阅读说明：本技术 具有光致发光的非常规和/或反向变化的数字扩增试验 (Digital amplification assay with unconventional and/or inverse variation of photoluminescence ) 是由 E·A·赫夫纳 D·玛尔 于 2018-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供了使用数字扩增试验进行分析的方法和组合物,具有在光致发光中的非常规/反向变化以指示一种或多种靶标的存在。在示例性方法中,可以形成独立样份,其仅一个子集包含靶标。每个样份可包括具有标记物的探针,具有猝灭剂并被配置为与探针杂交以猝灭标记物的接收物,以及被配置为与探针和/或接收物杂交以阻断接收物与探针杂交的分隔物。可以在样份中进行扩增反应以产生对应于靶标的扩增子。分隔物可以与扩增子杂交,并且可以通过扩增反应而延伸或降解。可以检测来自样份的标记物的光致发光,并且靶标阳性样份的光致发光可以小于靶标阴性样份的光致发光。(The present invention provides methods and compositions for analysis using digital amplification assays with non-regular/reverse variations in photoluminescence to indicate the presence of one or more targets. In an exemplary method, independent aliquots can be formed, only a subset of which contain the target. Each sample can include a probe having a label, a receptacle having a quencher and configured to hybridize to the probe to quench the label, and a separator configured to hybridize to the probe and/or the receptacle to block hybridization of the receptacle to the probe. An amplification reaction may be performed in the aliquot to produce amplicons corresponding to the target. The spacer may hybridize to the amplicon and may be extended or degraded by the amplification reaction. Photoluminescence from the label from the sample can be detected, and the target positive sample can have less photoluminescence than the target negative sample.)

具有光致发光的非常规和/或反向变化的数字扩增试验

在先申请的交叉引用

本申请基于2017年10月19日提交的美国临时专利申请序列号62/574,694并根据35U.S.C.§119(e)要求其权益，该申请通过引用全部纳入本文用于所有目的。

对其他材料的交叉引用

本申请通过引用整体方式并入以下材料用于所有目的：2006年5月9日授权的美国专利号7,041,481；2010年7月8日公开的美国专利申请公开号2010/0173394A1；2012年12月20日公开的美国专利申请公开号2012/0322058A1；2013年2月14日公开的美国专利申请公开号2013/0040841A1；2015年5月28日公开的美国专利申请公开号2015/0148250A1；以及Joseph R.Lakowicz，《荧光光谱原理》(Principles of Fluorescence Spectroscopy)(第2版，1999年)。

导言

数字扩增试验可以定量样品中的核酸靶标(靶序列)。在典型的数字试验中，在靶标被部分占据时，样品被分成一个集合的独立样份，例如液滴。靶标的拷贝随机存在于样份中，只有一个子集的样份包含至少一个拷贝的靶标。每个样份都配制为包含相同集合的扩增试剂，用于通过扩增反应(例如PCR)进行靶标依赖性生成产物。每个个体样份中还包括具有荧光标记的探针，以指示在每个单独样份中是否已经发生了靶标依赖性扩增反应。在进行反应之后，例如通过使样份热循环，可以检测每个样份中标记物的荧光。然后根据荧光强度将个体样份分类为靶标阳性或阴性。然后可以基于靶标阳性(或阴性)的样份数和总样份数(靶标阳性和阴性)通过泊松统计来计算样品中靶标的浓度。

多重数字试验可以用相同集合的样份定量两种或更多种不同的靶标。每个样份可包含靶标特异性探针，每个探针对应于不同的靶标并具有光谱上可区分的标记物。通过使用相同的荧光标记物在可区分的荧光特征强度下来报告两种或更多种不同靶标的扩增，可以进一步提高靶标多路复用(multiplexing)的水平。例如，对于第一靶标呈阳性的样份可以显示出与靶标阴性样份相比标记物的荧光强度较小的增加，而对于第二靶标呈阳性的样份可以显示出较大的荧光强度增加。但是，这种基于强度的多路复用的缺点是，不同靶标的特征强度可能取决于试验条件，因此每次进行试验时都可能相对于彼此有些偏移。这些变化会使分析的稳健性和准确性降低。

需要一种用于进行多重数字试验的新方法，该方法具有更多用于调节荧光强度的选项。

发明内容

本公开提供了使用数字扩增试验进行分析的方法和组合物，具有光致发光的非常规/反向变化以指示一种或多种靶标的存在。在示例性方法中，可以形成独立样份，其仅一个子集包含靶标。每个样份可包括具有标记物的探针，具有猝灭剂并被配置为与探针杂交以猝灭标记物的接收物(sink)，以及被配置为与探针和/或接收物杂交以阻断接收物与探针杂交的分隔物(separator)。可以在样份中进行扩增反应以产生对应于靶标的扩增子。分隔物可以与扩增子杂交，并且可以通过扩增反应而延伸或降解。可以检测来自样份的标记物的光致发光，并且靶标阳性样份的光致发光可以小于靶标阴性样份的光致发光。

附图说明

图1是根据本发明的多个方面，各自的光致发光标记物在两个不同的波长(λ₁和λ₂)由独立样份的多重数字试验检测得到的光致发光的示意图，其中每种标记物报告两种不同靶标(A和B，或C和D)的扩增，相对于靶标阴性样份，分别表现为不同的光致发光强度的增加。

图2是根据本发明的多个方面，如在图1中检测到的光致发光的示意图，不同的是在各个波长处两种靶标的光致发光强度的增加彼此重叠，导致试验不可操作。

图3是根据本发明的多个方面，如在图1中检测到的各自的光致发光标记物在两个不同的波长(λ₁和λ₂)由独立样份的多重数字试验检测到的光致发光的示意图，不同的是每种标记物报告对光致发光强度(相对于靶标负样份)具有反向作用的两种不同的靶标(A和B，或C和D)的扩增。

图4是根据本发明的多个方面，如在图3中检测到的光致发光的示意图，并且示出了如何在不使试验不可操作的情况下容许靶标A-阳性样份的净降低的光致发光的变化。

图5是根据本发明的多个方面，用于靶标的示例性样品分析方法的流程图，该方法采用独立样份和光致发光的非常规变化来区分靶标阳性样份与靶标阴性样份。

图6是根据本发明的多个方面，用于第一靶标和第二靶标的示例性样品分析方法的流程图，该方法采用独立样份和光致发光的反向变化来区分各个样份中第一靶标的存在与第二靶标的存在。

图7是根据本发明的多个方面，示例性数字扩增试验的示意图，该试验采用光致发光的净降低来指示靶标的存在，并且用独立样份进行，所述独立样份各自含有分隔物，所述分隔物能够至少降低或基本上消除接收物猝灭探针标记物的可检测的光致发光的能力，但优先在缺乏标靶的靶标阴性样份中，因为分隔物能够在标靶阳性样份中用作靶标扩增的引物，因此相对于靶标阳性样份，在靶标阴性样份中标记物产生更强的光致发光。

图8是根据本发明的多个方面，示例性数字扩增试验的另一示意图，其采用光致发光的净降低来指示靶标的存在，如图7所示，不同之处在于，分隔物具有封闭的3'端并且在靶标阳性样份中选择性降解。

图9是根据本发明的多个方面，示例性数字扩增试验的另一示意图，其采用光致发光的净降低来指示靶标的存在，如图7中所示，不同之处在于，探针和接收物彼此共价连接。

图10是根据本发明的多个方面，示例性数字扩增试验的又一示意图，其采用光致发光的净降低来指示靶标的存在，如图7所示，不同的是，分隔物具有5'尾以与接收物(或探针)杂交，任选地允许相同的“通用”接收物和“通用”探针与不同的靶标特异性分隔物(例如，具有相同的5'尾)一起使用。

图11是根据本发明的多个方面，示例性数字扩增试验的另一示意图，其采用光致发光的净减少来指示靶标的存在，如图7中所示，不同之处在于，分隔物与探针而不是接收物杂交。

图12是根据本发明的多个方面，用于第一靶标和第二靶标的示例性数字扩增试验的示意图，其利用从相同标记物检测到的光致发光的反向变化来指示靶标的存在，其中第一靶标的存在导致光致发光的净减少，如图7中所示，第二靶标的存在产生光致发光的净增加。

图13是大致按照图7进行的单重数字试验中收集的扩增数据的散点图，其中独立样份是被不混溶的载液包裹的液滴，并且相对于靶标阴性液滴，含有AP3B1靶标的液滴的FAM荧光强度降低。

图14是大致根据图13进行的在多重数字试验中收集的扩增数据的散点图，不同之处在于添加了针对TERT和RPP30靶标的引物和探针，显示相对于靶标阴性液滴，含有TERT和RPP30靶标的液滴各自具有增加的荧光强度。

具体实施方式

本公开提供了使用数字扩增试验进行分析的方法和组合物，具有光致发光的非常规/反向变化以指示一种或多种靶标的存在。在示例性方法中，可以形成独立样份，其仅一个子集包含靶标。每个样份可包括具有标记物的探针，具有猝灭剂并被配置为与探针杂交以猝灭标记物的接收物，以及被配置为与探针和/或接收物杂交以阻断接收物与探针杂交的分隔物。可以在样份中进行扩增反应以产生对应于靶标的扩增子。分隔物可以与扩增子杂交，并且可以通过扩增反应而延伸或降解。可以检测来自样份的标记物的光致发光，并且靶标阳性样份的光致发光可以小于靶标阴性样份的光致发光。

提供了用于分析的示例性组合物。该组合物可包含多个独立样份。每个样份可包括相同样品的一部分，具有光致发光标记物的探针，被配置为与探针杂交并具有针对标记物的猝灭剂的接收物，以及分隔物。仅一个子集的样份可包含来自样品的至少一个拷贝的靶标。每个样份可包含扩增试剂以产生对应于靶标的扩增子。分隔物可被配置为阻断靶标阴性样份中接收物与探针的杂交，并且也可以被配置为通过产生扩增子实现优先在靶标阳性样份中延伸或降解。在一些实施方式中，组合物是乳液，样份是水性液滴，各自被不混溶的载液(连续相)例如油包围。

本公开的方法和组合物可以提供各种优点。一个集合的样份中不同靶标的存在可以基于光致发光强度的差异，在多重数字试验中更加可靠地加以区分。而且，可以提高多路复用的程度(不同靶标数量)，而无需使用不同的检测器。此外，在相同波长下检测存在两种不同靶标的试验可能更稳健，因为包含每种靶标的样份的特征性光致发光强度可以彼此分开，和/或与靶标阴性样品的特征性光致发光强度反向极端偏移(offset)。

本公开的其他方面存在于下述部分：(I)定义，(II)数字试验中光致发光变化的概述，(III)用于一种或多种靶标的样品分析方法，(IV)示例性方法和试剂配置，(V)分析方法的其他方面，(VI)组合物，以及(VII)实施例。

I.定义

在本公开中使用的技术术语具有本领域技术人员通常认可的含义。但是，可以如下所述进一步定义以下术语。

核酸低聚物–相对较短的多核苷酸(即寡核苷酸)或相对较短的多核苷酸类似物(即寡核苷酸类似物)。示例性的类似物包括：肽核酸，锁核酸，硫代磷酸酯等。低聚物可具有共轭单元的非支链(或支链)，即核苷酸或核苷酸类似物，各自包含碱基(例如，核碱基)。低聚物可以例如包含少于约200、100、75或50个单元，其中每个单元是核苷酸或核苷酸类似物。低聚物可以是化学合成的或生物合成的，等等。低聚物可以用至少一种标记物标记，该标记物可以与链偶合并且被视作低聚物的一部分。至少一种标记物可以包括至少一种光致发光体，因此可以是光致发光标记物。每个标记物可以在任何合适的位置(包括其5'端，3'端，或5'端和3'端的中间位置)连接到低聚物的链上。低聚物(例如，作为分隔物，接收物，探针，或整合的接收物-探针(例如，参见图9))可以具有3'端，其被构造为防止被聚合酶延伸(也称为封闭的3'-端)。例如，低聚物可在其3'端具有磷酸基团，ddC，反向dT，C3间隔子或氨基等。

探针–标记的核酸低聚物(寡核苷酸或其类似物)或其寡聚部分，包括光致发光标记物(例如，在试验中可检测到光致发光)。探针，可互换地称为报告子，其可以被配置为在试验中与接收物，以及任选地与分隔物杂交，和/或可以被配置为与在试验中产生的只是一部分的扩增子杂交。在一些实施方式中，与接收物相比，探针可以更稳定地与分隔物杂交(例如，与接收物相比，其与分隔物形成更多数量的碱基对)。探针能够与在试验中产生的扩增子的链退火。但是，如果探针具有相应的接收物和分隔物，则探针与扩增子退火的温度(即探针-扩增子退火温度)可能小于进行扩增的最低温度，例如聚合酶链式反应的退火温度或延伸温度。探针-扩增子的解链温度可以比扩增反应的最低温度低至少约2、4、6、8或10摄氏度。探针-扩增子的解链温度可以最大程度地减少探针对扩增反应的干扰，并且如果探针的3'端未被封闭，则可以阻断探针的延伸。或者，如果探针不具有相应的接收物和分隔物(例如，图12中的第二探针)，则可以将探针(例如，水解探针)配置为在扩增反应期间与至少一部分扩增子退火，或将探针(例如，分子信标探针)配置为仅在扩增反应完成后与扩增子退火。

接收物–标记的核酸低聚物(寡核苷酸或其类似物)或其寡聚部分，其被配置为在试验中与探针，以及任选地与分隔物杂交，并且包括用于探针光致发光标记物的猝灭剂。与探针杂交的接收物可以将接收物的猝灭剂置于探针的标记物附近，从而使猝灭剂显著猝灭来自光致发光体的光致发光。在一些实施方式中，与探针相比，接收物可以更稳定地与分隔物杂交(例如，与探针相比，其与分隔物形成更多数量的碱基对)。在一些实施方式中，探针和接收物可以是相同分子的一部分，并且可以被配置为分子内杂交。

探针-接收物的解链温度可以高于在试验中检测光致发光时的温度，例如比检测温度高至少约2、4、6、8或10摄氏度。该解链温度允许在检测过程中存在探针-接收物杂交体。接收物能够与在试验中产生的扩增子链退火。但是，与扩增子杂交的接收物的解链温度(即接收物-扩增子的解链温度)可以低于进行扩增的最低温度，例如聚合酶链式反应的退火温度或延伸温度。接收物-扩增子的退火温度可以比扩增反应的最低温度低至少约2、4、6、8或10摄氏度。接收物-扩增子的退火温度可以最大程度地减少接收物对扩增反应的干扰，并且如果接收物的3'端未被封闭，则可以阻断接收物的延伸。

分隔物–核酸低聚物(寡核苷酸或其类似物)，其被配置为在试验中进行扩增反应期间与靶标和/或至少一部分扩增子(例如，与其链的区域)杂交。分隔物可以通过扩增反应延伸(例如通过聚合酶或连接酶)或降解(例如通过聚合酶水解)，优先在靶标阳性样份中。因此，分隔物可以用作扩增引物，或者用作未标记的水解探针。分隔物可以被配置为与至少一部分扩增子以及与探针和/或接收物杂交，与所述扩增子的杂交比与所述探针和/或接收物的杂交更稳定(例如，与探针和/或接收物相比，其与扩增子形成更多数量的碱基对)。分隔物可以比探针和接收物更长(即，包含更多数量的核苷酸或其类似物)。

分隔物杂交体(即探针-分隔物杂交体，接收物-分隔物杂交体，或整合的探针/接收物-分隔物杂交体)的解链温度可高于在试验中检测光致发光时的温度，例如比检测温度高至少2、4、6、8或10摄氏度。该解链温度允许在检测过程中存在分隔物杂交体。分隔物杂交体可以比探针-接收物杂交体更稳定，并且其解链温度可以比探针-接收物杂交体的解链温度高至少约1、2、4、6、8或10摄氏度，使得优先形成分隔物杂交体。

分隔物可被配置为在扩增反应期间与扩增子的链退火。因此，分隔物-扩增子杂交体的解链温度(即分隔物-扩增子解链温度)可以大于进行扩增的最低温度，例如聚合酶链式反应的退火温度或延伸温度。分隔物-扩增子的解链温度可以比扩增反应的最低温度高至少约2、4、6、8或10摄氏度。分隔物-扩增子的解链温度可以确保分隔物有效地与扩增子退火，以用作扩增引物或被聚合酶水解。

在扩增反应开始时，分隔物、探针和接收物可以以任何合适的比例存在于独立样份中。分隔物可以例如与其杂交的探针和/或接收物大约等摩尔，或者可以相对于探针和/或接收物以摩尔过量存在。

光致发光体–能够响应激发光照射而发射光(光致发光)的标记物。光可以是紫外线、可见光和红外光。光致发光的示例性形式包括荧光和磷光等。因此，光致发光体可以例如是荧光团或磷光团。合适的光致发光体可包括染料，例如FAM，VIC，HEX，ROX，TAMRA，JOE，Cyanine-3或Cyanine-5染料等。

猝灭－导致光致发光体的光致发光强度降低的任何邻近依赖性过程。猝灭可以通过任何合适的机制或机制的组合进行，包括动态猝灭(例如，福斯特共振能量转移(FRET)，德克斯特电子转移(Dexter electron transfer)，激基复合体)或静态/接触猝灭等。猝灭的效率可能对光致发光体与其猝灭剂之间的距离非常敏感。例如，在FRET中，猝灭的效率与上升到六次方的距离成反比。因此，光致发光体与猝灭剂之间的分隔距离的小幅变化可导致猝灭效率的较大变化。猝灭效率下降到50％的距离可以小于10纳米。

猝灭剂－能够通常以高度邻近依赖性方式猝灭光致发光体的光致发光的标记物。猝灭剂可以是另一种光致发光体，或者可以是基本上不发光的暗猝灭剂。示例性的暗猝灭剂可包括黑洞猝灭剂(例如BHQ0，BHQ1，BHQ2，BHQ3)，ATTO猝灭剂，爱荷华黑(Iowa Black)，QSY 7/9/21/35等。

靶标–样品中感兴趣的分析物。靶标可以是核酸靶标，并且可以被描述为靶序列。

扩增–任何产生多个核酸序列拷贝的过程。扩增源可以描述为扩增模板，扩增产物可以描述为扩增子。靶标可以是至少在扩增反应开始时的扩增模板，或者可以用于产生扩增模板，例如通过充当用于连接反应的连接模板。样份中扩增子的产生对应于样份中靶标的存在，尽管扩增子的序列可以与靶标的序列不同。随着扩增的进行，扩增子可以用作产生扩增子的其他拷贝的模板。示例性的扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)等。

独立样份–彼此分开的样份。样份(可以是流体样份)可互换地称为隔区(partition)或隔室(compartment)。基本形成样份的流体可以是液体，例如水性液体。可以通过气体(例如，空气)，液体(例如，互不相容载液或连续相)，固体(例如，样品架(如多孔样品架)的壁)或其组合等将样份彼此分离。样份之间可以是基本上相同的大小。示例性的样份是被连续载液包围的液滴，如被连续油相包封的水性液滴，其可以形成乳液。这些样份可以具有基本相同的组成，不同之处是有限组分(例如一种或多种靶标)的副本数量随机变化。例如，样份可以是相同混合物的等分试样。

II.数字试验中的光致发光变化的概述

本节提供了可在具有(a)光致发光常规变化(见图1和2)和(b)光致发光非常规/反向变化(见图3和4)的多重数字试验中收集的光致发光强度数据的示意图比较。

图1显示了常规扩增数据的示意图，该数据可以在多重数字试验中来自独立样份的两个不同的光致发光检测波长(λ₁和λ₂)处收集。图中的每个圆圈代表绘制为点的样份的群集。每个圆圈中的样份具有相同的靶标内容物(即包含靶标A，B，C或D，或不包含靶标(NEG))，并且在每个波长处的光致发光强度彼此相似。

该试验可以如下进行。可以将包含四种不同靶标(A-D)的样品分成独立样份(例如液滴)，以使靶标以“部分占据”的形式存在于样份中。换句话说，仅一个子集的样份包含任何给定的靶标，而一个子集的样份不包含任何靶标(“NEG”表示阴性)。(为简化讨论，图1中没有任何样份包含两种或更多种不同的靶标。)在每种靶标的标记探针的存在下，在样份中扩增靶标。在图1中，针对靶标A和B的各自的探针各自具有在λ₁处发荧光的标记物(例如，相同的标记物)，并且针对靶标C和D的各自的探针各自具有在λ₂处发荧光的标记物(例如，相同的标记物)。当以给定样份中扩增靶标时，来自每个靶标对应的探针的标记物检测到的荧光会增加。例如，包含靶标A或靶标B的样份在λ₁处显示的光致发光强度比靶标阴性样份更强，并且在λ₁处的发光强度互不相同。同样，包含靶C或靶D的样份在λ₂处显示出比靶标阴性样份更强的光致发光，并且在λ₂处显示的光致发光水平互不相同。

图2显示了常规扩增数据的另一示意图，该数据可以在多重数字试验中来自独立样份的两个不同的光致发光检测波长(λ₁和λ₂)处收集。图2的数据是在如图1所示的多重数字试验中收集的。但是，由于相对于图1而言，包含每种靶标的样份群集的特征光致发光强度发生了小幅偏移，因此靶标A和B的群集彼此重叠，靶标C和D的群集也是如此。由于重叠，无法再精确地确定包含每种靶标的样份数量，从而无法进行试验。需要进行试验配置以在数据中不同样份的群集的强度之间产生更大和/或更稳健的分隔。

图3显示了在图1中进行的多重数字试验中收集的扩增数据的示意图，不同之处在于使用靶标A和C的试剂配置会产生光致发光的非常规变化，即相对于靶标阴性样份，包含靶标A或C的样份的光致发光的净降低(在λ₁或λ₂处)。因此，相对于靶标阴性样份，包含靶标A的样份和包含靶标B的样份表现出光致发光的反向变化，包含靶标C的样份和包含靶标D的样份也是如此。

图4显示了在图3中进行的多重数字试验中收集的扩增数据的示意图。虚线轮廓示出了由于试验条件的变化而导致的包含靶标A的样份的特征性光致发光中可能发生的示例性变化。这些偏移不会与图中的其他样份群集产生明显的重叠，因此不会导致试验无法操作。可以使用本公开的光致发光的非常规和/或反向变化来增加试验容许群集位置偏移而没有明显的群集重叠的能力。

III.对于一种或多种靶标的样品分析方法

本节介绍了使用光致发光的非常规/反向变化来检测至少一种靶标的存在的示例性方法；参见图5和图6。可以使用本公开的其他地方，例如第IV节中描述的任何试剂配置，以任何合适的顺序和组合来执行本节中描述的方法步骤。

图5示出了针对靶标进行样品分析的示例性方法50的流程图。方法50利用相对于缺少靶标的样份，使得包含靶标的样份的光致发光净降低的试剂。

可以形成独立样份，如52所示。这些样份可以包含部分占据的核酸靶标(也称为靶序列)，使得仅一个子集的样份包含靶标的至少一个拷贝。每个样份可以包含具有标记物(光致发光体)的相同探针，具有标记物猝灭剂的相同接收物，相同的分隔物，以及相同样品的一部分。可以至少部分地通过将样品分成独立样份和/或通过将混合物分成独立样份来形成这些样份，其中混合物包含样品、探针、接收物和分隔物。混合物还可以包含扩增试剂，例如聚合酶，用于产生对应于靶标的扩增子的引物，以及三磷酸核苷等。示例性的样份包括液滴，其尺寸可以是均一的。在试验中可以形成和/或处理任何合适数量的样份，例如至少约100、1,000或10,000。在一些实施方式中，可以用单个样份(例如，本体相)执行该方法，而不产生多个独立样份。

可以在样份中扩增靶标，如54所示。更一般地，可以在包含靶标的至少一个拷贝的一个子集的样份中产生对应于靶标的扩增子。可以通过加热样份来促进扩增，例如通过热循环(以促进聚合酶或连接酶链式反应)。

可以检测来自样份的标记物的光致发光，如56所示。可以用激发光照射每个样份以激发标记物，并且可以检测发射的光。可以串行或并行地检测来自样份的光致发光。可以检测来自每个样份的光致发光强度，并且可以例如是最大强度，积分强度，平均强度等。在试验中检测任何合适数量的样份的光致发光，例如至少约100、1,000或10,000。

可以将各个样份分类为包含靶标(靶标阳性)或缺少靶标(靶标阴性)，如58所示。分类步骤可以基于从每个样份中检测到的光致发光进行。由于探针、接收物和分隔物的配置，靶标阳性样份可能比靶标阴性样份发出更少的光。可以将从每个样份检测到的光致发光值与阈值进行比较，以确定该样份是靶标阳性或阴性。如果该值低于阈值，则样份可以分类为阳性，如果高于阈值，则可以分类为阴性。

可以枚举靶标阳性的样份或靶标阴性的样份，如60所示，以获得靶标阳性样份的数量的值或靶标阴性样份的数量的值。也可以枚举样份总数的值(包括靶标阳性样份和靶标阴性样份)。

可以确定靶标的水平，如62所示。该水平例如可以是每样份中靶标的平均拷贝数。可以使用来自枚举步骤60的靶标阳性样份的数量或靶标阴性样份的数量的值以及样份总数的值来计算平均拷贝数。在一些实施方式中，平均拷贝数可以使用泊松统计来计算。

图6示出了针对第一靶标和第二靶标进行样品分析的示例性方法70的流程图。方法70采用在给定的波长或波段相对于靶标阴性样份而言对第一靶标阳性样份产生光致发光净减少以及在给定的波长或波段相对于靶标阴性样份而言对第二靶标阳性样份产生光致发光净增加的试剂。换句话说，各个样份中第一靶标或第二靶标的存在导致从所述样份检测到的光致发光的反向作用。方法70的各个步骤，即步骤72、74、76、78、80和82，分别对应于方法50的步骤52、54、56、58、60和62，可以按照方法50所述进行，但具有以下可选差异。

可以形成样份，如72所示。可以按照上述步骤52的方法形成样份，其中探针是具有第一标记物的第一探针，但也包括部分占据的第二靶标，以及具有第二标记物的第二探针。第二探针可以被配置为与对应于第二靶标的扩增子杂交。第一标记物和第二标记物可以在结构上彼此相同和/或可以发射相同波长的光，以允许在相同波长下检测标记物的光致发光。每个样份可包含用于产生对应于第一靶标和第二靶标的相应扩增子的引物。例如，每个样份可包含用于产生第一扩增子的第一对引物和用于产生第二扩增子的第二对引物。

可以在该样份中生成与第一和第二靶标相对应的扩增子，如74所示。可以如上文针对步骤54所述进行扩增。

可以检测来自独立样份的第一和第二标记物的光致发光，如76所示。该光致发光可以通过相同的光致发光检测器来检测作为来自两种标记物的集合光致发光。

可以将各个样份分类为包含各靶标或缺少各靶标，如78所示。例如，可以将从每个样份检测到的光致发光值与第一阈值和/或第二阈值进行比较。如果该值低于第一阈值，则该样份可以被分类为对于第一靶标阳性。如果该值高于第二阈值，则该样份可以被分类为对于第二靶标阳性。如果该值在阈值之间，则该样份可以被分类为两种靶标阴性。

可以枚举各样份，如80所示。枚举步骤80可以与上述枚举步骤60类似地执行，不同之处在于，还获得了第二靶标阳性样份数或第二靶标阴性样份数的值。

可以确定靶标水平，如82所示。可以如上文针对方法50的步骤62所述确定每个靶标水平。

方法50和70的其他方面在本文其他地方描述。例如，在第IV节中描述了方法50和70的示例性试剂配置。第IV节和第V节中描述了方法50和70中划分样品和/或形成样份，执行扩增反应，检测光致发光，分类样份，枚举样份以及确定靶标水平的步骤的其他方面。

IV.示例性方法和试剂配置

本节示意性地说明和描述了使用在光致发光中产生非常规/发现变化的试剂配置(即组合物)对至少一种靶标进行样品分析的示例性方法；参见图7-12。本节的方法步骤可以使用本文公开的试剂的任何组合以任何合适的顺序和组合来执行，参见本公开在其他地方的进一步描述，例如在第III节和第V节中。与这些方法相关的组合物的其他方面在本文的其他地方，例如第VI节中描述。

图7示出利用光致发光的净减少以指示靶标存在的示例性数字扩增试验90的各个方面。左侧示出了在靶标扩增之前的独立样份92，其中仅一个子集的样份包含至少一个拷贝的核酸靶标94(“T”)。如图所示，在该样份集合中，每个样份92可以包含分隔物96、接收物98、探针100和引物102，它们各自可以包括或可以是核酸低聚物(或其寡聚物部分)。在所描绘的实施方式中，分隔物96和引物102被配置为用于扩增靶标94的各自的正向和反向引物，其中分隔物和引物的3'端由箭头标识。每个样份还可以包括聚合酶(例如，热稳定聚合酶)以及dNTP或NTP，用于在延伸引物时将其添加到引物的3'端。

每一个接收物98和探针100可以用适当的部分标记。接收物98可具有连接至核酸低聚物的链的至少一种猝灭剂104(也称为猝灭剂部分)。探针100具有连接至核酸低聚物的链的至少一种光致发光体106(也称为光致发光体部分)。当猝灭剂与光致发光体彼此足够接近时(例如，当接收物与探针杂交时)，猝灭剂能够猝灭来自光致发光体的发光。每个猝灭剂部分和/或光致发光体部分可以化学键合，例如共价键合至核酸低聚物的相应链。

可以在样份92中进行扩增反应。对于在虚线108上方表示的靶标阳性样份和在虚线下方表示的靶标阴性样份，示意性地对比了扩增结果。扩增反应可以仅在靶标阳性样份中产生对应于靶标94的扩增子110。每一个分隔物96和引物102通过引物延伸形成扩增子的互补链之一，这减少了可用于与接收物98(和/或探针100(也参见图9和12))杂交的分隔物的量。

接收物98与分隔物96和探针100充分互补，以便在测定过程中，例如在扩增完成之后和在检测到光致发光之前，分别与它们杂交。通过接收物98和探针100彼此碱基配对(虚线108以上)来形成探针-接收物杂合体112。通过分隔物96和接收物98彼此碱基配对(在虚线108下方)，形成分隔物-接收物杂合体114。然而，分隔物-接收物杂合体114更稳定，这使得分隔物与探针100竞争以与靶标阴性样份中的接收物98杂交。通过引物延伸，分隔物96的量在靶标阳性样份中减少，这使得这些样份中形成探针-接收物杂合体112。

探针100与接收物98的杂交程度决定了探针100的光致发光体106在扩增后发光的能力。在靶标阳性样份中，由于形成探针-接收物杂合体112，更多百分比的探针100被接收物98猝灭。在虚线108上方的杂合体112中填充有光致发光体106，以指示该光致发光体优选在靶标阳性样份中被猝灭。因此，从靶标阳性样份中检测到较低的光致发光强度，在图7的右侧以116示意性示出并且通过界定每个靶标阳性样份的虚线来指示。在靶标阴性样份中，由于可用于形成更稳定的分隔物-接收物杂合体114的分隔物96的数量更多，因此较少百分比的探针100被接收物98猝灭。在虚线108下方的光致发光体106未填充，表明光致发光体在靶标阴性样份中发射更多的光，如图7右侧的118示意性示出并且通过实线界定每个靶标阴性样份。

通常使用与上述图7相同的逻辑和约定来说明图8-12中所示的方法和试剂配置。因此，以下图8-12的讨论主要集中在在以下方法和试剂配置与图7的不同之处。

图8示出了利用光致发光的净减少来指示靶标存在的另一示例性数字扩增试验120的各个方面。图8所示的方法利用了具有封闭的3'端的分隔物96，如122所示，其防止扩增期间该分隔物被聚合酶延伸。因此，分隔物不充当扩增引物；而是由单独的正向引物124实现该作用。分隔物96与靶标94和/或通过扩增产生的扩增子110的区域杂交，如在扩增子内的分隔物的虚线表示所示。在扩增反应期间通过聚合酶延伸引物之一(例如，所示实施方式中的正向引物124)可导致至少摩尔分数的分隔物水解，如126所示，选择性地在靶标阳性样份中(虚线108上方)。当检测光致发光时，这种靶标阳性样份中分隔物的量的减少使得相对于靶标阴性样份而言在靶标阳性样份中存在更多的探针-接收物杂合体112以及更少的分隔物-接收物杂合体114。对光致发光强度的影响与图7相同，即与靶标阴性样份相比，靶标阳性样份中的净减少，如图8右侧的116和118所示。

图9示出了利用光致发光的净减少来指示靶标存在的又一示例性数字扩增试验140的各个方面。图9所示的方法利用自猝灭报告子142来提供具有猝灭剂104的接收物98和具有光致发光体106的探针100(与图7的分离的接收物98和探针100分子比较)。换言之，探针和接收物可以在同一分子内彼此共价连接，并且可以在分子内彼此杂交以产生茎环结构，也称为发夹。间隔序列位于报告子的探针序列和接收物序列之间。间隔序列形成环，并且探针序列和接收物序列彼此杂交以形成茎环结构的茎。

分隔物96可以被配置为与报告子142杂交，以形成相对于报告子142的分子内探针-接收物杂合体146而言，猝灭剂104和光致发光体106之间距离增加的分隔物-报告子杂合体144。分隔物-报告子杂合体144可以阻断报告子142的分子内杂交，并且可能比分子内探针-接收物杂合体146更稳定。在所示实施方式中，由于引物延伸(或水解(见图8))导致靶标阳性样份中分隔物96的量减少，当检测光致发光时，相对于靶标阴性样份而言，在靶标阳性样份中存在更多的分子内探针-接收物杂合体146以及更少的分隔物-报告子杂合体144。对光致发光强度的影响与图7相同，即与靶标阴性样份相比，靶标阳性样份中的净减少，如图9右侧的116和118所示。

分隔物96的3'端可能无法与报告子142碱基配对，如148所示。这种互补性的缺乏可以防止以报告子142为模板的聚合酶引起的分隔物96的延伸。或者，如图8所示，可以封闭分隔物96的3'端，并且可以在靶标阳性样份中选择性地水解分隔物。

分隔物96可以被配置为与报告子142的任何合适的部分杂交。该分隔物可以与接收物98的序列，探针100的序列，接收物和探针之间的间隔序列或其任何组合杂交。

图10示出了利用光致发光的净减少来指示靶标存在的另一示例性数字扩增试验160的各个方面。图10所示的方法采用的分隔物96具有不与靶标94或扩增子110杂交的5'尾162以及与靶标和扩增子杂交的3'序列164。分隔物在扩增过程中用作正向引物。因此，扩增子110可在一条链上包含5'-尾162的序列，在另一链上包含其互补序列。

接收物98与探针100杂交以形成探针-接收物杂合体112，并与5'-尾162杂交以形成分隔物-接收物杂合体114。当检测光致发光时，在靶标阳性样份中由于扩增引起的分隔物96的量减少使得相对于靶标阴性样份而言在靶标阳性样份中存在更多的探针-接收物杂合体112和更少的分隔物-接收物杂合体114。对光致发光强度的影响与图7相同，即与靶标阴性样份相比，靶标阳性样份中的净减少，如图10右侧的116和118所示。在其它实施方式中，探针100可与分隔物的5’-尾162杂交。

具有5'尾的分隔物允许将相同的“通用”接收物和“通用”探针与不同的靶标特异性分隔物一起使用。每个靶标特异性分隔物的5'尾可以与通用接收物(或通用探针(见图11))杂交，但不与靶标或扩增子杂交；并且其3'序列与靶标和扩增子杂交。

图11示出了利用光致发光的净减少来指示靶标存在的另一示例性数字扩增试验180的各个方面。按照图7所示进行试验，不同之处是分隔物96与探针100杂交以形成分隔物-探针杂合体182。由于引物延伸(如图所示)或者水解(见图8)导致靶标阳性样份中分隔物96的量减少，当检测光致发光时，相对于靶标阴性样份而言，在靶标阳性样份中存在更多的探针-接收物杂合体112以及更少的分隔物-探针杂合体182。对光致发光强度的影响与图7相同，即与靶标阴性样份相比，靶标阳性样份中的净减少，如图11右侧的116和118所示。

图12示出了根据方法70的示例性多重扩增试验200。该方法定量了第一靶标94a(“A”)和第二靶标94b(“B”)，并且利用来自不同探针100,202的相同标记物(光致发光体106)检测到的光致发光的反向变化以指示每个靶标94a，94b的存在。相对于无靶标，第一靶标94a的存在使光致发光净减少，如图7中，在图12右侧的116和118所示。在其他实施方式中，净减少可通过图8-11的任何试验配置产生，代替图7的配置。第二靶标94b的存在相对于无靶标产生了光致发光的净增加，如图12右侧的204所示。

可以形成包含部分占据的靶标94a，94b的样份92，其中仅一个子集的样份含有至少一个拷贝的第一靶标94a以及仅一个子集的样份含有至少一个拷贝的第二靶标94b。每个样份还可以包含上述针对图7(或图8-11中的任何一个)描述的一组试剂，包括分隔物96，接收物98，探针100和反向引物102(或用于扩增第一靶标94a的一对引物，如果分隔物被配置为水解而不是延伸)。

每个样份还可包含用于检测第二靶标94b的存在的试剂，即探针202，以及扩增引物206、208，以产生对应于第二靶标94b的扩增子210。探针202可包括猝灭剂104和光致发光体106，该光致发光体106能由猝灭剂以邻近依赖性方式猝灭。在其他实施方式中，以相同的检测波长和/或在相同的检测波段内发射光的各个不同的光致发光体可以标记探针100和探针202。在所示的实施方式中，探针202是在其3'-端封闭并且与扩增子210互补的水解探针。探针212的至少摩尔分数在扩增过程中降解，如212所示并且在扩增子210中所示探针202的虚线形式表示。探针202在含有第二靶标94b的样份中选择性降解，该第二靶标94b使探针的猝灭剂104和光致发光体106彼此解联。在其他实施方式中，探针202可以是分子信标探针，置换探针，或本文其他地方(例如在第V节中)描述的任何其他探针。

V.分析方法的其他方面

本节描述了第III节和第IV节的方法的其他示例性方面。本节中描述的步骤可以以任何合适的顺序和组合来执行，并具有本文其他地方(如第I-IV节)中描述的任何试验配置、各个组件和特征。

反应混合物制备。可以制备反应混合物。反应混合物可以是被配置为支持每种靶标扩增的扩增混合物，因此可以包含用于扩增对应于存在于反应混合物中的样品所提供的每种靶标的扩增子所必需的所有试剂。在下文中更详细描述的试剂可以例如包括dNTP和/或NTP，聚合酶(例如，RNA聚合酶或DNA聚合酶，其可以是或不是热稳定的)，连接酶，缓冲剂，水，表面活性剂等。试剂还可以包括一对引物和每种靶标的标记探针。对于至少一种靶标，探针可以具有光致发光标记物，并且反应混合物还可以包括具有针对该标记物的猝灭剂的接收物以及分隔物。

反应混合物中的多核苷酸提供了靶标并且可以具有任何合适的结构和特征。在进行扩增反应之前，每种靶标可以在反应混合物中至少主要为单链或至少主要为双链。每种靶标可以例如至少主要是DNA(例如，基因组DNA，线粒体DNA或cDNA)，至少主要是RNA(例如，基因组RNA，转录RNA，信使RNA，tRNA，核糖体RNA等)，它们的组合(例如，DNA-RNA杂合体)等。提供每种靶标的分子的长度可以是均匀的(例如，通过限制性内切酶消化形成或用作全长)，也可以大小不同(例如，通过随机片段化形成，例如剪切、非特异性核酸酶消化等)。可以由包含不同核酸(不同多核苷酸)的复杂混合物的样品提供靶标，其中靶标是少数(minor)物质。样品可以包括核酸，并且该核酸可以基本上由基因组DNA，线粒体DNA，基因组RNA，总RNA，核RNA，细胞质RNA，信使RNA或其任何组合等组成。

引物可包括用于产生每个扩增子的正向引物和反向引物。正向引物和反向引物可以限定扩增子的末端。本文公开的任何引物可以是任何合适长度的寡核苷酸，例如至少10、15或20个核苷酸。

在一些实施方式中，反应混合物的形成可包括将样品与用于扩增的试剂和用于报告是否发生扩增的一种或多种报告子(也称为信号传导剂)组合。用于扩增的试剂可以包括一种或多种用于合成对应于每种靶标的扩增子的引物，dNTP和/或NTP，至少一种酶(例如，聚合酶，连接酶，逆转录酶，限制酶或它们的组合，它们中的每一个可以是或不是热稳定的)和/或类似物。

报告子可以具有任何合适的结构和特征。靶标之一的报告子可以是与至少一部分扩增子杂交的探针(例如，参见图12的探针202)。探针可以包括寡核苷酸和化学键合(例如，共价键合)至寡核苷酸以标记寡核苷酸的光致发光体。探针还可以包括与寡核苷酸化学键合(例如，共价键合)的猝灭剂。探针可能能够与相应扩增子的至少一部分(例如，链)杂交。探针可以或可以不用作在试验中延伸形成至少一部分扩增子的扩增引物。示例性的标记探针包括探针，探针/引物，探针，探针，分子信标探针，引物，在扩增子上彼此相邻结合时表现出FRET的杂交探针的邻近依赖性对，引物等。

样份形成包含每种靶标的样品可以分为独立样份。可以通过将上述反应混合物分成独立样份来分配样品，或者可以在与所有测定试剂混合之前分配样品，等等。

形成的样份可包含“部分占据”的每种靶标，这意味着一个子集(一个或多个)样份不包含靶标拷贝并且其余样份包含至少一个拷贝的靶标。例如，另一个子集(一个或多个)的样份可以包含单个拷贝(仅一个拷贝)的靶标，以及任选地，另一个子集(一个或多个)的样份(例如，其余的样份)可包含两个或更多个拷贝的靶标。术语“部分占据”不限于在任何样份中不多于一个拷贝的靶标的情况。因此，形成样份时，含有部分占据的靶标的样份可以例如包含每个样份大于或小于约一个拷贝、两个拷贝、或三个拷贝的靶标或其他情况。靶标拷贝可以在各个样份之间随机分布，这可以描述为泊松分布。

样份形成可涉及将任何合适的部分(包括至多所有样品/反应混合物)置于样份中。每个样份在空间上都与每个其他样份隔离。所述样份可通过流体/液相(例如乳液或空气的连续相)，通过固相(例如容器的至少一个壁)，或其组合等方式实现彼此隔离。在一些实施方式中，样份可以是设置在连续载液中的液滴，使得液滴和连续相共同形成乳液。

可以通过任何合适的方法，以任何合适的方式形成具有任何合适的性质的样份。例如，可以用流体分配器(例如移液管)形成样份，所述流体分配器至少一种液滴产生器，所述液滴产生器具有孔和/或通道交叉部，通过搅动样品/反应混合物(例如，摇动、搅拌、超声处理等)，在所述孔和/或通道交叉部产生液滴。因此，样份可以依次，并行或成批形成。样份可以具有任何合适的尺寸。这些样份可以具有相同的尺寸或可以具有不同的尺寸。具有相同尺寸的示例性样份是单分散液滴。样份的示例性尺寸包括小于约100、10或1μL，小于约100、10或1nL，或小于约100、10或1pL，等等。

能够扩增每种靶标的样份可以直接由包含靶标拷贝的本体相形成，或者可以分多个步骤形成。在一些情况下，形成样份的步骤可以包括将本体相分成包含部分占据靶标的独立流体样份(例如液滴)。这些流体样份可以是用于试验的样份或可以有助于所述样份。例如，这些流体样份可以是第一组的流体样份，并且形成样份的步骤可以包括将第一组的各个流体样份与第二组的各个流体样份组合。第二组样份可包含一种或多种用于扩增一个或多个靶标的试剂，例如至少一种用于扩增至少一个靶标的引物，探针等。组合步骤可以包括将第一组的流体样份与第二组的流体样份单独融合，例如将包含靶标的液滴与包含用于扩增的引物的液滴融合。

扩增。可以在样份中进行扩增反应。对应于每种靶标的扩增子可以至少主要地或排他地在包含靶标的至少一个拷贝的样份中产生。

扩增可以是或不是等温下进行。在某些情况下，可以通过热循环(即，使样份经历加热和冷却的多个循环)来促进样份扩增。可以在变性温度(例如，大于约90摄氏度)，退火温度(例如，约50-75摄氏度)和/或延伸温度(例如，约60至80摄氏度)下温育样份，持续一个或多个循环。在一些实施例中，样份可以热循环以促进聚合酶链式反应和/或连接酶链式反应。可能合适的示例性等温扩增方法包括：基于核酸序列的扩增，转录介导的扩增，多重位移扩增，链位移扩增，滚环扩增，DNA的环介导扩增，解旋酶依赖性扩增和单-引物扩增等。

光致发光检测。可以在任何合适的时间检测样份的光致发光。例如，可以在扩增完成之前(例如，在扩增的指数阶段或线性阶段，用于动力学测定)或在扩增基本完成之后(例如，在扩增的平稳期，用于终点测定)检测光致发光。

可以检测由探针的光致发光体发射的光。光的检测可以描述为扩增数据的收集。可以通过检测从各个完整样份发出的光来收集数据。可以响应于样份被激发光照射而发射光。可以收集一个光谱区域(一个光学通道)，一对不同光谱区域(两个光学通道)(例如，每个标记物一个)等情况下来自样份的发射光的数据。不同的光谱区域由相对于彼此的不同的波长和/或波段限定。

光通道可以代表产生和检测发射光的特定检测方案。该检测方案可以通过用于检测发射光的波长/波段(即，波长方案)来表征。如果在检测方案中使用脉冲激发光来诱导光发射，则检测方案可表征为用激发光照射的波长或波段和/或相对于每个光脉冲检测光发射的时间间隔。因此，彼此不同的光通道可以在激发光的波长/波段方面，在检测到的发射光的波长/波段方面，和/或在相对于激发光的每个脉冲检测发射光的时间间隔方面等情况而不同。

可以在任何合适的条件下从多个样份中收集数据。可以在大约相同的温度下从多个样份中收集所有数据，例如在低于每个扩增子的解链温度，低于约50、40或30摄氏度，低于样份中探针-接收物杂合体(和/或分隔物-探针杂合体，分隔物-接收物杂合体，和/或分隔物-报告子杂合体)的解链温度，和/或低于进行扩增反应的最低温度。

获取信号值。可以对检测到的光致发光进行处理以获得每个样份的至少一个信号值。例如，可以解析光致发光信号以识别对应于每个样份的信号部分。然后，可以例如通过对信号部分进行积分，在信号部分上取信号的最大值或平均值等来从信号部分获得针对样份的信号值。无论如何，可以为每种标记物和/或光通道分配一个信号值。

样份分类。基于样份的至少一个信号值，每个样份可以被分类为对于每种靶标为阳性或阴性。信号值可以与一个或多个阈值进行比较用于分类，如本文其他地方所述。

样份枚举。可以枚举每种靶标分别为阳性(或阴性)的样份各自的数量，并且可以枚举总的样份数量，如本文其他地方所描述的。

计算靶标水平。可以计算每种靶标的水平。对于给定靶标，该计算可以基于靶标阳性(或阴性)的样份数量的第一值，以及可选地，总的样份数量(靶标阳性样份加上靶标阴性样份)的第二值。

该水平可以是靶标的绝对或相对水平。绝对水平可以例如是靶标的分子/拷贝数，或靶标的浓度(例如，每个样份中)，等等。相对水平例如可以是靶标相对于参比靶标的相对拷贝数。或者，相对水平可以是每个基因组，每个核酸质量(例如，每个基因组DNA质量)等表达的靶标的相对量。

该水平可以代表扩增前存在的靶标的水平。水平的确定可以是(或可以不是)基于在样份之间具有泊松分布的每种靶标。每个水平例如可以是代表靶标阳性(或阴性)样份的总数的值，或者是浓度值，例如代表每个样份中靶标的平均拷贝数的值，等等。使用任何合适的算法，该数据还可以用于(例如，直接和/或作为浓度数据)估计拷贝数(CN)和拷贝数变化(CNV)或样品的任何其他性质。

可以利用泊松统计来确定每种靶标的水平(例如浓度)。可以相对于样份和/或相对于提供靶标的样品来表达浓度。可以通过假设靶标的拷贝(扩增前)在各个样份之间具有泊松分布，从靶标阳性样份的分数(或等效地，靶标阴性样份的分数)计算样份中靶标的浓度。在该假设下，具有k个靶标拷贝的样份的分数f(k)通过下述等式给出：

其中，λ是样份中靶标的浓度，表示为每个样份(扩增前)中靶标的平均拷贝数。可以从上述更通用的等式导出简化的泊松等式，用于根据靶标阳性样份的分数确定靶标的浓度。可以使用的示例性泊松等式如下所示：

其中，N₊是对于给定靶标呈阳性的样份数量(即样份计数)，以及其中，N_tot是样份的总数(靶标阳性加上靶标阴性)。N_tot等于(a)靶标N₊和(b)对于给定靶标呈阴性的样份数量或即N_-的总和。N₊/N_tot(或N₊/(N₊+N_–))等于f₊，模板阳性样份的分数(即,f₊＝f(1)+f(2)+f(3)+…)(参见等式1)，是对至少具有一个拷贝的模板的样份的概率的估计值。可以使用的另一示例性泊松等式如下所示：

其中，N_–和N_tot如上定义。N_–/N_tot等于f_–，阴性样份的分数(或1–f₊)，是对没有靶标拷贝的样份的概率的测量估计值，而λ是如上所述的靶标的浓度。

上述等式2和3可以经重新排列以产生下式：

λ＝ln(N_tot)-ln(N_tot-N₊) (4)

λ＝ln(N_tot)-ln(N_{_}) (5)

例如，可以用等式2-5中的任一等式，使用针每种靶标的N_tot和N₊(或者等效地，N_-)所获得的值(即，样份计数)来确定试验中每种靶标的浓度。在一些情况中，对于每种靶标，N_tot(全部样份计数)的值可以是相同的。在其他情况中，N_tot的值可以不同，例如由于群体重叠而将样份的一些群体从全部计数中排除。在一些实施方式中，N_tot可以等同于所有群体的组合，即，针对所有鉴定的群体的样份计数之和。

在一些实施方式中，可以不使用泊松统计而直接从阳性分数获得靶标的水平。特别地，随着浓度的降低，阳性分数和浓度(每个样份的拷贝数)发生重合。例如，当阳性分数为0.1，用等式2确定的浓度约为0.105，相差仅5％；当阳性分数为0.01时，确定的浓度约为0.01005，相差只有0.5％的十分之一。但是，使用泊松统计可以提供更准确的浓度估算值，尤其是相对较高的阳性分数时，因为泊松统计数考虑相同样份中存在同一靶标的多个拷贝。

适用于本发明的系统的反应混合物制备，样份形成，扩增，检测，信号处理，样份枚举以及计算水平/数量等的其他方面在本公开内容的其他地方以及在交叉引用中指出的参考文献中描述，它们通过引用并入本文。

VI.组合物

本部分描述了本公开的示例性组合物。每种组合物可包括至少一个样份或多个独立样份。如果组合物包含多个样份，则每个样份可包含同一样品的一部分，具有光致发光标记物的探针，配置为与探针杂交的接收物(所述接收物可猝灭所述标记物)，以及配置为阻断接收物与探针杂交的分隔物。如果组合物包括多个样份，则仅一个子集的样份可以包含来自样品的靶标的至少一个拷贝。每个样份可包含扩增试剂以产生对应于靶标的扩增子，如本文其他地方所述。分隔物可被配置为阻断靶标阴性样份中接收物与探针的优选杂交，并且可以被配置为通过产生扩增子实现优先在靶标阳性样份中延伸或降解。样份之间可以是相同的尺寸。

在一些实施方式中，可以通过包封每个样份的不混溶液体将样份彼此隔离。因此，组合物可以包括包含样份和不混溶液体的乳液。

在一些实施方式中，探针可以是第一探针，并且每个样份可以包含具有光致发光标记物的第二探针。第一探针和第二探针各自的标记物可以彼此相同和/或可以具有重叠的发射光谱。

VII.实施例

下列实施例描述了光致发光中具有非常规/反向变化的数字扩增试验的选定方面和实施方式。这些方面和实施方式仅用于说明目的，而不是限制本公开的整体范围。

实施例1：试验数据

本实施例提供了从单重扩增试验和多重扩增试验收集的示例性试验数据，各自包括针对AP3B1靶标的分隔物，以及相应的探针和接收物；参见图13和14(也参见图7和12)。

图13显示了大致根据图7所示形成和加工的液滴中检测到的荧光图。每个液滴均包含一对引物，用于扩增AP3B1基因的序列；FAM染料标记的探针；以及配置为与探针杂交并标记有针对FAM染料的猝灭剂的接收物。引物之一也是分隔物，其被配置为与接收物杂交以防止猝灭FAM染料的荧光的探针-接收物杂交。

在代表FAM染料荧光和HEX染料荧光的两个不同光谱区域中检测到荧光。但是，试验中不存在HEX染料；HEX荧光值的分布与靶标的存在与否无关，并有助于绘制数据以便于观察。

每个液滴在图13中表示为单个点，并根据检测到的FAM和HEX荧光强度定位于图中。液滴形成两个簇：具有较强FAM荧光的AP3B1阴性(NEG)簇和具有较弱FAM荧光的AP3B1阳性簇。

图14显示了大致根据图12所示形成和加工的液滴中检测到的荧光图，不同之处是还测定第三靶标。每个液滴包含AP3B1引物，TERT引物和RPP30引物。如图13所示，通过FAM荧光的减少报告了AP3B1序列的扩增，AP3B1对应于图12中的靶标A。使用FAM标记的水解探针，通过FAM荧光报告了TERT序列的扩增(如对于图12中的靶标B)。使用HEX标记的水解探针通过HEX荧光报道了RPP30序列的扩增。对于每种靶标(TERT，AP3B1或RPP30)呈阳性的液滴簇如图14所示，阴性簇(NEG)不包含任何靶标。当将TERT簇和AP3B1簇各自与阴性簇进行比较时，它们的FAM荧光呈现反向变化。

实施例2：选定的实施方式

该实施例以一系列标引的段落描述了本公开选定的实施方式。

段落1.一种分析方法，所述方法包括：

(A)形成独立样份，每个样份包括相同样品的一部分，其中每个样份还包括(i)具有标记物的探针，(ii)具有猝灭剂并配置为与探针杂交以猝灭标记物的接收物，以及(iii)分隔物，所述分隔物被配置成与探针和/或接收物杂交以阻断接收物与探针的杂交，并且其中仅一个子集的样份包含来自样品的靶标的至少一个拷贝；

(B)在所述样份中进行扩增反应以产生对应于靶标的扩增子，其中所述分隔物与扩增子杂交，并且其中所述分隔物通过扩增反应在靶标阳性样份中延伸或降解；以及

(C)检测来自所述样份的标记物的光致发光，其中靶标阳性样份的光致发光小于靶标阴性样份的光致发光。

段落2.如段落1所述的方法，其中，所述分隔物与接收物杂交以阻断接收物与探针的杂交。

段落3.如段落1所述的方法，其中，所述分隔物与探针杂交以阻断接收物与探针的杂交。

段落4.如段落1-3中任一项所述的方法，其中，与探针和/或接收物杂交的分隔物比与探针杂交的接收物具有更多的碱基对。

段落5.如段落1-4中任一项所述的方法，其中，所述分隔物与扩增子形成比与探针和/或接收物更多的碱基对。

段落6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，与扩增子杂交的分隔物比与探针和/或接收物杂交的分隔物具有更高的解链温度。

段落7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述探针和所述接收物不彼此共价连接。

段落8.如段落1-6中任一项所述的方法，其中，所述探针和所述接收物由同一分子提供。

段落9.如段落8所述的方法，其中，所述分隔物被配置为阻断接收物与探针的分子内杂交。

段落10.如段落9所述的方法，其中，所述分隔物与探针序列、接收物序列和/或与探针序列和接收物序列之间的间隔序列杂交。

段落11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中，所述探针和/或接收物被配置为在进行扩增反应的步骤期间防止探针和/或接收物的3'延伸。

段落12.如段落11所述的方法，其中，所述探针和所述接收物中的至少一个包括3'-末端磷酸。

段落13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中，所述分隔物在进行扩增反应的步骤中作为扩增引物延伸。

段落14.如段落1-12中任一项所述的方法，其中，所述分隔物通过扩增反应水解。

段落15.如段落14所述的方法，其中，所述分隔物被配置成在进行扩增反应的步骤期间防止所述分隔物的3'-延伸。

段落16.如段落1-15中任一段所述的方法，其中，所述分隔物具有不与靶标杂交的5'尾和与靶标杂交的3'序列，并且其中所述探针或所述接收物与所述分隔物的5'尾杂交但不与3'序列杂交。

段落17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中，所述形成步骤包括以下步骤：形成每个样份作为相同混合物的等分试样。

段落18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中，每个样份是液滴，并且形成步骤包括产生液滴的步骤。

段落19.如段落1-18中任一项所述的方法，其中，进行扩增反应的步骤包括使样份热循环以促进聚合酶链式反应的步骤。

段落20.如段落1-19中任一项所述的方法，进一步包括用激发光照射样份以引起光致发光的步骤。

段落21.如段落1至20中任一项所述的方法，进一步包括基于检测到的光致发光将个体样份分类为靶标阳性或阴性的步骤。

段落22.如段落21所述的方法，其中，所述分类步骤包括将对于给定样份检测到的光致发光强度值与至少一个阈值进行比较的步骤。

段落23.如段落22所述的方法，其中，所述强度是给定样份的积分强度。

段落24.如段落1-23中任一项所述的方法，进一步包括枚举靶标阳性样份或靶标阴性样份的步骤。

段落25.如段落24所述的方法，进一步包括基于在枚举步骤中获得的值来确定靶标水平的步骤。

段落26.如段落25所述的方法，其中，确定水平的步骤采用靶标阳性样份或靶标阴性样份的数量的第一值以及样份总数的第二值。

段落27.如段落1至26中任一项所述的方法，其中，所述靶标是第一靶标，所述探针是第一探针，其中，仅一个子集的样份包含第二靶标，其中每个样份包含用于第二靶标的第二探针，并且其中包含第二靶标的样份的光致发光比不含第一靶标和第二靶标的样份的光致发光更高。

段落28.一种分析方法，所述方法包括：

(A)形成独立样份，所述独立样份各自包含探针、接收物和分隔物，所述探针具有标记物，所述接收物具有针对所述标记物的猝灭剂，其中仅一个子集的样份包含靶标的至少一个拷贝；

(B)扩增样份中的靶标；

(C)检测来自个体样份的标记物的光致发光；和

(D)利用光致发光将个体样份分类为包含或缺乏靶标；其中所述分隔物在缺乏靶标的样份中阻断接收物与探针的杂交，并且其中所述分隔物通过靶标扩增在包含靶标的样份中延伸或降解，使得包含靶标的样份的光致发光小于缺乏靶标的样份的光致发光。

段落29.一种用于分析的组合物，包含：多个独立样份，每个样份包括相同样品的一部分，具有光致发光标记物的探针，配置为与所述探针杂交并且具有针对所述标记物的猝灭剂的接收物，以及分隔物；其中仅一个子集的样份包含来自样品的靶标的至少一个拷贝，其中每个样份包含扩增试剂以产生对应于靶标的扩增子，其中分隔物被配置为阻断靶标阴性样份中接收物与探针的杂交，其中分隔物被配置为通过产生扩增子而在包含靶标的样份中扩增或降解。

段落30.如段落29所述的组合物，进一步包含乳液，所述乳液包括液滴形式的样份并且还包括围绕液滴的不混溶的载液。

上述公开内容可以包括具有独立效用的多个不同的发明。虽然已经以其优选的形式公开了这些发明中的各种，但是本文所公开和阐释的本发明的特定实施方式不应被认为是限制性的，因为可以进行多种变化。本发明的主题包括本文所公开的各种元件，特征，功能和/或特性的所有新颖且非显而易见的组合和子组合。下述权利要求特别指出了新颖且非显而易见的某些组合和子组合。可以在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护以特征，功能，元素和/或特性的其他组合和子组合体现的发明。这样的权利要求，无论是针对不同的发明还是相同的发明，以及与原始权利要求的范围相比更宽、更窄、相同或不同，也被视为包括在本公开的发明的主题内。此外，用于标识元素的序号指示符，如第一，第二或第三用于区分元素，并且不指示此类元素的特定位置或顺序，除非另有特别说明。最后，本公开通过引用纳入材料。如果通过引用纳入而导致术语含义中存在歧义或冲突，则本申请的字面内容决定术语的构造。