e)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

f)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应，从而检测样品中的靶核酸；

g)将第一可检测光学响应和第二可检测光学响应与已知量的核酸进行比较，从而定量样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶-探针混合物的样品，其中所述靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含边合成边测序衔接子序列，和ii)衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；

c)检测所述可检测的光学响应；和

d)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的靶核酸。

在某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有一种或多种靶-探针混合物的样品，其中所述一种或多种靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含至少一个边合成边测序衔接子序列，和ii)一种或多种衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述一种或多种靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；和

c)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些实施方案中，所述样品包含两种靶-探针混合物。在某些实施方案中，所述样品包含三种靶-探针混合物。在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

c)加热所述靶-探针混合物足够量的时间以使所述靶核酸变性；

d)将所述靶-探针混合物冷却足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以创建探针-靶复合物；

e)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；和

f)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；

d)加热第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物足够量的时间以使靶核酸变性；

e)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物冷却足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以创建第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物；

f)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

g)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应，从而检测样品中的靶核酸，

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

c)加热所述靶-探针混合物足够量的时间以使所述靶核酸变性；

d)将所述靶-探针混合物冷却足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以创建探针-靶复合物；

e)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；

f)检测所述可检测的光学响应；和

g)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；

d)加热第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物足够量的时间以使靶核酸变性；

e)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物冷却足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以创建第一探针-靶复合物和第二靶-探针复合物；

f)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二靶-探针复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；

g)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

h)将第一可检测光学响应和第二可检测光学响应与已知量的核酸进行比较，从而定量样品中的靶核酸，

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本文提供的方法的某些实施方案中，靶核酸是双链DNA。

在本文提供的方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含与边合成边测序衔接子序列的核酸序列或其部分互补的寡核苷酸序列和荧光染料。在本文提供的方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针还包含猝灭剂。在本文提供的方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含肽核酸(PNA)寡聚体探针、分子信标探针、DNA闪耀探针(flare probe)或锁定核酸(LNA)探针对。

在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含肽核酸(PNA)寡聚体，其包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和一系列与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序衔接子的核酸序列互补。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含分子信标，所述分子信标包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的18个核苷酸。在其他某些实施方案中，衔接子特异性探针包含DNA闪耀，其包含与一个或多个核苷酸共价附接的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的28个核苷酸。在其他实施方案中，衔接子特异性探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，第一LNA探针包含与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的8-12个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂直接附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂共价附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。

在本文提供的方法的某些实施方案中，所述方法还包括将引物-二聚体检测探针添加至靶-探针混合物，其中引物-二聚体检测探针具有可检测的光学响应，其可与衔接子特异性探针的可检测的光学响应区分。

在某些实施方案中，荧光染料选自芘、呫吨、花青、吲哚、苯并呋喃、香豆素或硼聚苯并氮杂吲哚(borapolyazaindacene)。在某些实施方案中，猝灭剂选自BLACK HOLE染料(Biosearch Technologies Inc.,Petaluma,CA)、IOWA猝灭剂(Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)、猝灭剂(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)、Dabsyl、Dabcel、Deep Dark猝灭剂(KanekaEurogentec,S.A.,Seraing,Belgium)和猝灭剂(Glen Research,Sterling,VA)。

在本文提供的方法的某些实施方案中，检测步骤通过荧光测定法进行。在某些优选的实施方案中，检测步骤在QUBIT荧光计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)上进行。在某些实施方案中，样品在微量离心管或多孔板中。在某些实施方案中，边合成边测序衔接子是通用衔接子或索引衔接子(Illumina,San Diego,CA)。

在本公开的某些实施方案中，提供了衔接子特异性探针，该探针包含：与边合成边测序衔接子的核酸序列或其部分互补的寡核苷酸序列和荧光染料。在某些实施方案中，衔接子特异性探针还包含猝灭剂。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含肽核酸(PNA)寡聚体探针、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对。

在本公开的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含PNA寡聚体探针，其中肽核酸(PNA)寡聚体探针包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C末端的荧光猝灭剂、和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序衔接子的核酸序列互补。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含分子信标探针，其中分子信标探针包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的荧光猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的18个核苷酸。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含DNA闪耀探针，其中DNA闪耀探针包含与一个或多个核苷酸共价附接的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的28个核苷酸。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其中LNA探针对包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，第一LNA探针包含与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的8-12个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料选自芘、呫吨、花青、吲哚、苯并呋喃、香豆素或硼聚苯并氮杂吲哚。在某些实施方案中，猝灭剂选自BLACK HOLE染料(Biosearch Technologies Inc.,Petaluma,CA)、IOWA猝灭剂(IntegratedDNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)、猝灭剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、Dabsyl、Dabcel、Deep Dark猝灭剂(Kaneka Eurogentec,S.A.,Seraing,Belgium)和猝灭剂(Glen Research,Sterling,VA)。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂直接附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂共价附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。

在本公开的某些实施方案中，提供了引物-二聚体检测探针，所述引物-二聚体检测探针包含：与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的寡核苷酸序列；和荧光染料。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针还包含猝灭剂。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含肽核酸(PNA)寡聚体探针、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对。

在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含PNA寡聚体探针，其中肽核酸(PNA)寡聚体探针包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C末端的猝灭剂、和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含分子信标探针，其中分子信标探针包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的荧光猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的18个核苷酸。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含DNA闪耀探针，其中DNA闪耀探针包含与一个或多个核苷酸共价附接的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的28个核苷酸。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其中LNA探针对包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，第一LNA探针包含与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的8-12个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料选自芘、呫吨、花青、吲哚、苯并呋喃、香豆素或硼聚苯并氮杂吲哚，并且与衔接子特异性探针可检测地区分。在某些实施方案中，猝灭剂选自BLACK HOLE染料(Biosearch Technologies Inc.,Petaluma,CA)、IOWA猝灭剂(Integrated DNATechnologies,Inc.,Coralville,IA)、猝灭剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、Dabsyl、Dabcel、Deep Dark猝灭剂(Kaneka Eurogentec,S.A.,Seraing,Belgium)和猝灭剂(Glen Research,Sterling,VA)。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂直接附接于引物-二聚体探针的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂共价附接于引物-二聚体探针的一个或多个核苷酸。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于检测或定量核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：一种或多种衔接子特异性探针；缓冲液；和检测或定量核酸的说明书。在某些实施方案中，试剂盒还包含引物-二聚体检测探针。在某些实施方案中，试剂盒包含两种衔接子特异性探针。

在本文提供的试剂盒的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含：与边合成边测序衔接子的核酸序列或其部分互补的寡核苷酸序列和荧光染料。在某些实施方案中，衔接子特异性探针还包含猝灭剂。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含肽核酸(PNA)寡聚体探针、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含肽核酸(PNA)寡聚体，其包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序衔接子的核酸序列互补。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含分子信标，所述分子信标包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的18个核苷酸。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含DNA闪耀探针，其包含与一个或多个核苷酸共价连接的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的28个核苷酸。在某些实施方案中，衔接子特异性探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，第一LNA探针包含与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的8-12个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂直接附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂共价附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。

在本文提供的试剂盒的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含：与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的寡核苷酸序列；和荧光染料。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针还包含荧光猝灭剂。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含肽核酸(PNA)寡聚体探针、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对。在某些实施方案中，肽核酸(PNA)寡聚体探针包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与通过合成衔接子引物-二聚体的测序的核酸序列互补。在某些实施方案中，所述分子信标探针包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的18个核苷酸。在某些实施方案中，DNA闪耀探针包含与一个或多个核苷酸共价连接的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的28个核苷酸。在某些实施方案中，锁定核酸(LNA)探针对包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，第一LNA探针包含与边合成边测序引物-二聚体的一部分互补的8-12个核苷酸。在某些实施方案中，所述引物-二聚体检测探针具有与衔接子特异性探针的可检测光学响应区分的可检测光学响应。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂直接附接于引物-二聚体探针的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂共价附接于引物-二聚体探针的一个或多个核苷酸。

通过引用并入

本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请都在本文中通过引用并入，程度如同每一单独的公开、专利或专利申请被专门并且单独地指示以引用的方式并入一般。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。将通过参考阐述其中使用本发明原理的说明性实施方案和其附图的以下

具体实施方式

来获得对本发明特征和优势的更佳理解：

图1是使用Illumina边合成边测序平台对DNA进行衔接子修饰的示意图，其中靶序列包括边合成边测序衔接子序列，其在图中表示为白色链，而基因组DNA在图中表示为黑色链。

图2是本公开方法的某些实施方案的示意图，其中衔接子特异性探针包含肽核酸(PNA)寡聚体探针。肽核酸寡聚体(PNA)由一系列核苷酸组成，所述核苷酸对应于靶序列或感兴趣的衔接子序列(白色-识别序列)，其中所述PNA寡聚体的N-末端标记有荧光染料(星形)和PNA寡聚体的C-末端标记有荧光猝灭剂(矩形)。在水溶液中，PNA寡聚体自身折叠，并且猝灭剂与荧光染料的紧密接近导致可忽略的荧光信号。然而，在存在互补DNA序列(与探针的识别序列互补的衔接子序列，表示为白色链)的情况下，PNA寡聚体展开并结合至靶衔接子序列DNA(活化探针)。当退火时，未折叠双链PNA寡聚体增加染料-猝灭剂对之间的距离，使得猝灭剂不再能够猝灭染料的天然荧光。此产生的荧光信号被定量并且表示与衔接子修饰的DNA(活化探针)的一对一关系。如果探针未识别出靶序列，则探针保持猝灭且无荧光(非活性探针)。

图3是本公开方法的某些实施方案的示意图，其中衔接子特异性探针包含分子信标探针。分子信标探针是组织成由30-50个核苷酸组成的发夹环的DNA寡聚体，其含有对应于目的序列的环区，以及与其自身互补的茎区。分子信标茎的5'末端用荧光染料(星形)标记，3'-茎末端用荧光猝灭剂(矩形)标记。天然地，5-7个核苷酸的茎序列对齐并退火，导致猝灭剂与荧光染料紧密接近，导致可忽略的荧光信号。然而，在存在互补DNA序列(与分子信标互补的衔接子序列)的情况下，分子信标茎不退火，环区域可自由结合靶DNA(表示为白色链的衔接子序列)，这导致分子信标探针DNA的延长并改变染料-猝灭剂对的距离，使得猝灭剂不再能够猝灭染料的天然荧光(活化探针)。此产生的荧光信号被定量并且表示与衔接子修饰的DNA的一对一关系。如果探针未识别出靶序列，则探针保持猝灭且无荧光(非活性探针)。

图4是本文提供的方法的某些实施方案的示意图，其中衔接子特异性探针包含DNA闪耀探针。DNA闪耀探针是单链DNA(ssDNA)寡聚体(灰色)，其具有从一个或多个核苷酸突出的掺入的荧光残基(星形)。染料的荧光在单链天然状态(猝灭探针)中自猝灭，但当探针与其靶序列(白色)退火时开启。此产生的荧光信号被定量并且表示与衔接子修饰的DNA(活化探针)的一对一关系。如果探针未识别出靶序列，则探针保持猝灭且无荧光(非活性探针)。

图5是本公开方法的某些实施方案的示意图，其中衔接子特异性探针包含锁定核酸(LNA)探针对。使用锁定核酸(LNA)寡聚体是因为它们对互补ssDNA的亲和力大于标准dsDNA双链体的亲和力。然而，因为LNA探针不能弯曲成发夹以形成信标，所以使用两个LNA探针。在该实施方案中，第一LNA探针(本文称为LNA探针#1)含有荧光标记(星形)和第二LNA探针(本文称为LNA探针#2)含有荧光猝灭剂(矩形)。将LNA探针#1和LNA探针#2都添加到含有靶序列(白色)和/或非互补序列(黑色)的DNA样品中。当LNA探针#1与靶序列结合时，它保持其荧光(激活的LNA探针)。过量LNA探针#1将被LNA探针#2结合，其中LNA探针#2上的猝灭剂部分猝灭来自LNA探针#1(非活性LNA探针)的荧光信号。最终结果是信号仅可从LNA探针#1/靶核酸双链体(活化LNA探针)观察到。该信号被定量并代表与衔接子修饰的DNA的一对一关系。如果探针未识别出靶序列，则探针将保持猝灭且无荧光(非活性LNA探针)。

图6A和6B是荧光染料(在该实施例中为荧光素(FAM))间距对DNA闪耀探针的荧光性的影响的图示。增加荧光团的间距(例如，大于10个碱基)对信噪比具有不利影响。

图7A和7B是寡核苷酸大小对DNA闪耀探针的荧光的影响的图示。增加DNA闪耀探针的寡核苷酸长度的大小增加了荧光而不增加背景信号。

图8A和8B是DNA闪耀探针的荧光性的图示。所示的所有DNA闪耀探针都是产生荧光的。间距小于3个碱基时，即使与互补核酸序列结合，荧光信号也会丧失。虽然总荧光强度降低，但背景也减少。背景的减少导致荧光团分子(FAM)之间间距4个碱基，荧光增加40倍(图8B)。

具体实施方式

现将详细参考本发明的某些实施方案，在附图中说明其实例。虽然将结合所示实施方案描述本发明，但应理解，它们并非旨在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖所有替代、修改和等同物，其可以包括在由所附权利要求限定的本发明内。

为了更清晰并简明地描述和指出本发明的主题，提供以下描述和所附权利要求书中所用的特定术语的以下定义。贯穿本说明书，特定术语的举例说明应该被视为非限制性实例。

除非另外确切地说明，否则如本说明书所使用，词语“一个(a/an)”意指至少一个。在本说明书中，除非另外确切地说明，否则单数的使用包括复数。举例来说，但不是作为限制，“靶核酸”意指可以存在一个以上靶核酸；举例来说，特定靶核酸物质的一或多个拷贝以及两个或两个以上不同的靶核酸物质。术语“和/或”意指在斜线之前和之后的术语可以连在一起或单独的。为了说明，但不是作为限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或“X”和“Y”。

应了解，在本发明中讨论的温度、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得微小并且非实质的偏差在本文中本教导的范围内。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“含有(contain或contains或containing)”和“包含(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应理解，以上一般描述和以下详细描述两者仅是例示性和解释性的并且并不限制教导内容。

除非在说明书中专门指出，否则在说明书中叙述“包含”各种组分的实施方案也涵盖“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；在说明书中叙述“由”各种组分“组成”的实施方案也涵盖“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；以及在说明书中叙述“基本上由”各种组分“组成”的实施例也涵盖“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(这种互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。

如本文中所用的术语“或其组合”是指在所述术语前面所列术语的所有排列和组合。举例来说，“A、B、C或其组合”打算包括以下各项中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定情况下顺序是重要的，那么还有BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续这个例子，明确地包括含有一或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟练技术人员将了解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语的数量的限制。

本文所用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为以任何方式限制所要主题。本说明书中引用的所有文献，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍以及论文，全都出于任何目的以全文引用的方式明确地并入本文中。在所并入的任何文献与本说明书中所定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各种实施例描述本发明教示，但是并不打算将本发明教示限制于这类实施例。相反，本发明教导涵盖各种替代方案、修改和等同物，如本领域的技术人员将理解的。

定义：

术语“退火(annealing)”和“杂交(hybridizing)”包括(但不限于)词根“杂交(hybridize)”和“退火(anneal)”的变体，可互换地使用并且意指一个核酸与另一个核酸的核苷酸碱基配对相互相用，所述相互作用促使形成双螺旋体、三螺旋体或其它更高的有序结构。根据沃森-克里克(Watson-Crick)和胡斯坦(Hoogsteen)型氢键结，初级相互相用通常具有核苷酸碱基特异性，例如A:T、A:U和G:C。在某些实施方案中，碱基堆积和疏水性相互作用也可以促成双螺旋体稳定性。引物和探针退火到互补序列的条件在本领域中是众所周知的，例如如在《核酸杂交的实用方法》(Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach),哈梅斯(Hames)和希金斯(Higgins)编,IRL出版社,华盛顿哥伦比亚特区(Washington,D.C.)(1985)以及维特莫(Wetmur)和戴维森(Davidson),《分子生物学》 (Mol.Biol.)31:349(1968)中所述。

一般来说，所述退火是否进行受以下各者等的影响：引物和/或探针的互补部分和其在靶核酸中的对应结合位点的长度，或探针的对应互补部分和其结合位点的长度；pH；温度；一价和二价阳离子的存在情况；杂交区中G和C核苷酸的比例；培养基的粘度；以及变性剂的存在情况。所述变量影响杂交所需的时间。因此，优选的退火条件将取决于特定应用而定。然而，在无过度实验的情况下，所述条件可以常规地由本领域的普通技术人员决定。优选地，选择以下退火条件：允许引物和/或探针选择性地与对应靶核酸中的互补序列杂交，但不以任何显著程度与反应混合物中的不同非靶核酸或非靶核酸序列杂交达。

术语“选择性地杂交”和其变体意指在恰当的严格性条件下，指定序列(例如但不限于引物或探针)与包含一系列互补核苷酸的第二序列(例如但不限于包含边合成边测序衔接子序列的靶核酸)退火，但不退火到不期望的序列，例如非靶核酸、探针或其它引物。通常，随着反应温度朝向特定双链序列的解链温度增加，选择性杂交的相对量一般增加并且错误引发一般减少。在本说明书中，一个序列与另一个序列杂交或选择性杂交的声明涵盖其中两个序列均整体彼此杂交或选择性杂交的情况，和其中所述序列中的一个或两个仅一部分杂交或选择性杂交到完整的另一个序列或另一个序列的一部分的情况。

如本文中所用的术语“变性(denaturing/denaturation)”是指其中双链多核苷酸适当时被转化为两条单链多核苷酸或一条单链或实质上单链多核苷酸的任何过程，所述双链多核苷酸包括(但不限于)DNA、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、包含至少一个靶核酸的基因组DNA(gDNA)片段、双链扩增子或包含至少一个双链区段的多核苷酸。使双链多核苷酸变性包括(但不限于)使得双链核酸变成单链或实质上单链的各种热技术和化学技术，例如(但不限于)释放出包含两种寡核苷酸的双链多核苷酸或双螺旋体的两个单独的单链组分。本领域的技术人员将了解，所采用的变性技术一般不是限制性的，除非它实质上干扰扩增反应的后续退火或酶促步骤，或在某些方法中干扰荧光信号的检测。

术语“互补性”和“互补的”是可互换的并且是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常通过反向平行的多核苷酸链或区域中的核苷酸单元之间的氢键形成的。互补的多核苷酸链或区域可以按沃森-克里克方式碱基配对(例如，A与T、A与U、C与G)。100％互补性是指其中一个多核苷酸链或区域的每个核苷酸单元都可以与第二多核苷酸链或区域的每个核苷酸单元发生氢键结的情况。“小于完全互补性”是指其中两个链或两个单元的一些但不是所有核苷酸单元可以彼此发生氢键结的情况。

如本文中所用，术语“基于核酸的探针”是指通过设计或选择，含有允许其在所限定的严格性下特异性地(即，优先地)杂交到靶核酸序列的特异性核苷酸序列的合成的或以生物方式产生的核酸(DNA、RNA、PNA、LNA等)，并且指本公开的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针。在本教导中，基于核酸的探针可以例如用荧光染料或包含荧光染料和荧光猝灭剂的一对标记进行标记以能够进行检测。在一些实施方案中，基于核酸的探针未杂交到互补序列时被至少部分地猝灭，并且当杂交到互补序列时被至少部分地未猝灭。

如本文所用，术语“定量PCR”、“qPCR”、“实时PCR”、“逆转录酶PCR”和“rtPCR”是指使用聚合酶链式反应(PCR)来定量基因表达。

如本文所用，术语“衔接子序列”和“衔接子”是可互换的，并且是指与如通过边合成边测序方法制备的测序文库中DNA片段的5'-末端和3'-末端结合的寡核苷酸的核酸序列，所述合成边测序方法例如Illumina测序平台(Illumina，Inc.，San Diego，CA)使用的并描述于美国专利5,798,210以及Canard和Sarfati，Gene 148：1-6(1994)中的方法。衔接子与Illumina测序流动池表面上存在的寡核苷酸层(lawn)互补，Illumina测序流动池是具有一个或多个物理上分开的泳道的玻璃载玻片，每个泳道涂有表面结合的衔接子互补寡核苷酸层。这种衔接子的实例包括但不限于Illumina通用衔接子或索引衔接子(Illumina,San Diego,CA)。图1描绘了使用Illumina边合成边测序平台的DNA的衔接子修饰，然后通过PCR或QUBIT^TM定量测定(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)定量核酸的示意图。

如本文所用，术语“靶分子”、“靶核酸分子”和“靶核酸”是可互换的，并且是指在本公开的方法中待分析的双链或单链核酸分子。在本公开的方法中，靶核酸包含至少一个衔接子序列。

靶核酸可以从任何来源获得，并且可以包含任何数量的不同组成性组分。举例来说，靶可以是核酸(例如，DNA或RNA)并且可以包含核酸类似物或其它核酸模拟物。靶可以经甲基化、非甲基化或两者。靶可以是经亚硫酸氢盐处理和非甲基化的被转化为尿嘧啶的胞嘧啶。此外，应了解“靶核酸”可以指靶核酸本身以及其代替物(例如扩增产物)以及天然序列。本传授内容的靶分子可以来源于任何数量的来源，包括(但不限于)病毒、古细菌、原生生物、原核生物和真核生物，例如(但不限于)植物、真菌和动物。这些来源可以包括(但不限于)全血、组织活检、淋巴、骨髓、羊水、毛发、皮肤、***、生物战剂、***分泌物、***分泌物、汗液、唾液、口腔拭子、各种环境样品(例如，农业、水和土壤)、一般研究样品、一般经纯化样品、经培养细胞以及溶解细胞。应当理解，可以使用本领域已知的任何各种方法从样品中分离靶核酸。应了解，靶核酸可以在分析之前进行切割或剪切，包括使用以下程序：例如机械力、声处理、限制性核酸内切酶裂解或本领域中已知的任何方法。一般来说，本教导的靶核酸将是双链，但是在一些实施方案中，靶核酸可以是单链。

如本文中所用，术语“发夹”和“茎-环”是可互换的并且用于表示其中寡核苷酸的一或多个部分与寡核苷酸的一或多个其它部分形成碱基对的寡核苷酸结构。当两个部分碱基配对形成寡核苷酸的双链部分时，所述双链部分可以被称作茎。因此，取决于所使用的互补部分的数量，可以形成许多茎；优选地，形成一个用于分子信标探针的茎。

如本文中所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换地使用并且是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键键联或核苷酸间类似物以及相关抗衡离子连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，所述抗衡离子例如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。寡核苷酸，如本文所使用的，包括天然的核酸分子(即DNA和RNA)以及非天然的或衍生的分子如肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、含有硫代磷酸酯的核酸、含有膦酸酯的核酸等。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括(但不限于)核苷酸和/或核苷酸类似物。当它们有时在本领域中被称为寡核苷酸或寡聚体时，多核苷酸的大小通常从几个单体单元例如5-40个到几千个或上百万个单体核苷酸单元不等。除非另外指出，否则每当呈现多核苷酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序并且除非另外指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。如本文所用，寡核苷酸可包含至少一种选自下组的修饰的磷酸酯骨架：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、氨基磷酸酯、二氨基膦酸酯，膦酸甲酯、烷基磷酸三酯及其甲缩醛或类似物。

术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是连接在戊糖的C-5位置的羟基。

术语“核苷”是指由连接到戊糖(包括2’-脱氧和2’-羟基形式)的1’位置的嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核苷碱基组成的化合物，所述碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、脱氮腺嘌呤、脱氮鸟苷等。当核苷碱基是嘌呤或7-脱氮嘌呤时，戊糖连接到嘌呤或脱氮嘌呤的9位核碱基；当核碱基是嘧啶时，戊糖连接到嘧啶的1位核碱基。

关于如本文中所述的用途，一或多个可检测标记和/或猝灭剂可以连接到一或多个探针(例如，可检测标记)。可检测标记可以在游离时或在结合到靶核酸中的一个时发射信号。可检测标记还可以在接近另一种可检测标记时发射信号。可检测标记也可以与能量转移分子一起使用，使得从一个标记发射的信号被吸收并从第二标记重新发射。可检测标记还可以与猝灭剂分子一起使用以使得信号仅仅在与猝灭剂分子不足够接近时才可检测。举例来说，在一些实施方案中，分析系统可以引起可检测标记从猝灭分子释放。可以使用若干可检测标记中的任一个来标记在本文中所述方法中所用的探针。当使用一个以上可检测标记时，每一个的光谱特性应该不同以使得所述标记可以彼此区分，或以使得可检测标记合起来发射任一可检测标记单独不发射的信号。例示性可检测标记包括例如荧光染料或荧光团(例如，可以通过光激发以发射荧光或磷光的化学基团)、能够猝灭荧光供体染料的荧光信号的“受体染料”和其中从一个标记发射的信号被吸收并从第二标记重新发射的共振能量转移分子(Resonance Energy Transfer molecules)(FRET)等。合适的可检测标记可包括荧光团，例如，芘(包括美国专利5,132,432中公开的相应的衍生化合物的任一种)、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)、花青(包括美国专利申请公开号2002/0077487和2002/0064794中的任何相应化合物)、羰花青(包括下述文献中的任何相应的化合物：美国专利4,981,977；5,268,486；5,569,587；5,569,766；5,486,616；5,627,027；5,808,044；5,877,310；6,002,003；6,004,536；6,008,373；6,043,025；6,127,134；6,130,094；6,133,445；6,664,047；6,974,873；6,977,305；PCT公开号WO 02/26891、WO 97/40104、WO 99/51702、WO 01/21624；和欧洲专利申请公开号EP 1 065 250 A1)、碳苯乙烯基(carbostyryl)、卟啉、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸盐、薁、二萘嵌苯、吡啶、喹啉、硼聚苯并氮杂吲哚(包括美国专利4,774,339；5,187,288；5,248,782；5,274,113；和5,433,896中公开的任何相应化合物)、呫吨(包括美国专利6,162,931；6,130,101；6,229,055；6,339,392；6,716,979和5,451,343中公开的任何相应化合物)、噁嗪(包括美国专利4,714,763中公开的任何相应化合物)或苯并噁嗪、卡巴嗪(包括美国专利4,810,636中公开的任何相应化合物)、非那烯酮(phenalenone)、香豆素(包括美国专利5,696,157；5,459,276；5,501,980和5,830,912中公开的相应化合物)、苯并呋喃(包括美国专利4,603,209和4,849,362中公开的相应化合物)和苯并非那烯酮(包括美国专利4,812,409中公开的任何相应化合物)及其衍生物。如本文所用，噁嗪包括羟基吩噁嗪酮(resorufins)(包括美国专利No.5,242,805中公开的任何相应化合物)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪和它们的苯并取代的类似物。如本领域技术人员已知的，也可以使用其他可检测标记。

对于如本文所述的用途，术语“猝灭剂”、“猝灭剂分子”和“荧光猝灭剂”是可互换的，并且是指吸收分子的天然荧光以使荧光观察不到的任何分子。此外，猝灭剂分子可以用FRET受体分子代替。出于测定的目的，这些概念是可互换的。

定量核酸的方法和其中使用的探针：

新一代测序(NGS)是一个快速发展的研究领域。可以获得基因组信息的新发现速度彻底改变了生物学研究。实际上，曾经需要数年才能获得的测序信息现在可以在几天内完成。存在几种主要的测序技术；然而，Illumina，Inc.(San Diego,CA)提供的平台目前是用于实验室研究人员的市场领先者。在Illumina工作流程的样品制备中，用户需要在几个点上定量其DNA样品：在片段化之前、在衔接子连接之前、和将样品加载到测序仪器上之前的连接之后。定量步骤至关重要，因为尽管该技术确实允许对基因组进行快速测序，但运行本身成本高昂且数据处理时间很长。用于进行DNA样品定量的最可信方法是荧光，使用QUBIT^TM荧光计和QUBIT^TM定量测定法(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和定量PCR(qPCR)得到。每种方法都有其优点和缺点。

QUBIT^TM定量测定法可在不到两分钟的时间内提供结果，并且可以在竞争RNA和单链(ssDNA)杂质存在的情况下进行。该技术依赖于嵌入荧光发生染料，当它与DNA结合并且仅与DNA结合时发出荧光信号。QUBIT^TM定量测定法以质量/体积(ng/μL)定量样品中的总DNA。不幸的是，NGS用户需要将这些单位转换成摩尔浓度(每体积的分子数)以便正确加载仪器。这种转换通常通过使用凝胶电泳仪器来完成，该仪器确定样品中DNA的平均大小。此测量的典型误差为±50％。因此，由于测量的DNA大小的误差，用户为其常常珍贵的DNA样品获得的摩尔值最多是50％准确。因此，虽然QUBIT^TM定量测定法本身非常强大并且提供可靠的数据，但遗憾的是NGS应用需要数据操作，其***的误差比典型用户所习惯的多5倍。

基于QUBIT^TM的定量的替代方案是实时PCR(rtPCR)，也称为定量PCR(qPCR)。这是一种基于特定序列的存在来扩增特定DNA分子的技术。仅扩增含有引物序列的DNA。使用基于引物序列读取的荧光报告来定量所得DNA，因此只能定量含有正确序列的DNA。这是非常有价值的，因为Illumina测序仪器仅对含有相同序列基序的DNA进行测序，使用户在样品制备中更精确，并对其结果更有信心。这种方法的权衡是设置和实验的6小时时间承诺。

在样品测序之前进行样品制备期间，用Illumina仪器测序的所有样品用衔接子DNA修饰，这在本文中称为边合成边测序衔接子或衔接子序列。这些特殊的DNA衔接子序列被整合到用户的DNA样品中，允许样品与Illumina测序技术接合(参见图1的示意图；也描述于美国专利5,798,210以及Canard和Sarfati，Gene 148：1-6(1994)中)。不含衔接子序列的样品DNA不会与仪器接合，因此无法测序。本文提供的用于检测和/或定量核酸的测定方法利用衔接子特异性探针，其是基于核酸的探针，其与保守的Illumina衔接子序列的全部或部分互补，从而允许靶特异性。结合后，衔接子特异性探针发出可测量的荧光信号。有利地，测量的荧光信号与衔接子修饰的DNA分子的数量成正比。只有含有衔接子序列的DNA才会触发探针的荧光响应。这允许用户仅定量其样品中已经用衔接子序列修饰并且能够测序的DNA。另外，因为荧光信号与衔接子修饰的DNA成一比一的比例；读出单位将以摩尔浓度计。这对于用户来说是理想的，因为这些单位需要继续测序应用。其他单位必须进行转换，并可在测量中引入误差。

本文所提供的方法的一个附加的有利特征是可选使用附加的基于核酸的探针(本文中称为“引物-二聚体检测探针”)，其与衔接子特异性探针可检测地不同(例如与其正交)。引物-二聚体检测探针允许在本文提供的方法中检测“引物-二聚体”假象。不希望受理论束缚，当将衔接子序列添加到靶DNA时，这些“引物-二聚体”假象来自不良修饰步骤。过多的引物-二聚体DNA的存在会干扰测序并导致实验不良或失败。通常，引物-二聚体检测探针由与衔接子特异性探针相同的技术组成(例如，PNA探针、分子信标、DNA闪耀探针或LNA探针对)，但引物-二聚体检测探针的荧光可检测地不同于衔接子特异性探针的荧光(例如，探针的荧光是正交的)。理想情况下，可以将衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针添加到同一样品中，并且用户将接收两个读数：一个来自衔接子特异性探针，第二个来自引物-二聚体检测探针。或者，用户可以使用两个单独的样品管并分别检测每个探针。例如，使用衔接子特异性探针的来自第一个样品管的信号将测量用于测序的靶DNA，并且使用引物-二聚体检测探针的来自第二个样品管的信号将测量引物-二聚体。

通常，本公开的方法利用基于寡核苷酸的独特的基于核酸的探针，其包含肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对。每种探针技术依赖于荧光信号，当基于核酸的探针与感兴趣靶标退火时，该荧光信号开启。有利地，该信号基于探针与靶标的一对一比率，并且当没有靶序列可用时，探针的荧光保持猝灭。在某些实施方案中，靶DNA序列是保守的Illumina衔接子序列。这种衔接子的实例包括但不限于Illumina通用衔接子或索引衔接子(Illumina,San Diego,CA)。在某些实施方案中，另外的探针，即“引物-二聚体检测探针”，用于靶向DNA“引物-二聚体”序列，其发生在衔接子序列形成二聚体而不是掺入用户的DNA样品中的情形。

在本公开的某些实施方案中，测定可以同时检测靶DNA的3'末端和5'末端的衔接子序列修饰。与边合成边测序衔接子的3'末端互补的衔接子特异性探针特异性地靶向靶核酸的衔接子序列修饰的3'末端。与边合成边测序衔接子的5'末端互补的衔接子特异性探针特异性地靶向靶核酸的衔接子序列修饰的5'末端。这些探针的荧光报告部分将彼此以及与引物-二聚体探针正交，允许探针分别地多路复用或分析。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于检测样品中的核酸的方法，所述方法包括：

a)将核酸探针与所述样品组合以制备探针-核酸混合物；

b)将所述探针-核酸混合物温育足够量的时间以使所述核酸探针与样品中的核酸杂交以创建探针-核酸复合物；

c)用适当波长的光照射所述探针-核酸复合物，以产生可检测的光学响应；和

d)检测所述可检测的光学响应，从而检测核酸。

在本公开的某些实施方案中，提供了用于定量样品中的核酸的方法，所述方法包括：

a)将核酸探针与所述样品组合以制备探针-核酸混合物；

b)将所述探针-核酸混合物温育足够量的时间以使所述核酸探针与样品中的核酸杂交以形成探针-核酸复合物；

c)用适当波长的光照射所述探针-核酸复合物，以产生可检测的光学响应；

d)检测所述可检测的光学响应；和

e)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的核酸。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含至少一个边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；和

c)将所述靶-探针混合物温育足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以创建探针-靶复合物。

在某些实施方案中，该方法还包括：

d)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；和

e)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶-探针混合物的样品，其中所述靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含至少一个边合成边测序衔接子序列，和ii)衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；和

c)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在本公开的某些另外的实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有一种或多种靶-探针混合物的样品，其中所述一种或多种靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含至少一个边合成边测序衔接子序列，和ii)一种或多种衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述一种或多种靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；和

c)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些实施方案中，所述样品包含两种靶-探针混合物。在某些实施方案中，所述样品包含三种靶-探针混合物。在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含至少一个边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；和

d)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物温育足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以创建第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物；

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些实施方案中，该方法还包括：

e)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

f)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应，从而检测样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。

在本公开的某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；和

c)将所述靶-探针混合物温育足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以创建探针-靶复合物。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括：

d)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；

e)检测所述可检测的光学响应；和

f)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含至少一个边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；和

d)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物温育足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以形成第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物；

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括：

e)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

f)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应，从而检测样品中的靶核酸；

g)将第一可检测光学响应和第二可检测光学响应与已知量的核酸进行比较，从而定量样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶-探针混合物的样品，其中所述靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含边合成边测序衔接子序列，和ii)衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；

c)检测所述可检测的光学响应；和

d)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的靶核酸。

在某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有一种或多种靶-探针混合物的样品，其中所述一种或多种靶-探针混合物包含i)靶核酸，其包含至少一个边合成边测序衔接子序列，和ii)一种或多种衔接子特异性探针，其包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

b)用适当波长的光照射所述一种或多种靶-探针混合物，以产生可检测的光学响应；和

c)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些实施方案中，所述样品包含两种靶-探针混合物。在某些实施方案中，所述样品包含三种靶-探针混合物。在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'-末端或5'-末端互补。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

c)加热所述靶-探针混合物足够量的时间以使所述靶核酸变性；

d)将所述靶-探针混合物冷却足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以创建探针-靶复合物；

e)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；和

f)检测所述可检测的光学响应，从而检测所述样品中的所述靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子的3'-末端或5'-末端区域互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；

d)加热第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物足够量的时间以使靶核酸变性；

e)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物冷却足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以创建第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物；

f)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二探针-靶复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

g)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应，从而检测样品中的靶核酸，

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与衔接子特异性探针组合，以创建靶-探针混合物，其中所述衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列互补的核酸序列；

c)加热所述靶-探针混合物足够量的时间以使所述靶核酸变性；

d)将所述靶-探针混合物冷却足够量的时间，以允许所述衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交，以创建探针-靶复合物；

e)用适当波长的光照射所述探针-靶复合物，以产生可检测的光学响应；

f)检测所述可检测的光学响应；和

g)将所述可检测的光学响应与核酸的已知量比较，从而定量所述样品中的靶核酸。

在某些优选的实施方案中，所述衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子的3'-末端或5'-末端区域互补。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本公开的某些实施方案中，提供了定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)提供含有靶核酸的样品，所述靶核酸包含边合成边测序衔接子序列；

b)将所述样品与第一衔接子特异性探针组合，以创建第一靶-探针混合物，其中所述第一衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第一区域互补的核酸序列；

c)将所述样品与第二衔接子特异性探针组合，以创建第二靶-探针混合物，其中所述第二衔接子特异性探针包含与所述边合成边测序衔接子序列的第二区域互补的核酸序列；

d)加热第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物足够量的时间以使靶核酸变性；

e)将第一靶-探针混合物和第二靶-探针混合物冷却足够量的时间以使第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针与所述靶核酸杂交以创建第一探针-靶复合物和第二靶-探针复合物；

f)用适当波长的光照射第一探针-靶复合物和第二靶-探针复合物，以产生第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；

g)检测第一可检测光学响应和第二可检测光学响应；和

h)将第一可检测光学响应和第二可检测光学响应与已知量的核酸进行比较，从而定量样品中的靶核酸，

其中第一衔接子特异性探针和第二衔接子特异性探针是可检测地不同的。

在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是3'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是5'末端区域。在某些优选的实施方案中，所述边合成边测序衔接子序列的第一区域是5'末端区域，并且所述边合成边测序衔接子序列的第二区域是3'末端区域。在某些优选的实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的3'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的5'末端互补。在某些实施方案中，第一衔接子特异性探针与所述通过合成衔接头序列的测序的5'末端互补并且第二衔接子特异性探针与边合成边测序衔接子序列的3'末端互补。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)同时进行。在某些实施方案中，步骤(b)和步骤(c)顺序进行。在某些优选的实施方案中，所述可检测光学响应正比于样品中存在的靶核酸的量。

在本文提供的方法的某些实施方案中，靶核酸是双链DNA。

在本文提供的方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含与边合成边测序衔接子序列或其部分互补的寡核苷酸序列和荧光染料。在本文提供的方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针还包含荧光猝灭剂。在本文提供的方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针是肽核酸(PNA)寡聚体探针、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂直接附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂共价附接于衔接子特异性探针的一个或多个核苷酸。

在本文提供的某些实施方案中，衔接子特异性探针是肽核酸(PNA)寡聚体，其包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序衔接子的核酸序列互补。

在本文提供的某些实施方案中，衔接子特异性探针是分子信标，所述分子信标包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的荧光猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的18个核苷酸。

在本文提供的其他某些实施方案中，衔接子特异性探针是单链DNA闪耀探针，其包含与一个或多个核苷酸共价连接的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的28个核苷酸。在某些实施方案中，DNA闪耀探针是双链的。

在本文提供的某些实施方案中，衔接子特异性探针是锁定核酸(LNA)探针对，其包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补(例如与第一LNA探针互补)的一系列核苷酸。

在本文提供的方法的某些实施方案中，所述方法还包括将引物-二聚体检测探针添加至靶-探针混合物，其中引物-二聚体检测探针具有可检测的光学响应，其可与衔接子特异性探针的可检测的光学响应区分。

在本文提供的方法的某些实施方案中，检测步骤通过荧光测定法进行。在本文提供的方法的某些实施方案中，样品在微量离心管或多孔板中。在某些优选的实施方案中，检测步骤在QUBIT^TM荧光计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)上进行。

在本文提供的某些实施方案中，边合成边测序衔接子是通用衔接子或索引衔接子(Illumina,San Diego,CA)。

基于核酸的肽核酸(PNA)寡聚体探针：

如图2所示，在本文所述方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含基于核酸的肽核酸(PNA)寡聚体探针，其对应于感兴趣的靶核酸序列，也称为边合成边测序衔接子序列，其中PNA寡聚体的N-末端用荧光染料标记，PNA寡聚体的C-末端用猝灭剂标记。在水溶液中，PNA寡聚体自身折叠，并且猝灭剂与荧光染料的紧密接近导致可忽略的荧光信号。然而，在互补DNA序列，例如Illumina衔接子序列存在下，PNA寡聚体展开并与靶DNA结合。当退火时，未折叠双链PNA寡聚体增加染料-猝灭剂对之间的距离，使得猝灭剂不再能够猝灭染料的天然荧光。使用本文公开的方法定量此得到的荧光信号，并有利地表示与衔接子修饰的DNA的一对一关系。如果探针未识别出靶序列，则探针保持猝灭且无荧光。

在某些实施方案中，提供了衔接子特异性探针，该探针包含肽核酸(PNA)寡聚体，其包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序衔接子的核酸序列互补。

基于核酸的分子信标探针：

如图3所示，在本文所述方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含基于核酸的分子信标探针，其是组织成由30-50个核苷酸组成的发夹环的DNA寡聚体，其含有对应于感兴趣的序列的环区以及互补的茎区。茎的5'末端用荧光染料标记，3'-茎末端用猝灭剂标记。天然地，5-7个核苷酸的茎序列对齐，导致猝灭剂与荧光染料紧密接近，导致可忽略的荧光信号。然而，在存在互补DNA序列，例如Illumina衔接子序列的情况下，分子信标茎未退火，并且环区可自由结合靶DNA。这导致DNA的延长并改变染料-猝灭剂对的距离，使得猝灭剂不再能够猝灭染料的天然荧光。使用本文描述的方法定量此得到的荧光信号，并且有利地表示与衔接子修饰的DNA的一对一关系。如果探针没有识别出靶序列，它将保持猝灭并且不发荧光。

在某些实施方案中，提供衔接子特异性探针，该探针包含分子信标探针，所述分子信标探针包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的18个核苷酸。

基于核酸的DNA闪耀探针：

如图4所示，在本文所述方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含基于核酸的DNA闪耀探针，其包含ssDNA寡聚体，其包含附接于核苷酸的掺入的荧光残基。染料的荧光在单链天然状态下是自猝灭的，但是当探针与其靶序列退火时开启。使用本文描述的方法定量得到的荧光信号，并且有利地表示与衔接子修饰的DNA的一对一关系。如果探针未识别出靶序列，则探针保持猝灭且无荧光。

在某些实施方案中，提供了衔接子特异性探针，该探针包含单链DNA闪耀探针，其包含与一个或多个核苷酸共价连接的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的28个核苷酸。在某些实施方案中，本文提供的DNA闪耀探针在荧光染料分子之间具有至少4个碱基的分开。在某些实施方案中，DNA闪耀探针在荧光染料分子之间具有至少5个碱基、至少6个碱基、至少7个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基或至少10个碱基的分开。在某些实施方案中，寡核苷酸序列与边合成边测序衔接子的核酸序列的全部或部分互补。

锁定核酸(LNA)探针对：

如图5所示，在本文描述的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其包含：第一LNA探针(称为LNA探针#1)，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针(称为LNA探针#2)，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补(例如与LNA探针#1互补)的一系列核苷酸。在某些实施方案中，与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸是8-12个核苷酸。在该实施方案中，LNA探针#1含有荧光标记，LNA探针#2含有荧光猝灭剂。将LNA探针#1和LNA探针#2都添加到含有靶序列和/或非互补序列的DNA样品中。当LNA探针#1与靶序列结合时，它保持其荧光。过量LNA探针#1将被LNA探针#2结合，其中LNA探针#2上的猝灭剂部分猝灭来自LNA探针#1的荧光信号。最终结果是信号仅可从LNA探针#1/靶核酸双链体观察到。该信号被定量并代表与衔接子修饰的DNA的一对一关系。如果探针未识别出靶序列，则探针将保持猝灭且无荧光。

引物-二聚体检测探针：

在某些实施方案中，提供了引物-二聚体检测探针，其靶序列是两个连接的引物序列之间的重叠区域。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含：与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的寡核苷酸序列；和荧光染料。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针还包含猝灭剂。在某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含肽核酸(PNA)寡聚体探针、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂直接附接于引物-二聚体探针的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，荧光染料和/或猝灭剂共价附接于引物-二聚体探针的一个或多个核苷酸。

在本文提供的方法的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含肽核酸(PNA)寡聚体，其包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补。引物-二聚体检测探针中使用的荧光染料和猝灭剂可检测地不同于衔接子特异性探针中使用的荧光染料和猝灭剂。

在本文提供的方法的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含分子信标，所述分子信标包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的18个核苷酸。引物-二聚体检测探针中使用的荧光染料和猝灭剂可检测地不同于衔接子特异性探针中使用的荧光染料和猝灭剂。

在本文提供的方法的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含DNA闪耀探针，其包含与一个或多个核苷酸共价连接的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的28个核苷酸。引物-二聚体检测探针中使用的荧光染料可检测地不同于衔接子特异性探针中使用的荧光染料。

在本文提供的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补(例如与第一LNA探针互补)的一系列核苷酸。在某些实施方案中，第一LNA探针包含与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的8-12个核苷酸。引物-二聚体检测探针中使用的荧光染料和猝灭剂可检测地不同于衔接子特异性探针中使用的荧光染料和猝灭剂。

在某些实施方案中，与本文公开的基于核酸的探针(例如，衔接子特异性探针和/或引物-二聚体检测探针)连接的一种或多种荧光染料选自但不限于选自芘、呫吨、花青、吲哚、苯并呋喃、香豆素或硼聚苯并氮杂吲哚的基团。在某些实施方案中，与本文公开的基于核酸的探针(例如，衔接子特异性探针和/或引物-二聚体检测探针)连接的一种或多种猝灭剂选自BLACK HOLE染料(Biosearch Technologies Inc.,Petaluma,CA)、IOWA 猝灭剂(Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)、猝灭剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、Dabsyl、Dabcel、Deep Dark猝灭剂(Kaneka Eurogentec,S.A.,Seraing,Belgium)和猝灭剂(Glen Research,Sterling,VA)。在某些实施方案中，荧光团-猝灭剂组合选自下表1中列出的那些。

(*ALEXA FLUOR,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)

试剂盒

还提供了用于执行本文中所述的方法的试剂盒。如本文中所用，术语“试剂盒”是指一组包装好的相关组分，通常是一或多种化合物或组合物。试剂盒可包含一种或多种基于核酸的探针，用于定量来自样品的至少一种靶核酸。所述试剂盒还可以包括含有用于对照反应中的预定义靶核酸的样品。所述试剂盒还可以任选地包括储备溶液、缓冲液、酶、可检测标记或检测所需试剂、管子、膜以及可以用于定量靶核酸的类似物。

在某些实施方案中，提供了用于检测或定量核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：一种或多种衔接子特异性探针；缓冲液；和根据本文描述的一种或多种方法检测或定量核酸的说明书。在某些实施方案中，试剂盒包含两种衔接子特异性探针。在某些实施方案中，试剂盒还包含引物-二聚体检测探针。

在本文提供的试剂盒的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含肽核酸(PNA)寡聚体，其包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序衔接子的核酸序列互补。在本文提供的试剂盒的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含分子信标，所述分子信标包含附接于分子信标的5'末端的荧光染料、附接于分子信标的3'末端的猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的18个核苷酸。在本文提供的试剂盒的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含单链DNA闪耀探针，其包含与一个或多个核苷酸共价连接的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的28个核苷酸。在本文提供的试剂盒的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序衔接子的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补(例如与第一LNA探针互补)的一系列核苷酸。

在本文提供的试剂盒的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含肽核酸(PNA)寡聚体，其包含附接于PNA寡聚体的N-末端的荧光染料、附接于PNA寡聚体的C-末端的猝灭剂和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸。在某些实施方案中，PNA寡聚体包含8-12个核苷酸，其与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补。在本文提供的方法的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含分子信标，所述分子信标包含附接于5'末端的荧光染料、附接于3'末端的猝灭剂、和环部分中的与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的18个核苷酸。在本文提供的方法的某些实施方案中，引物-二聚体检测探针包含DNA闪耀探针，其包含与一个或多个核苷酸共价连接的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的28个核苷酸。在本文提供的方法的某些实施方案中，衔接子特异性探针包含锁定核酸(LNA)探针对，其包含：第一LNA探针，其包含附接于第一探针的3'末端或5'末端的荧光染料和与边合成边测序引物-二聚体的核酸序列互补的一系列核苷酸；和第二LNA探针，其包含附接于第二探针的3'末端或5'末端的荧光猝灭剂和与第一LNA探针的核酸序列互补(例如与第一LNA探针互补)的一系列核苷酸。任何引物-二聚体检测探针中使用的荧光染料或荧光染料-猝灭剂对可检测地与衔接子特异性探针中使用的荧光染料和猝灭剂不同。

优选的试剂盒可以包含一或多个被配置成用于包含用于本文中所述方法中的试剂的容器，例如小瓶、管子等，所述试剂包括基于核酸的探针、缓冲液等，并且任选地可以包含根据本文公开的方法使用所述试剂的说明书或方案。本文所述的试剂盒可包含一种或多种选自本文所述的一种或多种寡核苷酸的组分，包括但不限于一种或多种基于核酸的探针，例如衔接子特异性探针或引物二聚体检测探针。

这样的试剂盒可以从容易获得的材料和试剂制备，并且可以有多种实施方案。试剂盒的内容物取决于用于检测或测量的方法或测定方案的设计。通常，说明书包括有形表达，其描述试剂浓度或至少一种测定方法参数，例如待一起加入的试剂和样品的相对量、试剂/样品混合物的维持时间段、温度、缓冲条件等，以允许用户执行上述任何一种方法或准备。在一个方面，配制试剂盒以促进多个样品的高通量筛选，例如可以使用自动化方法完成。

因此，用于检测样品中的核酸的试剂盒可包含一种或多种如上所述的衔接子特异性探针。试剂盒可以进一步包含一种或多种引物-二聚体检测探针。试剂盒可以进一步包括用于进行一种或多种上述公开方法(包括核酸的检测和/或定量)的说明书，例如用于下一代测序应用的DNA。

试剂盒可任选地进一步包括以下一种或多种：样品制备试剂、缓冲剂、核酸标准品、含水核酸报告分子稀释缓冲液或有机溶剂。

实施例1：用于定量用于下一代测序(Illumina平台)的DNA样品的示例性方法

在该实施例中描述的方法中，基于肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对，使用独特的基于核酸的探针(例如，衔接子特异性探针和/或引物-二聚体检测探针)，并且靶DNA序列包含保守的Illumina衔接子序列。以下详述本实施例中使用的方法和材料。基于核酸的探针可以是PNA、分子信标、DNA闪耀或LNA类型中的任何一种，但是对于标准品和样品，探针的类型必须相同。

所需材料：

·具有Illumina衔接子修饰的dsDNA样品

·基于核酸的探针，其含有等量的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针(PNA、分子信标、DNA闪耀或基于LNA的探针)

·热板或加热装置

·微量离心管或96孔板

·缓冲液

用户工作流程：

步骤1.将0.5mL微量离心管标记为“样品”并合并：

a.5μL基于核酸的探针(含有等量的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针)

b.2μL DNA样品

c.193μL缓冲液

步骤2.对所有样品和重复，重复步骤1。

步骤3.将0.5mL微量离心管标记为“标准#1”并合并：

a.5μL基于核酸的探针(含有等量的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针)

b.10μL标准#1

c.195μL缓冲液

步骤4.将0.5mL微量离心管标记为“标准#2”并合并：

a.5μL基于核酸的探针(含有等量的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针)

b.10μL标准#2

c.195μL缓冲液

步骤5.将所有样品样品加热至90℃持续5分钟，以使样品dsDNA完全变性。

步骤6.将样品冷却至70℃持续2分钟，使探针识别靶序列。

步骤7.让样品冷却至室温。

步骤8.测量样品的荧光：

a.使用QUBIT^TM荧光计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)

i.读取标有“标准#1”和“标准#2”的样品。这校准仪器并允许正确解释未知样品。

ii.测量每个未知样品。该仪器将报告含有衔接子序列和引物-二聚体的样品的浓度，使用基于摩尔浓度的单位(相对于体积的含有这些特定基序的样品中的DNA分子数)。

iii.重复所有样品

b.使用读板器

i.将每个样品管的内容物转移到96孔微孔板中。

ii.使用衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针的适当激发和发射，读取样品的荧光。

iii.使用标准#1和标准#2的值，准备线性回归，其中存在的每个探针的RFU＝样品浓度*m+b。

iv.重新排列方程使得样品浓度＝(RFU-b)/m，并使用每个未知样品测量RFU值来求解方程。

QUBIT^TM荧光计仪器测量两种基于核酸的探针(衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针)的荧光，并使用标准曲线，为用户提供(或对于读板器，允许用户计算)衔接子修饰的DNA和引物-二聚体的摩尔浓度。

实施例2-用于定量用于下一代测序(Illumina平台)的DNA样品的示例性方法

在该实施例中描述的方法中，基于肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标探针、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对，使用独特的基于核酸的探针(例如，衔接子特异性探针和/或引物-二聚体检测探针)，并且靶DNA序列包含保守的Illumina衔接子序列。以下详述本实施例中使用的方法和材料。基于核酸的探针可以是PNA、分子信标、DNA闪耀或LNA类型中的任何一种，但是对于标准品和样品，探针的类型必须相同。

所需材料：

·具有Illumina衔接子修饰的dsDNA样品

·基于核酸的探针，其含有等量的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针(PNA、分子信标、DNA闪耀或基于LNA的探针)

·微量离心管或96孔板

·缓冲液

用户工作流程：

步骤1.将0.5mL微量离心管标记为“样品”并合并：

a.5μL基于核酸的探针(含有等量的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针)

b.2μL DNA样品

c.193μL缓冲液

步骤2.对所有样品和重复，重复步骤1。

步骤3.将0.5mL微量离心管标记为“标准#1”并合并：

a.5μL基于核酸的探针(含有等量的衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针)

b.10μL标准#1

c.195μL缓冲液

步骤4.将0.5mL微量离心管标记为“标准#2”并合并：

a.5μL基于核酸的探针(含有等量的测定中含有的所有探针)

b.10μL标准#2

c.195μL缓冲液

步骤5.混合样品并允许温育。

步骤6.测量样品的荧光：

a.使用QUBIT^TM荧光计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)

i.读取标有“标准#1”和“标准#2”的样品。这校准仪器并允许正确解释未知样品。

ii.对于包含多个探针的系统，每个附加探针都需要标准#2。

iii.测量每个未知样品。该仪器将报告含有衔接子序列和引物-二聚体的样品的浓度，使用基于摩尔浓度的单位(相对于体积的含有这些特定基序的样品中的DNA分子数)。

iv.重复所有样品

b.使用读板器

i.将每个样品管的内容物转移到96孔微孔板中。

ii.使用衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针的适当激发和发射，读取样品的荧光。

iii.使用标准#1和标准#2的值，准备线性回归，其中存在的所有探针的RFU＝样品浓度*m+b。

iv.重新排列方程使得样品浓度＝(RFU-b)/m，并使用每个未知样品测量RFU值来求解方程。

QUBIT^TM荧光计仪器测量两种基于核酸的探针(衔接子特异性探针和引物-二聚体检测探针)的荧光，并使用标准曲线，为用户提供(或对于读板器，允许用户计算)衔接子修饰的DNA和引物-二聚体的摩尔浓度。

实施例3-DNA闪耀探针构建和分析

使用FAM-dT作为荧光染料，使用氨基磷酸酯化学构建用作DNA闪耀探针的寡核苷酸。FAM-dT在示例性DNA闪耀探针中的核苷酸序列和位置列于表2和3中。

在表2和3中，基于FAM的数量、间距和总长度给出每个序列的名称(例如5FAM12-63表示五个FAM分子，在63个核苷酸(nt)长序列中间距12个碱基)。创建未修饰的反向互补寡核苷酸以模拟靶系统中的互补并标记为comp-x，例如Comp-63。图6A-8B所示的数据通过评估单链探针的荧光(猝灭状态)，然后在探针退火至其互补物(未猝灭状态)后测量荧光而获得。两个值的比率产生荧光的倍数增加。在表2中，改变了所有三个参数(寡核苷酸长度、荧光染料分子数和染料分子之间的间距)。仅两种非荧光发生的探针是具有单一荧光染料和3FAM-32的寡核苷酸，其显示若荧光染料间距很远，则发生猝灭并且是不可逆的(参见图6A和6B)。在表3中，荧光染料分子计数保持稳定在6并且荧光染料分子之间的间距从11个碱基依次减少到3个碱基，这也减少了寡核苷酸的总长度。然而，寡核苷酸的总长度似乎对DNA闪耀的荧光没有太大影响(参见图7A和7B)。当荧光染料分子间距3个碱基时大部分荧光丧失并且荧光信号的一半在4个碱基分开时丧失(参见图8A)，但是在4个碱基分开时噪声显著降低，这导致该构建体的荧光增加倍数超过40(参见图8B)。

实施例4-使用单探针系统的检测和分析。

对Illumina衔接子序列的3'末端或5'末端特异的单一荧光探针用于定量已被修饰以包含边合成边测序衔接子序列的DNA样品的程度。探针本身可以是肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标探针(DNA发夹)、DNA闪耀探针或锁定核酸(LNA)探针对，并且靶DNA序列包含保守的Illumina衔接子序列。一旦识别出靶序列，所述探针发出可检测信号，该信号正比于样品中存在的靶序列的量。在没有靶序列的情况下，探针发出的信号可以忽略不计。

实施例5-使用双探针系统的检测和分析。

两个荧光探针(一个特异于边合成边测序衔接子序列的3'末端或5'末端，第二个特异于引物-二聚体序列)用于定量已被修饰为含有边合成边测序衔接子序列的DNA样品。探针可以是肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标探针(DNA发夹)、DNA闪耀探针、锁定核酸(LNA)探针对或其组合。靶DNA序列包含保守的边合成边测序衔接子序列。一旦识别出靶序列，所述探针发射可检测信号，该信号正比于样品中存在的靶序列的量。在没有靶序列的情况下，探针发出的信号可以忽略不计。该方法实现单一衔接子修饰的程度的直接定量以及引物-二聚体序列的检测。

两个荧光探针(一个特异于边合成边测序衔接子序列的3'末端，第二个特异于边合成边测序衔接子序列的5'末端)用于定量已修饰为包含边合成边测序衔接子序列的DNA样品。探针可以是肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标探针(DNA发夹)、DNA闪耀探针、锁定核酸(LNA)探针对或其组合。靶DNA序列包含保守的Illumina衔接子序列。一旦识别出靶序列，所述探针发射可检测信号，该信号正比于样品中存在的靶序列的量。在没有靶序列的情况下，探针发出的信号可以忽略不计。该方法能够直接定量完整衔接子修饰的程度。

实施例6-使用三部分探针系统的检测和分析。

三个荧光探针(一个特异于边合成边测序衔接子序列的3'末端、第二个特异于边合成边测序衔接子序列的5'末端、第三个特异于Illumina引物-二聚体序列)用于定量已经修饰以包含Illumina衔接子序列的DNA样品。探针可以是肽核酸(PNA)寡聚体、分子信标探针(DNA发夹)、DNA闪耀探针、锁定核酸(LNA)探针对或其组合。靶DNA序列包含通过合成衔接子序列的保守测序。一旦识别出靶序列，所述探针发射可检测信号，该信号正比于样品中存在的靶序列的量。在没有靶序列的情况下，探针发出的信号可以忽略不计。该方法实现完整衔接子修饰的程度的直接定量以及引物-二聚体序列的检测。

虽然已经在本文中显示和描述本发明的优选实施方案，但本领域的技术人员应清楚这类实施方案仅是作为实例而提供的。本领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下想到众多变化、改变和取代。应理解，本文所描述的本发明的实施方案的各个替代方案都可以用于实践本发明。预期随附权利要求限定本发明的范围并且因此覆盖这些权利要求和其同等物的范围内的方法和结构。