一种对化学修饰的dna进行原位表征的方法

文档序号：1916850 发布日期：2021-12-03 浏览：10次 >En<

阅读说明：本技术 一种对化学修饰的dna进行原位表征的方法 (Method for in-situ characterization of chemically modified DNA ) 是由李峰王冠唐娅楠于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种对化学修饰的DNA进行原位表征的方法。化学修饰是扩展天然DNA化学多样性和功能的有效途径。然而,当化学修饰的寡核苷酸用于基于DNA的反应或结构中时,预测和控制它们的动力学和热力学变得相当困难。为了应对这一挑战,本发明的方法中引入了DNA天平和砝码探针,其能够测量化学修饰的DNA在其天然环境中的临界热力学和动力学特性,例如吉布斯自由能和杂交速率常数的变化。该方法不仅可以测量稳定的化学修饰,还解决了涉及不稳定化学修饰和瞬态异构化反应的更具挑战性的问题。该方法在生物学、生物医学、材料科学、纳米光子学和纳米电子学等领域具有非常好的潜在应用价值。(The invention discloses a method for carrying out in-situ characterization on chemically modified DNA. Chemical modification is an effective way to expand the chemical diversity and function of natural DNA. However, when chemically modified oligonucleotides are used in DNA-based reactions or structures, predicting and controlling their kinetics and thermodynamics becomes quite difficult. To address this challenge, the method of the present invention incorporates a DNA balance and weight probe that is capable of measuring the critical thermodynamic and kinetic properties of chemically modified DNA in its natural environment, such as changes in gibbs free energy and hybridization rate constants. This method not only allows for the measurement of stable chemical modifications, but also solves the more challenging problems related to unstable chemical modifications and transient isomerization reactions. The method has very good potential application value in the fields of biology, biomedicine, material science, nanophotonics, nanoelectronics and the like.)

一种对化学修饰的DNA进行原位表征的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种对化学修饰的DNA进行原位表征的方法及其应用。

背景技术

除了存储和传输遗传信息的生物学作用之外，DNA也已经出现在高度可编程的工程材料中，用于构建各种纳米结构和纳米器件。DNA纳米技术的研究领域在控制分子自组装的能力方面具有革命性，因此不仅对材料科学，而且对分子计算、生物传感、诊断和治疗学产生了显著影响。将DNA与任何其他工程材料区分的最大优势之一是基于独特的Watson-Crick碱基配对规则的可预测性。重要的热力学参数，诸如标准吉布斯自由能(ΔG°)，可以使用NUPACK等计算机工具准确预测。这种计算机工具在设计核酸杂交探针和用于各种应用的构建模块方面发挥了关键作用。热力学参数的更高级用途进一步支持了用于鉴别单核苷酸变体的超特异性杂交探针和引物的模拟指导开发。关键动力学参数，例如速率常数，也为toehold介导的链置换反应建立了良好的基础，这是一类动态DNA纳米技术的重要组成部分，使得能够使用计算机工具诸如Visual DSD模拟复杂的DNA反应网络。

为了进一步扩展DNA的化学多样性和功能性，引入了大量化学修饰，以能够增加核酸酶抗性，调节基因表达，或允许杂交事件的空间/时间控制。在使DNA的化学性质显著多样化的同时，由于化学修饰所产生的变化，杂交动力学和热力学的准确预测变得困难。可使用等温滴定量热法(ITC)、差示扫描量热法(DSC)或DNA熔融分析来测量临界热力学参数如ΔG°和Tm。然而，这些方法通常需要繁琐的操作和加热程序，因此难以在其天然环境中测量化学修饰的DNA。现有的工具也局限于不稳定的DNA修饰，例如许多光转换分子，包括偶氮苯、螺吡喃、二芳基乙烯和半硫靛等。此外，现有技术没有提供动力学分析，因为仅记录了静态平衡状态。因此，非常需要一种简单、通用和快速的方法来测量其天然形式的化学修饰DNA的热力学和动力学特性。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种对DNA的化学修饰进行检测的方法，其包括如下步骤：

(1)根据目标DNA链T，制备链C和砝码W；

(2)使链T与C杂交，得链CT；

(3)使链CT与砝码W反应，检测；

其中，链T为单链DNA，将其分为片段S₁和S₂(即链T为S₁-S₂)，其中片段S₂中包含至少一处化学修饰；

链C为单链DNA，其由片段S_r、S_m、S_f依次连接组成(即链C为S_r-S_m-S_f)，其中S_r和S_m分别为S₁和S₂的互补序列(即片段S_r-S_m为S₁-S₂的互补序列)，S_f为toehold序列；

链C和链T分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

砝码W为单链DNA，其由片段W_f和W_r连接组成(即砝码W为W_f-W_r)，其中W_r为S_m的互补序列，W_f为S_f的一部分的互补序列，且W_f-W_r与S_m-S_f互补。

在本发明的一些实施例中，化学修饰为甲基化修饰，例如，在CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。

在本发明的一些实施例中，化学修饰为光敏感分子修饰，特别是在DNA骨架上以化学键的形式嵌入光敏感分子残基；具体地，光敏感分子可以选自：偶氮苯、螺吡喃、二芳基乙烯、半硫靛、芪、俘精酸酐等中的一种或多种，特别是偶氮苯。

具体地，化学修饰的位置可以为链T的磷酸骨架、碱基或核糖体部分。

具体地，链T中包含至少一个X结构，X为R为光敏感分子残基；更具体地，R为偶氮类化合物残基，例如，等。

具体地，化学修饰的数量可以为1或2个以上。

具体地，链T的长度可以为15nt以上(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100nt)，特别是15-100nt，15-50nt，15-40nt，15-30nt，15-25nt，20nt。

具体地，S_r的长度可以为1-14nt，特别是4-10nt(例如4、5、6、7、8、9、10nt)；在本发明的一些实施例中，S_r的长度为5-10nt。

具体地，S_f的长度可以为2nt以上，例如2-20nt，特别是4-10nt(例如4、5、6、7、8、9、10nt)；在本发明的一些实施例中，S_f的长度为10nt，其中W_f的长度可以为1-9nt(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9nt)，特别是3-9nt。

在本发明的一些实施例中，S_f包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由其组成。

具体地，砝码W可以为一个，也可以为多个，特别是通过分别调整片段W_f和W_r的长度，可以得到一组砝码，“较重的”DNA砝码被设计为比“较轻的”DNA砝码含有更长的W_f和/或更短的W_r。

具体地，荧光报告基团可以为，例如，FAM、Texas Red、ROX、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、LC RED640、LC RED705等。

具体地，荧光淬灭基团可以为，例如，TAMRA、DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3等。

具体地，步骤(2)包括：将链C和链T在缓冲液中混合，退火。

具体地，退火步骤包括：将包含链C和链T的缓冲液加热至90℃并保持5分钟，然后每2分钟降温5℃，直到温度达到20℃。

具体地，该方法还包括去皮(taring)步骤：

使链T₀与C杂交，得对照链CT₀；

使对照链CT₀与砝码W反应，检测；

其中链T₀与链T序列相同但不包含化学修饰。

具体地，检测可以包括荧光信号的检测。

具体地，步骤(3)中的反应温度可以为20-30℃，例如室温。

具体地，该方法还包括计算步骤，例如将检测结果经过计算转换为热力学和动力学参数，例如吉布斯自由能、反应速率常数等，进一步地，与对照链CT₀的热力学和动力学结果进行比较，可获得化学修饰引起的热力学和动力学变化。

具体地，该方法可用于表征化学修饰DNA的热力学和动力学参数，例如定量检测杂交和光异构化的吉布斯自由能变化、杂交和光异构化的反应速率常数等。

在本发明的一些实施例中，链T如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一些实施例中，链C包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或由其组成。

在本发明的一些实施例中，砝码W选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列中的一种或多种。

本发明还提供上述方法在对化学修饰的DNA的表征中的应用。

具体地，化学修饰可以为甲基化修饰，例如，在CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。

具体地，化学修饰也可以为光敏感分子修饰；具体地，光敏感分子可以选自：偶氮苯、螺吡喃、二芳基乙烯、半硫靛、芪、俘精酸酐等中的一种或多种，特别是偶氮苯。

具体地，化学修饰的位置可以为链T的磷酸骨架、碱基或核糖体部分。

具体地，化学修饰的DNA中包含至少一个X结构，X为R为光敏感分子残基；更具体地，R为偶氮类化合物残基，例如，等。

具体地，该表征包括化学修饰DNA的热力学和动力学参数的表征，例如，杂交和光异构化的吉布斯自由能变化、杂交和光异构化的反应速率常数等的定量。

本发明还提供上述方法在待化学修饰的DNA序列的设计指导和评估中的应用。

具体地，该设计指导和评估涉及修饰位置、修饰数目、修饰位置相邻核苷酸的设计指导和评估等。

本发明还提供上述方法在光敏核酸、光控DNA材料、光控DNA纳米装置、光控基因表达系统等的制备中的应用。

具体地，上述光敏核酸、光控DNA材料、光控DNA纳米装置、光控基因表达系统通过包含在DNA骨架上以化学键的形式嵌入光敏感分子残基的步骤来制备。

具体地，光敏感分子可以选自：偶氮苯、螺吡喃、二芳基乙烯、半硫靛、芪、俘精酸酐等中的一种或多种，特别是偶氮苯。

具体地，嵌入的光敏感分子残基可以为偶氮类化合物残基，例如，等。

具体地，光控DNA纳米装置包括，例如，光敏DNA镊子、光敏DNA行者、光控DNA纳米胶囊等(如“冯西平，张宏.由偶氮苯修饰DNA构建的光控纳米装置应用及展望[J].化工新型材料，2016：34-36.”中所述)。

本发明还提供上述方法在DNA修饰的检测中的应用。

本发明还提供上述方法在由DNA的化学修饰引起的基因损伤的评估中的应用。

具体地，化学修饰为甲基化修饰，例如，在CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。

本发明还提供上述方法在非经典DNA结构的检测中的应用。

具体地，上述非经典DNA结构例如i-motif。

本发明提供了一种对DNA的化学修饰进行检测的方法，其利用合理设计的DNA天平，能够通过toehold置换原理来衡量化学修饰DNA的杂交热力学和链置换动力学。使用DNA天平，发明人成功地测定了环状偶氮苯(cAB)(这是一种对DNA的光开关修饰)的临界热力学和动力学参数。更重要的是，已经定量地描述了杂交和光异构化两者的ΔG°变化，这对于经典方法如ITC、DSC和DNA熔融分析是不可能的。链置换和异构化的临界速率常数也已经通过筛选动力学敏感的DNA砝码并结合数学模型使用DNA平衡成功地确定。该方法无需专门的仪器，可以容易地从cAB扩展到其他化学修饰。

该方法的另一优点是其在目标天然条件下表征化学修饰的DNA。以前的研究中，Zhang及其同事证实了核酸基序热力学的天然表征可以导致测量的ΔG°具有显著更佳的准确性(Wang,C.；Bae,J.H.；Zhang,D.Y.Native Characterization of Nucleic Acid MotifThermodynamics via Non-Covalent Catalysis.Nat.Commun.2016,7,10319.)。类似地，在DNA纳米技术的最具代表性的条件之一(室温，具有12.5mM Mg²⁺的Tris-EDTA缓冲液)中，DNA平衡测量化学修饰的DNA的杂交热力学。因此，本方法中确定的关键热力学参数可以容易地用于指导cAB修饰的DNA序列的设计和使用。值得注意的是，通过将实验测量与发明人的理论模型相结合来估计光异构化的热力学。假设光异构体对反向链置换反应具有最小影响，则可能会给反式至顺式转变的估算的ΔG°值引入误差。然而，发明人相信该误差是最小的，因为异构化的测定ΔG°值合理地反映了在两种异构体存在下DNA平衡的总体性能。实验设置，例如在恒定照射下进行测量以保持反式异构体，可以帮助提高测量的准确度。

除了热力学之外，该方法还提供了测量DNA种类内的瞬态化学变化(例如异构化)的可能性。

经化学修饰的DNA链置换反应速率常数的测定，也可应用于动态DNA纳米技术。对toehold介导的链置换和toehold置换反应的动力学的定量描述在指导不同动态DNA装置和反应网络的设计中发挥了关键作用。尽管对于未修饰的DNA序列已经很好地确定了链置换的动力学，但是很少对化学修饰的DNA进行探索。发明人在设计DNA天平和建立数学模型方面的工作为以定量方式表征化学修饰DNA的动力学行为提供了有力的工具。发明人的工作还表明，在光异构化时DNA双链体稳定性急剧变化的cAB可用作独特的光开关来设计具有高的时间可控性的DNA探针(例如，在光异构化期间的杂交，并在移除光源之后立即去杂交)或设计光调节的耗散反应网络。

因此，本发明提供的方法在生物学、生物医学、材料科学、纳米光子学和纳米电子学等领域具有非常好的潜在应用价值。

附图说明

图1所示为：(a)DNA天平原理示意图；(b)toehold置换是DNA天平的工作原理的说明；(c-d)环状偶氮苯的结构和光异构化；通过390nm光的照射，热稳定的顺式cAB异构化为不稳定的反式cAB，并且在520nm的照射下或在环境条件下加热时，反向过程是自发的；(e)cAB修饰和光异构化对DNA双链体稳定性的影响。

图2所示为：反应产率对反应自由能的图建立实验热力学和理论热力学图。通过绘制由方程S2和S3计算的理论产率相对于使用NUPACK软件计算的值的图(实线)来建立理论关系图。使用理论模型(虚线)拟合使用一组DNA砝码探针(圆点)的实验获得的反应曲线。根据最小二乘误差算法计算sight+0.1kcal·mol^-1校正。

图3所示为：使用DNA天平研究顺式cAB修饰的热力学表征；(a)toehold置换反应和用于测量由顺式cAB修饰诱导的热力学变化的DNA砝码探针组的示意图；(b)然后通过实验绘制每个砝码探针的反应产率相对于其吉布斯自由能的图，建立热力学曲线；与“空”DNA天平的进一步比较允许直接报告ΔG°的变化；(c-f)实验确定在不同位点(c-e)的单个cAB修饰或多个cAB修饰(f，g)的热力学曲线，以及每种修饰的值。

图4所示为：将平衡时的反应产率对一组砝码探针的标准自由能作图，然后使用理论模型进行拟合；本方案适用于顺式cAB(CT_cis)和反式cAB(CT_trans)修饰的DNA，修饰数目从1(a)、2(b)到3(c)不等。对顺式cAB和反式cAB的热力学关系图的观察表明，由于从反式到顺式异构体的自发松弛，不可能直接使用热力学测量来确定热力学参数。

图5所示为：有/无照射的非修饰DNA天平的动力学研究；(a)无DNA修饰的toehold置换反应的示意图作为对照以排除可能的光照射中断；(b-j)具有不同DNA砝码探针的DNA天平的动力学曲线。结果表明，光照射对toehold置换反应没有影响。

图6所示为：顺式cAB修饰的位置对动力学的影响；DNA的动力学曲线平衡CT_cis-1N和CT_cis-1F。两种单一的cAB修饰位置之间的微小差异表明，修饰位点对DNA天平动力学无显著影响。

图7所示为：含有不同数量cAB修饰的DNA双链体的动力学曲线。与未修饰的DNA双链体相比，当使用相同的DNA砝码探针时，顺式cAB修饰的存在加速了toehold置换的动力学。增加修饰量进一步加快了toehold置换的速率。

图8所示为：用DNA天平研究顺反异构修饰的动力学特征；(a)涉及与异构化偶联的顺式cAB或反式cAB的toehold置换反应的反应途径的示意图；(b-j)用不同砝码探针实时监测DNA天平的toehold置换反应。与有或无光照射的比较揭示了对DNA中的异构化反应灵敏的砝码探针。

图9所示为：含有两个cAB-修饰(CT_cis-2)的DNA双链在有或没有光照射下的动力学曲线。

图10所示为：含有三个cAB-修饰(CT_cis-3)的DNA双链体在有或没有光照射下的动力学曲线。

图11所示为：通过实验测量和模拟的组合，使用DNA天平测定每个元素反应的速率常数；(a)与异构化偶合的toehold置换的简化反应途径，表观异构化被认为是零级反应(k₁)；DNA平衡反应简化为表观双分子反应(k_2app，k_3app)；(b)顺序确定k₁、k_3app和k_2app的工作流程；(c-e)使用W(7，7)作为异构化敏感砝码探针的单个cAB修饰对工作流中的每个步骤进行实验验证；(d-f)实验测定带有一个(f)、两个(g)和三个(h)cAB修饰的DNA双链体的速率常数。

图12所示为：模拟结果用于评估DNA天平的潜力，以探测DNA中瞬态反应或事件的动力学；(a)与瞬态化学变化复合的toehold置换反应的模拟动力学曲线，利用本工作的实验数据获得了瞬态反应前后链置换反应的速率常数；(b)在瞬态化学事件前后，将上阈值和下阈值设定为与独立链置换反应偏离5％。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

在本发明中，“偶氮类化合物”是指一类在偶氮基两端连接苯基的化合物。

在本发明中，nt是指核苷酸碱基。

在本发明中，“DNA修饰”是指DNA合成后，通过一系列化学加工使其结构发生某些变化。

本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验方法：

环状偶氮苯(cAB)修饰寡核苷酸的合成：如先前所报道的，通过基于亚磷酰胺化学的固相合成产生cAB修饰的寡核苷酸并通过PAGE纯化。

DNA序列：所有非cAB修饰的DNA寡核苷酸均购自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)，并通过高效液相色谱法纯化。序列和修饰列于下表中。

表1.DNA序列

缓冲条件：将DNA寡核苷酸溶于1×tris-EDTA(TE)缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1M EDTA，作为100×原液，购自Sigma)，然后储存在-20℃。除非另有说明，否则使用含有12.5mM MgCl₂和0.1％(v/v)TWEEN 20的1×TE缓冲液(Sigma)作为反应缓冲液。TWEEN 20用于防止稀释和移液步骤过程中DNA寡核苷酸的潜在损失。

DNA天平制备：首先将链C和T混合，并分别使用反应缓冲液从原液浓度50μM稀释至5μM和7.5μM。然后在BioRad T100热循环仪中对DNA天平溶液进行退火。退火程序设置如下：加热至90℃并保持5分钟，然后每2分钟降温5℃，直到温度达到20℃。制备的DNA天平溶液，特别是携带cAB修饰的DNA天平溶液，用锡箔覆盖，并避光保存。

使用DNA天平测量cAB修饰的方案：在室温下，分别使用反应缓冲液将DNA天平和砝码稀释至200nM和所需浓度。首先将90μL稀释的DNA砝码溶液转移至96孔板。然后将预先避光储存的DNA天平溶液在实验室制造的照射箱中通过395nm LED照射30分钟。一旦照射完成，将10μL未照射和照射的DNA天平(CT_ciscAB和CT_transcAB)溶液同时加入含有相同DNA砝码设计的两个平行孔中。每个DNA天平实验重复两次。然后将孔板在室温下在SpectraMax i3荧光板读取器中读取2小时，激发/发射设置为485/535nm。

数学模型建立：DNA链和复合物的自由能信息用免费软件NUPACK估算。对于NUPACK中的参数设置，温度设置为25℃，Mg²⁺的浓度设置为10mM。其他参数为默认设置。热力学数学模型和标准产率-ΔG°的关系图通过MATLAB(2019a,MathWorks)的数值方法求解并绘制。利用拟合代码，在MATLAB中进行实时动力学分析。

实施例1：设计原则

发明人提出了一种DNA天平，能够精确测量热力学和动力学参数，以在恒定的室温下挑战DNA(如图1所示)。与现实世界的天平相似，该DNA天平通过将其与具有预定热力学和动力学参数的由未修饰DNA制成的一组DNA砝码进行比较来衡量化学修饰DNA的热力学和动力学参数。选择光可切换的改性，环状偶氮苯(cAB)，作为测试平台，以证明发明人的策略的可行性(图1c)。光开关分子如偶氮苯是通过光异构化来构建光响应/可控材料或系统的常用手段。已对偶氮苯和衍生物进行了充分研究并结合到DNA中以构建光响应组成型动态网络、水凝胶、origami纳米结构和药物递送胶囊。由于偶氮苯的反式(E)-到-顺式(Z)转换通常受UV光限制，因此人们努力将光调节到可见光区域并在室温下异构化以用于体内应用。引入环状结构将吸收带拉入可见光区域并产生反常的顺式(Z)-到-反式(E)光异构化。不稳定的反式(E)构型可以通过环境热量和绿光照射(520nm，图1d)转换回顺式(Z)异构体。在本研究中，发明人用DNA天平研究了由DNA中的cAB修饰引起的热力学和动力学变化。用DNA天平的静态平衡状态测定了由稳定的顺式(Z)-cAB修饰引起的杂交自由能位移用实时动力学分析法测定链置换反应的速率常数，并估算由不稳定的反式(E)-cAB引起的

如图1a所示，DNA天平设计为双链体DNA(CT)，其中一条链标记有荧光基团(C)，另一条链标记有猝灭基团(T)。其还包含一个称为DNA toehold的粘性末端，使其可以通过toehold置换的原理与一组单链DNA(ssDNA)砝码(W)快速反应(如图1b所示)。每个探针的“砝码”W(f，r)由正向toehold(f)和反向toehold(r)的长度限定。“较重的”DNA砝码被设计为比“较轻的”DNA砝码含有更长的正向toehold和/或更短的反向toehold，因此当与DNA天平反应时产生更高的反应产率。通过理论模型(如实施例2所示)或通过实时监测荧光信号，可在计算机上定量测定每个DNA砝码的DNA天平时的toehold置换反应的标准自由能、产率和速率常数。为了测量化学修饰，首先进行“去皮(taring)”步骤，其中通过与一组具有不同f和r的DNA砝码反应来建立未修饰的DNA天平(CT_N)的动力学和热力学图谱(方程1)。然后通过将其化学结合到猝灭基团标记的DNA链，将修饰置于DNA天平上。使用相同的DNA砝码组再次询问携带化学修饰(CT_cis)的DNA天平，以获得化学修饰引起的热力学和动力学变化(方程2-4)。

未修饰的DNA天平(eq.1)

化学修饰的DNA天平(eq.2)

本研究采用环状偶氮苯(cAB)(其为一类具有代表性的光开关DNA修饰，其中使用常规技术直接探测热力学和动力学是具有挑战性的)作为实验平台，验证了发明人的DNA天平策略的有效性。为此，通过基于亚磷酰胺化学的固相合成将cAB化学结合到淬灭基团标记的链T的磷酸酯骨架中(如图1c所示)。热稳定的顺式cAB异构体可以在390nm照射时光转换为反式cAB，并且反向异构化在环境温度或520nm照射下自发发生(如图1d所示)。顺式cAB的引入使DNA双链体不稳定，而反式cAB通过更有利的平面构象使双链体稳定(如图1e所示)。

在数学上，顺式cAB修饰的双链体CT_cis 可以推导为(方程4)，并可以使用例如NUPACK的软件工具容易地计算。因此，要确定所有需要测量的是(方程3)。原则上，可以使用单个DNA砝码来测量，这对于具有未知热力学的化学修饰几乎是不可能且不可靠的。相比之下，设计DNA砝码组以覆盖更宽范围的反应自由能。因此，发明人能够在将化学修饰置于DNA天平上之前和之后容易地建立标准热力学曲线(作为的函数)。然后可以使用MATLAB代码准确地确定作为标准曲线的位移。

对于动力学分析，通过实时监测荧光信号，可以直接测量顺式cAB修饰的DNA链置换反应的速率常数。然而，对于涉及反式cAB的链置换反应，直接实验测量是不可能的。这是因为反式cAB自发地松弛为顺式cAB，并且因此导致更加复杂的动力学行为。使用DNA天平，发明人证实通过结合实验测量和数学模型，有可能解决这种挑战并准确地测定链置换和从反式异构体向顺式异构体的转变的速率常数。一旦获得临界动力学参数，发明人能够进一步导出反式cAB和顺式cAB之间的转变的标准吉布斯自由能。

实施例2：理论框架

1.1热力学模拟的基础

DNA天平的原理是一系列的toehold置换反应，通过它可以建立化学修饰的热力学关系图。理论上，反应产率(η)可以使用双分子反应模型：

其中K_eq≠1； (eq.S2)

或其中K_eq＝1；(eq.S3)

其中W为DNA砝码，C是目标T的部分互补链；平衡常数反应产率η＝[W_(f，r)C]/[CT_cAB]₀；实验参数γ：＝[T_cAB]/[CT_cAB]₀和τ：＝[W_(f，r)]/[CT_cAB]₀(下标0表示初始状态)。每种DNA物质的自由能可以使用NUPACK软件计算。当τ和γ的实验条件恒定时，DNA天平唯一变化的变量是对应于DNA砝码的反应自由能该与产率的关系图反映为一条S形标准曲线。

为了从荧光数据获得无量纲反应产率值，发明人通过下式对荧光值进行归一化：

其中F_CT、F_P.C.和F_BG分别表示从DNA天平产生的平衡荧光信号、CT双链体的背景水平和仅由C产生的最大信号水平。

1.2动力学数学模型

对于含有热不稳定的反式cAB修饰(CT_trans)的DNA天平，其参与两个平行反应：直接与DNA砝码和异构化成热稳定的CT_cis。反应过程的精确动力学数学模型如方程S5至S7所示。

正/反速率常数k_E-f/k_E-r

正/反速率常数k_Z-f/k_Z-r

CT_trans→CT_cis；异构化速率常数k_iso

T_trans→T_cis；异构化速率常数k_iso

同样地，

边界条件为：[CT]_total＝[CT_trans]+[CT_trans]+[CW] (eq.S7)

CW产生的集体荧光信号为：

显然，仅从荧光数据拟合动力学速率常数是具有挑战性的，因为所有反应是高度耦合的。因此，发明人将精确模型简化为数学上可解的模型(方程S9-S11)：

CT_trans+W→CW+T_trans；表观双分子速率常数k_E-app

CT_cis+W→CW+T_cis；表观双分子速率常数k_Z-app

CT_trans→CT_cis；恒定的分子内异构化速率k_iso-app

因此，简化的数学模型为：

特别是，发明人将普遍接受的一级异构化反应视为零级，原因有二：首先，环偶氮苯结合入DNA链中，从而异构化是分子内的；其次，在荧光曲线中所观察到的动力学敏感线性区表明该反应过程中存在零级限速步骤。

首先将实时荧光数据归一化为无量纲产率。为了减少批次间实验差异，发明人应用了如下所示的归一化方法：

其中F_e.q.和K_e.q.分别代表平衡态下的荧光水平和相应DNA砝码的平衡常数。由于反式cAB修饰的DNA双链体CT_trans将在称重过程中松弛成CT_cis，所以CT_trans和CT_cis两者将达到相同的反应产率。因此，在给定DNA砝码探针的存在下，对两者应用相同的K_e.q.值。

实施例3：DNA砝码文库的设计及相应的反应自由能

总共为DNA天平设计了16个DNA砝码，其中正向toehold的长度从f＝4nt到f＝9nt，反向toehold的长度从r＝5nt到r＝10nt。用f和r的数值表示每个DNA砝码，例如，将f＝9nt和r＝4nt的DNA砝码表示为W(9，4)。使用NUPACK预测每个重量探针的反应自由能。f和r的组合，以及每个W的预测的列于下表中。

表2. 16个DNA砝码探针和预测的反应自由能的总结

实施例4：衡量顺式(Z)cAB修饰DNA的热力学特性

通过将实验测定的产率对每个DNA砝码的预测的作图，建立未修饰DNA天平的标准热力学曲线(如图2所示)。发现实验测定的校准曲线与计算机预测高度一致，仅有-0.1kcal·mol^-1的微小偏移，表明使用发明人的DNA天平可以通过实验准确地建立热力学曲线。

然后将顺式cAB修饰置于DNA天平上用于热力学测量。将三个单cAB修饰以化学方式结合入DNA天平中，但在不同位置处：靠近正向toehold(TC_cis-1N，图3c)、中间(TC_cis-1M，图3d)或在反向toehold(TC_cis-1F，图3e)。发明人还将修饰数目从1变为2(图3f)和3(图3g)。图3c-3g中的每个圆点表示特定DNA砝码的实验测量值。通过使用最小二乘法将一组DNA砝码的实验结果与理论模型进行拟合，发明人能够为顺式cAB修饰的DNA建立热力学校准曲线(图3c-3g中的虚线)。

对于所有顺式cAB修饰，观察到的阳性位移，这与先前关于顺式cAB使DNA双链体去稳定的报道一致。定量地，单个顺式cAB修饰导致+1.6kcal·mol^-1的平均位移，并且修饰的位置对能量位移的数值几乎没有影响。类似地，相邻核苷酸的差异对由单个顺式cAB引起的热力学位移也几乎没有影响(图3c-3e)。正如所预期的，迅速增加顺式cAB修饰的数目扩大了(图3f-3g)。观察发现，用两个顺式cAB进行的修饰比用两个单修饰(～+3.2kcal·mol^-1)进行的大得多(+6.3kcal·mol^-1)，表明多重修饰可能协同作用，使DNA双链体不稳定。

在实现顺式cAB的热力学表征后，发明人的下一个目标是测量反式cAB的热力学和两种异构体之间的转变。然而，发明人发现，由于从反式异构体自发转变为顺式异构体，无法直接测量反式cAB的热力学参数(如图4所示)。由于在这种情况下DNA天平由动力学支配，发明人接下来测量了cAB修饰的DNA的临界动力学参数。然后，一旦完全表征了cAB的动力学行为，就可以导出热力学参数。

实施例5：衡量cAB修饰DNA的动力学

在toehold介导的链置换反应中，顺式cAB修饰的DNA的动力学表征是简单的(图5-7)。图7中的动力学图证明，单个顺式cAB修饰的结合加速了具有若干DNA砝码的链置换的动力学，该DNA砝码包括W(7，8)、W(7，7)、W(9，8)和W(8，7)。这是可以预期的，因为顺式cAB使CT双链体不稳定。对于其它'较重'和'较轻'的砝码，没有发现可观察到的动力学差异(图8b-8f、8i-8j)，因为整体反应变得快得多或慢得多。总之，这些观察结果表明，在化学修饰中，一些DNA砝码在动力学上比其它DNA砝码更灵敏，这些化学修饰更适合于探测化学修饰DNA的动力学。

发明人的下一个目标是筛选动力学上对携带反式cAB修饰的DNA平衡更敏感的DNA砝码。为此，将顺式cAB修饰的DNA双链体CT_cis在390nm下照射30分钟，以确保完全转变，从而获得反式cAB修饰(CT_trans)。照射后立即用一组DNA砝码询问携带反式cAB的DNA天平，以启动toehold置换反应(图8a)。同时，从反式异构体到顺式异构体的自发松弛并行发生，其将CT_trans转换回CT_cis(图8a)。通过比较有或无光照射的动力学曲线(图8b-8j)，发明人发现大多数DNA砝码要么太“轻”(图8b-8f)，要么太“重”(图8i-8j)，以反映异构化诱导的动力学差异。相比之下，W(7，7)和W(9，8)在反式cAB存在下显示出可观察到的动力学变化(图8g和8h)。正如所预期的，反式cAB稳定CT双链体，并因此显著减慢链置换的速率。然而，由于自发松弛，在达到平衡之前观察到线性动力学域。令人感兴趣的是，发明人还发现动力学上最敏感的DNA砝码W(7，7)导致最终反应产率接近50％(图8g)。对于具有两个和三个cAB修饰的CT_trans也进行了类似的观察(图9、10)。

由于反应网络的复杂性(图11a)，无法直接测量反式cAB修饰的DNA的动力学参数。因此，发明人提出通过将计算机模拟与实验验证相结合来应对这一挑战(图11b)。具体而言，发明人首先建立了一个能够定量描述动态敏感砝码的动力学行为的数学模型(实施例2中1.2中的细节)。发明人的模型表明，图8g中观察到的线性区域是从CT_trans到CT_cis的自发异构化的结果，并且异构化速率常数(k₁)的值可以通过该线性区域的斜率(图11c)得到。顺式cAB修饰的DNA天平的观察速率常数(k₃)可以在没有光照射的情况下使用DNA天平通过实验确定(图11d)。一旦测量了k₁和k₃的数值，则可以使用图11b中概述的工作流程来确定k₂。尽管使用发明人的数学模型可以在计算机上建立不同的动力学曲线，但是只有当达到正确的k₂值时，预测的动力学曲线才可以与实验测量叠加(图11e)。

对于具有单个cAB修饰的DNA天平(CT_CAB-1，图11f)，DNA砝码W(7，7)在动力学上对反式cAB最敏感。通过使用图11b中概述的工作流程，将数学模型拟合实验数据，发明人确定表观速率常数k₁、k₂和k₃分别为2.17×10^-12M·s^-1、3.73×10²M·s^-1和1.25×10⁵M·s^-1。观察到反式异构体将链置换减慢300倍以上，表明反式cAB可以有效地增强相邻碱基对并抑制分支迁移过程。

当增加cAB修饰的数目时，较轻的砝码(其中W(4，9)用于2个修饰，W(5，10)用于3个修饰)被确定为对光异构化动力学敏感。当增加cAB修饰的数目时，观察到异构化率略有提高，其中对于两个修饰，k₁值为6.40×10^-12M·s^-1，三个修饰，k₁值为1.03×10^-11M·s^-1。与单个修饰的速率常数相比，速率常数k₂和k₃保持相同的量级。总之，动力学分析定量地揭示了反式和顺式cAB在稳定/不稳定DNA杂交的能力方面的约300倍的差异，并且当用于链置换时，单个修饰最适于产生显著的动力学差异。

在确定了动力学参数后，最终目标是估计热不稳定反式cAB修饰相对于未修饰的热力学位移由于反式和顺式异构体之间的主要区别在于DNA双链体而非单链DNA，发明人推断T和CW之间的反向链置换速率在DNA天平中对于T_trans和T_cis是接近的。因此，平衡常数比K₂/K₃等于k₂/k₃，并可以使用方程5来计算反式-顺式异构化的自由能变化

使用图11f-11h中测定的动力学参数，发明人估计对于一个、两个和三个cAB修饰，反式到顺式异构化导致自由能变化分别为-5.04、-4.55和-4.06kcal·mol^-1。反式cAB修饰的DNA平衡的反应自由能然后可以从方程6和7导出：

表3总结了本研究中研究的具有不同数量的顺式异构体或反式异构体的未修饰的DNA双链体和cAB修饰双链体的ΔG°。对于其它cAB修饰的双链体，ΔG°可通过首先使用DNA分析软件诸如NUPACK确定未修饰的双链体的ΔG°，然后使用方程4(顺式)或7(反式)计算cAB修饰的双链体的ΔG°来估计，数值列于表3。

表3.带有不同数量的顺式/反式cAB修饰的DNA双链体(CT)的标准自由吉布斯能量值的总结

在本研究中获得的动力学参数为发明人提供了粗略评估DNA天平的上边界和下边界以测量DNA中的瞬态动力学事件的方法。图12中的模拟结果表明，发明人的方法可以精确测量(实验误差小于5％)速率常数为1.08×10^-11M·s^-1和7.50×10^-14M·s^-1的异构化反应。宽的(超过2个数量级)动力学窗口将允许确定DNA中多种类型的瞬态反应和/或事件。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种对化学修饰的DNA进行原位表征的方法

<130> 1

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> DNA