基于3′-oh的生成诱导多色荧光编码及高通量检测dna中不同糖苷酶的荧光分析方法
阅读说明：本技术 基于3′-oh的生成诱导多色荧光编码及高通量检测dna中不同糖苷酶的荧光分析方法 (Fluorescence analysis method for generating induced multicolor fluorescence coding and detecting different glycosidases in DNA in high flux based on 3' -OH ) 是由 张会鸽 高子茜 陈宏丽 陈兴国 于 2021-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种基于3′-OH的生成诱导多色荧光编码高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。该方法操作步骤简单,检测通量高,具有良好的选择性和较高的灵敏度。经实验结果表明,其测定UDG糖苷酶的检测限为5.5×10～(-5)U/mL,hAAG糖苷酶的检测限为3.3×10～(-3)U/mL。此外,该方法可用于检测人宫颈癌细胞系和正常人肾上皮细胞种的UDG和hAAG,还可用于评价两种酶的动力学参数。本发明是一种经济、简单、特异、灵敏的高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。(The invention belongs to the technical field of biological detection, and particularly relates to a fluorescence analysis method for high-throughput detection of different glycosidases in DNA (deoxyribonucleic acid) based on generation-induced multicolor fluorescence coding of 3' -OH. The method has the advantages of simple operation steps, high detection flux, good selectivity and high sensitivity. The experimental result shows that the detection limit of the method for determining UDG glycosidase is 5.5 multiplied by 10 ‑5 U/mL, detection limit of hAAG glycosidase 3.3X 10 ‑3 U/mL. In addition, the method can be used for detecting UDG and hAAG of human cervical cancer cell lines and normal human renal epithelial cell species, and can also be used for evaluating kinetic parameters of two enzymes. The invention is an economic, simple, specific and sensitive fluorescence analysis method for detecting different glycosidases in DNA in high flux.)
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于3′-OH的生成诱导多色荧光编码及高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。
背景技术
DNA损伤是生命过程中的一个自发过程，将会导致基因组不稳定、发育障碍、过早衰老和/或癌症。不同DNA糖苷酶可发起异常碱基切除修复(base excision repair,BER)，从DNA链中剪除受损碱基，维持基因组的稳定性，预防人类疾病。然而，异常活性的DNA糖苷酶会干扰修复过程，导致各种疾病，如人类免疫缺陷、bloom综合征和癌症。因此，DNA糖苷酶是一类有价值的疾病标志物。最近，越来越多的证据表明，某种特定DNA糖苷酶的异常表达可能与各种疾病有关，或一种疾病可能与几种DNA糖苷酶活性异常有关，例如，DNA糖苷酶在多种人类癌细胞中都有过表达，如人类宫颈癌HeLa、肝癌HepG2、乳腺癌细胞(MCF-7)。具体而言，人类细胞尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)活性异常，可能导致尿嘧啶切除修复功能异常，导致衰老、神经退行性变、癌症等。另一方面，尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)在A549细胞和HeLa细胞中的活性较高。因此，有必要同时对多种DNA糖苷酶进行分析，为癌症的早期诊断和疗效监测提供有力证据。
近年来，已发展了多种检测DNA糖苷酶活性的新方法，如比色法、荧光法和电化学发光法。但方法的灵敏度低，且涂覆电极的过程比较复杂。为提高检测灵敏度，发展了多种等温级联信号扩增方法，如T7外切酶介导信号扩增、TdT聚合酶辅助信号扩增、滚环扩增(RCA)等检测方法，但这些方法只能检测单一DNA糖苷酶。到目前为止，科学家已经开发了几种同时检测多种DNA糖苷酶的方法。例如，Zhang等报道了分别同时检测hOGG1和hAAG、hOGG1和UDG、hAAG和UDG糖苷酶的单分子方法。虽然单分子方法可以同时高灵敏检测多种DNA糖基酶，但单分子仪器价格昂贵，难以大规模推广。现有的荧光分析方法虽然能够同时检测两种DNA糖苷酶的活性，但核酸链设计复杂，引入的lambda核酸外切酶存在非特异性消解，且荧光信号猝灭不完全，导致背景信号高。
为此，我们提出一种经济、简单、特异、灵敏的高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于3′-OH的生成诱导多色荧光编码及高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法，以解决现有DNA糖基酶检测中核酸链设计复杂，引入的lambda核酸外切酶存在非特异性消解，荧光信号猝灭不完全，导致背景信号高的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
所述3′-OH的生成以及诱导多色荧光编码方法包括以下步骤：
S1:发夹底物DNA、UDG信号探针、hAAG信号探针DNA的选取：
S2:对步骤S1中选取的发夹底物进行DNA的退火；
S3:利用UDG和hAAG分别对退火后的发夹底物中尿嘧啶和次黄嘌呤的特异性识别，切断N-糖苷键从而释放受损碱基，生成AP位点；AP位点被核酸内切酶Endo IV切割后分别形成两条3′-OH末端的DNA单链；
S4:利用TdT末端转移酶和dTTP对步骤S3中形成的两条DNA单链末端进行延伸，生成聚T核酸链；
S5:Endo IV辅助循环：将步骤S4中形成的两条DNA单链分别与UDG信号探针和hAAG信号探针杂交形成部分互补双链，随后利用Endo IV识别并切割双链上信号探针的AP位点。
进一步地，所述步骤S1中，发夹底物的茎部含有21对完全互补的碱基，环部由12个碱基组成；距离5′端7个碱基的位置为hAAG识别的次黄嘌呤碱基，距离3′末端17个碱基的位置为UDG识别的尿嘧啶碱基。
优选地，所述发夹底物的3′末端用NH2修饰，UDG信号探针的两端分别用FAM和BHQ1标记，中间位置含有AP位点，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭，信号探针可与其对应的延伸产物杂化形成部分互补双链。
优选地，所述hAAG信号探针的两端分别用Cy5和BHQ3标记，中间位置具有AP位点，由于发生荧光共振能量转移，信号探针以单链存在时，荧光猝灭，且信号探针与其对应的延伸产物杂化形成部分互补的双链。
进一步地，所述步骤S5中，对双链上信号探针的AP位点切割后使得FAM和Cy5荧光信号恢复，且释放出与荧光探针互补的DNA延伸产物，释放出的DNA延伸产物继续与新的信号探针杂交形成双链，发生杂交-剪切-释放的循环过程，使得荧光信号增强。
进一步地，所述发夹底物的DNA序列为：CGA TTC GIG GCA GCA ACA GTG GTG CATAGT GGA CAC UGT TGC TGC CTC GAA TCG，其中U和I分别代表尿嘧啶-DNA糖苷酶UDG和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶hAAG的识别位点。
进一步地，所述UDG信号探针的DNA序列为：FAM-AAAAAAAAAXGTGTCCAC-BHQ1，其中X为AP位点。
进一步地，所述hAAG信号探针的DNA序列为：Cy5-AAAAAAAAAXCGAATCG-BHQ3，其中X为AP位点。
进一步地，所述高通量检测DNA中不同糖苷酶的荧光分析方法，包括以下步骤：
D1:通过退火制备发夹底物,将发夹底物、ThermoPol缓冲、UDG缓冲、BSA、Endo IV、不同浓度的UDG和hAAG进行混合，在37℃反应90min；
D2:将步骤D1中的部分产物与末端转移酶TdT缓冲、CoCl2、dTTPs、TdT、Endo IV、UDG信号探针和hAAG信号探针进行混合，在37℃反应90min；
D3:将D2中得到的产物分别在490nm和640nm的激发波长下测定荧光强度。
优选地，所述步骤D1中发夹底物DNA的终浓度为100-1000nM，UDG信号探针在缓冲溶液中的终浓度为0.25-0.75μM，且保证hAAG1信号探针在缓冲溶液中的最终浓度为0.75-1.25μM。
优选地，所述步骤D2中，末端转移酶TdT在缓冲液中的最终浓度为100-500U/mL，dTTPs在缓冲液中的最终浓度为500μM，Endo IV在缓冲液中的最终浓度为150-350U/mL。
优选地，所述步骤D2中，末端转移酶TdT催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3′-OH末端，且催化作用不需要模板，UDG催化DNA底物链上的尿嘧啶然后释放尿嘧啶，hAAG催化DNA底物双链上受损碱基位点，hAAG催化N-糖苷键的水解断裂，释放受损碱基，Endo IV是一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶，Endo IV切割双链DNA上完整AP位点的5′端的第一个磷酸二酯键，产生3′羟基和5′脱氧核糖磷酸末端。
进一步地，所述的受损碱基位点包括3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1，N6-乙烯基腺嘌呤和次黄嘌呤。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益技术效果是：
本发明的有益效果在于检测过程操作简单，可同时高灵敏检测两种DNA糖苷酶。
附图说明
图1：基于TdT激活的EndoIV-辅助的信号扩增方法同时检测UDG和hAAG活性的原理示意图；(A)UDG；(B)hAAG；(C)UDG和hAAG。
图2：可行性分析：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征分析UDG和hAAG糖苷酶活性：(A)：条带1：发夹底物；条带2：发夹底物+hAAG+Endo IV；条带3：发夹底物+UDG+Endo IV；条带4：发夹底物+hAAG+UDG+Endo IV；(B)：条带1：发夹底物；条带2：发夹底物+hAAG+Endo IV+TdT+dTTPs；条带3：发夹底物+UDG+Endo IV+TdT+dTTPs；条带4：发夹底物+hAAG+UDG+EndoIV+TdT+dTTPs；(C)不同条件下检测UDG糖苷酶的荧光光谱图：红线：存在UDG；黑线：不存在UDG；(D)不同条件下检测hAAG糖苷酶的荧光光谱图：红线：存在hAAG；黑线：不存在hAAG；(E)不同条件下检测UDG+hAAG糖苷酶的荧光光谱图：红线：存在UDG+hAAG；黑线：不存在UDG+hAAG。
图3：实验条件优化：(A)末端转移酶TdT用量对F/F0的影响；(B)Endo IV用量对F/F0的影响；(C)扩增反应时间对F/F0的影响(黑线和蓝线表明没有UDG和hAAG；红线和紫线表明存在UDG和hAAG)；(D)UDG信号探针浓度对F/F0的影响；(E)hAAG信号探针浓度对F/F0的影响。
图4：检测UDG和hAAG糖苷酶活性的荧光变化图：(A)不同浓度的UDG对应的荧光光谱图；(B)荧光强度与UDG浓度对数值之间的线性关系；(C)不同浓度的hAAG对应的荧光光谱图；(D)荧光强度与hAAG浓度对数值之间的线性关系。
图5：不同的糖苷酶以及其它蛋白对荧光强度的影响。
图6：酶动力学参数的评价(A)在4U/mL UDG存在下，起始反应速率与底物浓度之间的关系；(B)在8U/mL hAAG存在下，起始反应速率与底物浓度之间的关系。
图7：检测实际样品中UDG和hAAG荧光强度图；(A)检测不同细胞样品中UDG和hAAG糖苷酶活性；(B)荧光强度与Hela细胞核蛋白提取液中总蛋白浓度对数值的线性关系(UDG)；(C)荧光强度与Hela细胞核蛋白提取液中总蛋白浓度对数值的线性关系(hAAG)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实验中用到的试剂和仪器：尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)、人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)、核酸内切酶IV(Endo IV)、10×BSA、10×ThermoPol缓冲(200mM Tris-HCl,100mM(NH4)2SO4,100mM KCl,20mM MgSO4,1％Triton X-100,pH 8.8),10×TdT缓冲、10×UDG缓冲(200mM Tris-HCl,10mM DTT,10mM EDTA,pH 8.0)均从NEB购买，脱氧核苷酸dTTP和所有的寡核苷酸(见表1)从上海生工购买，SYBR Gold购买于赛默飞世尔科技，实验所需的超纯水都来自于纯水净化系统18202V AXL(重庆，中国)，RF-5301PC型荧光分光光度计(岛津，日本)。
尿嘧啶-DNA糖苷酶UDG和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶hAAG活性分析：
底物DNA链用95℃水浴退火5min，然后自然冷却至室温，最终形成浓度为5μM的双功能发夹底物；在20μL的剪切反应体系中分别加入0.5μM发夹底物，包括1.0mg/mL BSA、10×Thermopol缓冲、10×UDG缓冲、5U Endo IV、不同浓度的UDG和hAAG，在37℃反应90min。然后在20μL的反应体系中，加入4μL的上述剪切产物，包括2μL 10×TdT缓冲、CoCl2、0.55μMUDG信号探针、1.15μM hAAG信号探针、4U Endo IV、10U TdT、dTTPs，在37℃下反应90min。最后在490nm和640nm的激发波长下测定荧光强度。
凝胶电泳分析:
凝胶电泳用于验证该实验方法的可性行。在凝胶电泳分析中，除了4U/mL的UDG和20U/mL的hAAG,剪切反应产物和延伸反应产物样品中所有的成分和上述实验相同。用15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(15％丙烯酰胺，1×TBE缓冲，0.1％过硫酸铵和0.2％N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)在1×TBE缓冲液(9mMTris-HCl，9mM硼酸和0.2mM EDTA，pH7.9)中对剪切反应产物和延伸反应产物样品分别进行分离。在室温条件下恒压120V进行40min，以1×SYBR gold为荧光指示剂染色10min。
选择性和特异性分析：
为了考察该分析方法的选择性，选择FPG和FEN1作为干扰物质。选择性实验中除了使用20U/mL的FPG和2.0U/mL的FEN1代替尿嘧啶-DNA糖苷酶UDG和人类烷基腺嘌呤DNA糖苷酶hAAG，其余的步骤与上述操作相同。
细胞培养：
HeLa细胞和正常人肾脏上皮细胞293T在DMEM培养基中培养(Invitrogen公司，美国)，然后添加15％胎牛血清(Sigma-Aldrich公司，美国)；最后将细胞在含5％CO2、37℃的环境中培养。培养后用核蛋白提取试剂盒提取总核蛋白(中国Solarbio R0050)，用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，获得总蛋白，所得上清液可用于同时检测UDG和hAAG的活性。然后通过BCA蛋白检测试剂盒定量蛋白含量(P0009，Beyotime Biotech，上海，中国)，在提取的蛋白中加入不同体积的无菌水稀释至所需浓度。最后，将2μL不同浓度的蛋白质与反应液混合进行反应，对真实复杂样品中UDG和hAAG活性进行测定。
实验原理：
(1)所提出的UDG活性检测的原理如图1A所示，分析的过程主要包括3个部分：a.UDG特异性识别发夹底物中的尿嘧啶并切断N-糖苷键，生成AP位点；b.3′-OH端的延伸；c.延伸产物诱导的荧光探针被循环剪切。首先，UDG特异性识别发夹底物双链部分的U碱基，切断N-糖苷键释放出受损碱基，生成AP位点，AP位点被Endo IV特异性识别并切割，产生3′-OH末端的核酸链。其次，在末端转移酶TdT和dTTP的共同作用下，3′-OH末端的核酸进行延伸反应。最后，延伸产物与UDG信号探针杂交形成双链，Endo IV识别并切割双链上UDG信号探针的AP位点，释放FAM荧光信号。该过程反复循环，使得荧光信号不断增强。
(2)所提出的hAAG活性检测的原理如图1B所示，分析过程主要包括3个部分：a.hAAG特异性识别发夹底物中次黄嘌呤并切断N-糖苷键，生成AP位点；b.3′-OH端的延伸；c.延伸产物诱导的荧光探针被循环剪切。首先，hAAG特异性识别发夹底物双链部分的次黄嘌呤I碱基，切断N-糖苷键释放出受损碱基，生成AP位点，AP位点被Endo IV特异性识别并切割，产生3′-OH末端的核酸链。其次，在末端转移酶TdT和dTTP的共同作用下，3′-OH末端的核酸进行延伸反应。最后，延伸产物与hAAG信号探针杂交形成双链，Endo IV识别并切割双链上hAAG信号探针的AP位点，释放Cy5荧光信号。该过程反复循环，使得荧光信号不断增强。
所提出的UDG和hAAG活性同时检测的原理如图1C所示，分析过程主要包括3个部分：a.UDG和hAAG同时分别识别发夹底物上的异常碱基U和I，并切断N-糖苷键，生成AP位点；b.3′-OH端的延伸；c.延伸产物诱导的荧光探针被循环剪切。首先，UDG和hAAG分别特异性识别发夹底物双链上的尿嘧啶和次黄嘌呤，切断N-糖苷键从而释放受损碱基，生成AP位点，AP位点被核酸内切酶Endo IV切割后形成两条不同的3′-OH末端的核酸单链。其次，在末端转移酶TdT和dTTP的共同作用下，3′-OH末端的核酸单链分别进行延伸反应。最后，两条延伸产物分别与UDG信号探针和hAAG信号探针杂交形成双链，Endo IV识别并切割双链上UDG信号探针和hAAG信号探针的AP位点，释放FAM和Cy5荧光信号。该过程反复循环，使得两种荧光信号不断增强。
可行性分析：
为了证明该分析方法的可行性，采用15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了剪切反应和延伸反应的产物，如图2A所示，当UDG和hAAG都不存在时(条带1)，除了发夹底物没有新的条带出现，表明没有发生反应；单独加入hAAG时，有新条带出现(条带2)，表明切除次黄嘌呤碱基后，Endo IV发生了切割反应；单独加入UDG时，又有新条带出现(条带3)，表明切除尿嘧啶碱基后，Endo IV发生了切割反应；加入UDG和hAAG时(条带4)，同时出现两条新条带，表明同时切除尿嘧啶和次黄嘌呤碱基后，Endo IV发生了切割反应。如图2B所示，当UDG和hAAG都不存在时(条带1)，除了发夹底物没有新的条带出现，表明没有发生反应；加入hAAG、Endo IV、TdT和dTTP时，有一条新条带出现(条带2)，表明在TdT和dTTP的共同作用下，剪切产物发生延伸聚合反应；加入UDG、Endo IV、TdT和dTT，有一条新条带出现(条带3)，表明在TdT和dTTP的共同作用下，剪切产物发生延伸聚合反应；加入hAAG、UDG、Endo IV、TdT和dTTP，有两条新条带出现(条带4)，表明在TdT和dTTP的共同作用下，两条剪切产物分别进行延伸聚合反应。表明该方法是可行的。我们也通过荧光光谱法考察了该方法的可行性，如图2C所示，当没有加入UDG(黑线)，在494nm的激发波长下基本没有荧光信号，当加入UDG之后(红线)，荧光信号明显增强，表明该方法是可行的；如图2D所示，当没有加入hAAG(黑线)，在640nm的激发波长下基本没有荧光信号，当加入hAAG之后(红线)，荧光信号明显增强，表明该方法是可行的；如图2E所示，当没有加入UDG和hAAG(黑线)，在494nm和640nm的激发波长下基本没有荧光信号，当加入UDG和hAAG之后(红线)，荧光信号明显增强，表明该方法是可行的。这些结果表明，UDG和hAAG能够有效地从发夹底物上剪切尿嘧啶和次黄嘌呤碱基，且彼此之间不干扰，进而分别启动TdT激活-Endo IV辅助的信号扩增。
分析性能的评估：
为了评估该方法的分析性能，最优的条件下测定了不同浓度的UDG和hAAG糖苷酶活性。图4A体现了不同浓度的UDG糖苷酶的荧光光谱。在0.1-3×10-4U mL-1的浓度范围内，随着UDG糖苷酶浓度的增大，荧光强度不断增强。图4B表明荧光强度与UDG糖苷酶浓度的对数呈线性关系，其检测限为5.5×10-5U mL-1。图4C体现了不同浓度的hAAG糖苷酶的荧光光谱。在0.01-20U mL-1的浓度范围内，随着hAAG糖苷酶浓度的增大，荧光强度不断增强。图4D表明荧光强度与hAAG糖苷酶浓度的对数呈线性关系，其检测限为3.3×10-3U mL-1。该方法的高灵敏度主要归结于：(1)UDG和hAAG特异性切除修复诱导的扩增反应的非特异性扩增被抑制，背景降低；(2)TdT-激活Endo IV-辅助扩增反应的效率高
选择性和特异性分析：
为了考察该方法的选择性，选择甲酰胺嘧啶糖苷酶(FPG)和热稳定Flap核酸内切酶1(FEN1)作为干扰物质。FPG糖苷酶能特异性识别和切除底物DNA中8-oxoG/C碱基对中的8-羟基鸟嘌呤(8-oxoG)碱基。FEN1酶可催化切除分叉双链DNA底物中的flap结构。如图5所示，只有UDG或hAAG或UDG和hAAG存在时，所对应的荧光信号强于FPG、FEN1存在时对应的荧光强度，说明该方法的选择性好。
酶动力学参数考察：
为了考察该方法的实际应用性能，用该方法考察了UDG和hAAG的酶动力学参数，如图6A所示，UDG的初始反应速率随着底物浓度(0-300nM)的增加而增大，UDG的vmax为1.906s-1，Km值为147.87nM；如图6B所示，hAAG的初始反应速率随着底物浓度(0-250nM)的增加而增大，hAAG的vmax为1.125s-1，Km值为16.15nM。上述这些结果证明该方法可用于考察UDG和hAAG的酶动力学参数。
实际样品分析：
为了考察该方法在实际样品分析中的性能，用该方法考察了HeLa细胞和正常人肾脏上皮细胞293T中的UDG和hAAG糖苷酶。如图7A所示，UDG和hAAG糖苷酶在HeLa细胞中的含量大于正常人肾脏上皮细胞293T中的含量，与文献报道的癌细胞中糖苷酶含量异常相符合，因此我们测定了HeLa细胞中两种糖苷酶的含量。如图7B所示，在494nm的激发波长下，荧光强度随着总蛋白浓度的增加而增强，且荧光强度和总蛋白浓度的对数呈线性相关。如图7C所示，在640nm的激发波长下，荧光强度随着总蛋白浓度的增加而增强，且荧光强度和总蛋白浓度的对数呈线性相关。因此，方法能够用于复杂生物样品中的UDG和hAAG糖苷酶活性的检测。
以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。