一种检测miRNA-21的方法
阅读说明：本技术 一种检测miRNA-21的方法 (Method for detecting miRNA-21 ) 是由 王卫 秦力琳 唐凯 混旭 罗细亮 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：一种检测miRNA-21的方法。作为miRNA家族重要的一员,miRNA-21早已作为乳腺癌的肿瘤生物标志物而受到广泛关注。由于其序列短,在细胞中的表达水平低,且与其他家庭成员之间的序列相似度高,临床上对于miRNA-21的高灵敏检测仍然存在一定的难度和挑战。本发明提出了一种新型的基于负载金纳米团簇的金属有机骨架比率型荧光探针,采用比表面积大、孔隙率高的金属有机骨架材料作为载体,通过原位合成法生成金纳米团簇,并将设计合成的双链探针组装到载体表面。利用本发明构建的探针检测miRNA-21,克服了传统方法检测灵敏度低、背景信号高等缺点,解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高等难题,为活体、细胞检测及原位成像提供了新的策略和方法。(A method for detecting miRNA-21. As an important member of the miRNA family, miRNA-21 has been widely noticed as a tumor biomarker of breast cancer. Because of its short sequence, low expression level in cells and high sequence similarity with other family members, there still exists a certain difficulty and challenge in clinical application for highly sensitive detection of miRNA-21. The invention provides a novel metal organic framework ratio type fluorescent probe based on gold nanoclusters, which adopts a metal organic framework material with large specific surface area and high porosity as a carrier, generates the gold nanoclusters through an in-situ synthesis method, and assembles a designed and synthesized double-stranded probe on the surface of the carrier. The probe constructed by the invention is used for detecting miRNA-21, overcomes the defects of low detection sensitivity, high background signal and the like of the traditional method, solves the problems of complex living body and cell imaging technology, high price and the like, and provides a new strategy and method for living body and cell detection and in-situ imaging.)
技术领域
本发明涉及肿瘤生物标志物的检测，具体涉及一种检测乳腺癌细胞中MicroRNA(miRNA)的比率型荧光探针及其制备方法和应用，属于光电化学生物传感分析及生物医学临床诊断领域。
背景技术
微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类存在于真核生物体内大小为18～39bp的内源性非编码单链RNA分子，它能在转录和翻译水平调控基因的表达，在细胞凋亡、肿瘤发生的过程中发挥着重要的调节作用。研究表明，机体miRNA的异常表达与肿瘤的产生与发展高度相关。其中，miRNA-21作为miRNA家族重要的一员早已作为乳腺癌的肿瘤生物标志物而受到广泛关注。乳腺癌作为全球女性癌症的第一大杀手，其致死率居高不下。由于miRNA-21的序列短，在细胞中的表达水平低，且与其他miRNA家庭成员之间的序列相似度高，因此，临床上对于miRNA-21的高灵敏检测仍然存在一定的难度和挑战。现阶段，迫切需要开发出快速、简单、灵敏、特异的miRNA-21检测技术，这对乳腺癌的早期诊断和精准治疗具有重要意义。
传统的miRNA检测技术如RT-qPCR、Northern blotting、RNA测序和微阵列等，普遍存在灵敏度低、分析时间过长、成本高、仪器设备复杂等问题，限制了它们在临床诊断中的实际应用。为了克服传统检测技术的缺点和不足，需要开发出简单、灵敏、特异及准确度高的检测技术最大限度地满足生物医疗领域对乳腺癌的早期诊断及治疗的实际需求。目前，作为传统方法的替代技术，比率型荧光检测技术因具备制备简单、响应迅速、成本低、灵敏度高和定量精确等优点而得到了广泛的研究和应用。
本发明为了克服传统技术检测灵敏度低、分析时间过长、成本高、仪器设备复杂等问题，提出了一种基于负载金纳米团簇(AuNCs)的金属有机骨架(MOFs)比率型荧光探针。本发明选用金属有机骨架材料中最具代表性的UiO-66-NH2作为载体构建比率型荧光探针，因其具有比表面积大，孔隙率高以及表面丰富的易于功能化的氨基基团，保证了在其表面能够负载更多的AuNCs和双链探针分子。所述的双链探针分子由两部分构成：一是修饰有荧光猝灭剂BHQ的DNA1链，二是修饰有荧光染料FAM的DNA2链。两条链通过互补配对形成部分杂交的双链结构，FAM-DNA2链5′端的FAM染料与BHQ-DNA1链3′端的BHQ相互靠近，产生荧光共振能量转移效应(FRET)，使得FAM染料的荧光信号被猝灭。实验通过原位生长法制备了纳米复合材料[email protected]2，在此基础上，通过共价交联的方式将设计、合成的双链探针分子修饰到[email protected]2表面，最终得到基于负载金纳米团簇的金属有机骨架比率型荧光探针。当目标物miRNA-21存在时，修饰有FAM的FAM-DNA2链通过立足点效应与miRNA-21完全互补配对从而与BHQ-DNA1链脱离，导致FAM与BHQ的距离被拉远，FRET效应消失，结果使FAM的荧光信号被点亮，而AuNCs的信号保持不变，因此，通过恢复的FAM荧光信号与AuNCs荧光信号的比值实现了miRNA-21的比率型检测。检测原理见图1所示。同时，本发明提出的探针还可以用于细胞成像。当探针进入细胞后，细胞内的miRNA-21与修饰了FAM的DNA2链互补杂交，并脱离[email protected]2表面，使得被BHQ猝灭的FAM的荧光信号被点亮，最终实现了细胞成像。以MCF-7乳腺癌细胞和L-O2正常肝细胞等为模型证实了该探针区分不同miRNA-21表达细胞的能力，为临床诊断提供了潜在的应用工具。
相比于传统的荧光探针，本发明通过原位生长法合成的[email protected]2，不但保证了参比信号不会受到细胞内复杂环境的影响，大大降低了背景信号；而且有利于通过酰胺化反应的共价交联方式确保双链探针能够进入细胞，最终实现比率型荧光检测/成像的目标。因此，该设计在肿瘤诊断方面和相关生物医学领域具有非常广阔的应用前景。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，针对利用UiO-66-NH2构建基于负载金纳米团簇的金属有机骨架比率型荧光探针的文献还未见报道，因此，本发明的第一目的：提出一种新型的基于负载金纳米团簇的金属有机骨架比率型荧光探针及其应用；本发明的第二目的：提供一种本发明提出的金属有机骨架比率型荧光探针的制备方法；本发明的第三目的：提供一种利用本发明提出的金属有机骨架比率型荧光探针检测miRNA-21的方法。
本发明设计构建的比率型荧光探针采用比表面积大、孔隙率高以及表面富含氨基基团的金属有机骨架材料UiO-66-NH2作为载体，通过原位合成方法在载体的孔隙生成金纳米团簇，在此基础上，将设计合成好的双链探针通过共价交联的方式组装到载体表面。设计、合成的双链探针分子由两部分构成：一是修饰有荧光猝灭剂BHQ的DNA1链，二是修饰有荧光染料FAM的DNA2链。两条链通过互补配对形成部分杂交的双链结构。双链探针的设计重点：1：确保FAM-DNA2链5′端的FAM染料与BHQ-DNA1链3′端的BHQ相互靠近，产生荧光共振能量转移效应，FAM染料的荧光信号被猝灭；2：确保双链探针在靶标miRNA-21出现时，能够与靶标发生竞争反应，借助立足点效应将修饰有荧光染料FAM的DNA2链从探针上竞争下来，导致FAM与BHQ的距离被拉远，FRET效应消失，FAM的荧光信号被点亮，而AuNCs的信号保持不变，从而实现了对miRNA-21的比率型荧光检测。
本发明中，我们选用锆基金属有机骨架材料UiO-66-NH2作为纳米载体，通过原位生长法在其孔隙中合成金纳米团簇，从而构建了[email protected]2纳米复合物。根据文献报道，一般合成方法合成的UiO-66-NH2均为微米级别，很难应用于生物传感和细胞成像。为此，我们在反应体系中引入乙酸进行调控，最终实现了纳米级UiO-66-NH2的合成。实验结果表明，通过原位生长法在UiO-66-NH2的孔隙内部也成功制备了粒径匹配的AuNCs。考虑到FRET效应，同时也为了实现单激发双发射的检测模式，需要确保AuNCs与荧光分子的荧光发射光谱没有重合。因此，本发明最终选择FAM作为双链探针的荧光信号分子，并与合成的AuNCs共同作为本实验中比率型荧光探针的双信号输出。
本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。具体是引入乙酸的调控作用合成了纳米级的UiO-66-NH2，将其作为载体，通过原位生长法在UiO-66-NH2的孔隙内部成功制备粒径匹配的AuNCs。在此基础上，设计合成了双链探针。随后，将设计合成的双链探针通过共价交联的方式组装到复合物[email protected]2的表面，具体是利用双链探针分子上的羧基和[email protected]2表面的氨基反应形成酰胺键实现组装，最终完成负载AuNCs的MOFs比率型荧光探针的构建。设计、合成的双链探针由两部分构成：一是修饰有荧光猝灭剂BHQ的DNA1链，二是修饰有荧光染料FAM的DNA2链。两条链形成部分互补的双链结构。双链探针的设计重点：1：确保FAM-DNA2链5′端的FAM染料与BHQ-DNA1链3′端的BHQ相互靠近，产生荧光共振能量转移效应；2：当靶标miRNA-21存在时，发生立足点效应引发竞争反应，FRET效应消失，FAM的荧光信号被点亮。结果表明，本发明提出的比率型荧光探针能够获得远高于传统技术的灵敏度，最重要的是，该探针具有优异的特异性，且结构简单、生物相容性好、性能稳定、响应时间短，能够方便、快捷地实现细胞内miRNA-21的荧光成像，为活体及细胞成像等应用提供新的方法和技术。
本发明的有益效果：本发明提出的比率型荧光探针，与文献报道的检测方法相比，不但实现了miRNA-21的高灵敏检测，检测限低至0.12nM，而且消除了背景信号的干扰，获得更宽的线性检测范围。更重要的是，该探针通过负载金纳米团簇及双链探针可以成功应用于不同水平的miRNA-21表达细胞的区分，在生物医学及临床诊断领域具有潜在的应用价值。本发明借助FRET效应和立足点效应的共同作用，使检测体系得到优化和改进，实现了单激发双发射的检测技术，克服了传统方法检测灵敏度低、背景信号高等缺点，解决了活体、细胞成像技术复杂、价格居高、灵敏度不足等难题，对活体、细胞检测/成像及其实际应用具有重要意义。
本发明提出的用于检测miRNA-21的比率型荧光探针具有高效、灵敏、性能稳定、结构简单、易制备、生物相容性好、适用范围广等优点，表现出高的特异性和选择性。如图2所示，即使包括miRNA-122、miRNA-155、miRNA-141、miRNA-16和miRNA-26a等在内的其他序列miRNA的浓度(1.0mM)远高于miRNA-21的浓度(100nM)，比率型荧光探针也能够选择性地实现对目标物miRNA-21的高灵敏检测。采用本发明提出的比率型荧光探针检测miRNA-21，不但显示了远高于现有技术的灵敏度和选择性，而且，还获得了更宽的线性检测范围。随着miRNA-21的浓度升高，FAM的荧光信号显著增强。比率型荧光探针的输出信号与miRNA-21的浓度在1.0～80nM范围内呈良好的线性关系，线性方程为y＝0.0156x+1.9973，R2＝0.9985，检测限低至0.12nM。与其他检测方法相比，基于负载AuNCs的MOFs比率型荧光探针用于检测miRNA-21的检测限更低，采用的比率型荧光检测策略显著地消除了背景信号的干扰，增大了检测的浓度范围。
得益于优异的生物相容性，本发明提出的比率型荧光探针还可以实现细胞内miRNA-21的原位成像，很好地解决了传统技术易受其他酶类及生物基质干扰的难题。因此，该方法也为开发高灵敏肿瘤生物标志物的细胞原位成像探针提供了新的途径和策略。
附图说明
图1.检测原理图；
图2.本发明提出的比率型荧光探针对miRNA-21的选择性，采用(F-F0)/FAuNCs作为输出信号(F为探针在521nm的荧光强度，F0为探针在521nm的空白值，FAuNCs为探针在655nm的荧光强度)。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实验仪器：
THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；TDL-40B 4000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂)；TGL-16B 10000转/分离心机(上海安亭科学仪器厂)；SCIEWTZ-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司)；ASAP 2460比表面与孔隙度分析仪(美国，Micromeritics)；动态光散射仪(英国，Malvern)；F-4600型荧光光谱仪(日本，Hitachi)；Leica TCS SP5 II型激光共聚焦显微镜(德国，Leica)。
实验试剂：
氯化锆(ZrCl4)，2-氨基对苯二甲酸(C8H7NO4)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，甲醇(MeOH)，乙酸(CH3COOH)，二甲基亚砜(DMSO)和氢氧化钠(NaOH)从Adamas-beta获得；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O)，牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-aldrich；RPMI-1640培养基，DMEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自Gibco；噻唑蓝(MTT)购自上海碧云天生物技术有限公司；本实验中设计使用的所有DNA，miRNA均从上海生工生物有限公司合成和采购。其他试剂的纯度均为分析纯，符合本实验所需纯度。本实验用水均为去离子水(电阻>18MΩ·cm)。详细的DNA和miRNA序列如下：
表1设计的脱氧核苷酸和核苷酸序列(5′to 3′)
实施例1：
一种制备本发明提出的新型的基于负载金纳米团簇的金属有机骨架比率型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)设计并合成BHQ-DNA1链和FAM-DNA2链，其序列从5'到3'分别为：COOH-TCAGACTGATGTTGAA-BHQ1和6-FAM-ATCAACATCAGTCTGATAAGCTA，其中，DNA1链与DNA2链上由3'端第8个碱基开始的15个碱基互补，而DNA2链则是靶标miRNA-21的互补链+A；
(2)将5.0μL BHQ-DNA1(2.0μM)和等量的FAM-DNA2(2.0μM)混合后进行退火处理，即首先将上述混合液置于90℃的水浴，梯度降温至37℃并保持30min，此时形成所需要的双链探针；
(3)加入10mL去离子水至0.1917g EDC和0.1151g NHS的混合物中，取10μL该溶液与等量的双链探针混匀，37℃水浴1h；
(4)随后加入80μL的复合物[email protected]2(0.2mg/mL)，37℃搅拌过夜，最终获得比率型荧光探针；
其中，所述的复合物[email protected]2(0.2mg/mL)的制备方法，包括如下步骤：
(1)在20mLDMF和乙酸的混合液中，分别加入0.164g ZrCl4和0.127g 2-氨基对苯二甲酸，置于含有内衬的高压反应釜中密封，放置在烘箱中加热24h；
(2)反应结束后冷却至室温，8000rpm的转速离心10min，并用DMF和MeOH的混合液分散沉淀，继续离心，随后在100℃真空下加热12h，得到UiO-66-NH2纳米颗粒；
(3)将5.0mL的UiO-66-NH2(50mg/mL)乙醇溶液、5.0mL HAuCl4(20mM)和5.0mL的BSA溶液(50mg/mL)混合，在800rpm的转速下搅拌30min，加入500μL氢氧化钠(1.0M)溶液，保持溶液50℃剧烈搅拌3h；
(4)通过冷冻干燥收集粉末产品[email protected]2，并将其配置成0.2mg/mL的水溶液用于后续实验。
实施例2:
一种利用本发明提出的金属有机骨架比率型荧光探针检测miRNA-21的方法，包括如下步骤：
(1)将不同浓度的miRNA-21(0、1.0、2.0、5.0、10、20、40、60、80、100、120、140nM)分别加入到100μL比率型荧光探针(0.2mg/mL)溶液中；
(2)37℃孵育20min后，采用F-4600型荧光光谱仪进行检测，具体检测条件以488nm作为单一激发波长，分别检测521nm处FAM的荧光强度以及655nm处AuNCs的荧光强度，狭缝宽度5.0nm；
(3)采用(F-F0)/FAuNCs作为输出信号，F为探针在521nm处的荧光强度，F0为521nm处的空白值，FAuNCs为探针在655nm的荧光强度。
实验结果表明，随着miRNA-21浓度升高，FAM的荧光信号显著增强，比率型荧光探针的输出信号(F-F0)/FAuNCs与miRNA-21的浓度在1.0～80nM范围内呈现良好的线性关系，线性方程为y＝0.0156x+1.9973，R2＝0.9985，检测限低至0.12nM。与其他检测方法相比，基于负载AuNCs的MOFs比率型荧光探针用于检测miRNA-21的检测限更低，选择性更高，即使包括miRNA-122、miRNA-155、miRNA-141、miRNA-16和miRNA-26a等在内的其他序列miRNA的浓度(1.0mM)远高于miRNA-21的浓度(100nM)，比率型荧光探针也能够选择性地实现对目标物miRNA-21的高灵敏检测。因此，采用本发明提出的比率型荧光检测策略检测miRNA-21，显著地消除了背景信号的干扰，不但获得远高于现有技术的灵敏度和选择性，而且，还获得了更宽的线性检测范围。
实施例3:
(1)选择miRNA-21高表达的人乳腺癌MCF-7细胞作为原位成像的细胞模型，将MCF-7细胞分成2组，1组与100μL比率型荧光探针(0.2mg/mL)在37℃、5％CO2中共同孵育2h，另一组不做任何处理，作为空白对照；
(2)随后用PBS缓冲液洗涤，采用激光共聚焦显微镜分别对2组细胞进行荧光成像，选择激发波长：488nm；
实验结果表明，当比率型荧光探针进入MCF-7细胞后，细胞内的miRNA-21与探针反应，使得FAM染料的荧光信号恢复，而AuNCs的荧光信号基本保持不变；未经处理的MCF-7细胞内并无荧光信号的产生，一方面说明MCF-7细胞没有自发地荧光信号产生，另一方面证实比率型荧光探针能够实现细胞内miRNA-21的原位成像。因此，采用本发明的荧光探针能够特异、灵敏地实现细胞内miRNA-21的原位荧光成像。
实施例4:
(1)选择人乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞HeLa和人正常肝细胞L-O2三种类型的人类细胞为模型，验证比率型荧光探针区分不同miRNA-21表达细胞的能力，在相同条件下，将3组细胞分别与100μL比率型荧光探针(0.2mg/mL)在37℃、5％CO2中孵育2h；
(2)随后用PBS缓冲液洗涤，采用激光共聚焦显微镜分别对3组细胞进行荧光成像，选择激发波长：488nm；
实验结果表明，在所有3种不同miRNA-21表达水平的细胞中，都观察到了AuNCs的荧光信号，表明探针全都正常进入细胞，而FAM的荧光信号只出现在2种癌细胞中，即MCF-7细胞和HeLa细胞，但强度不同，miRNA-21高表达的乳腺癌细胞MCF-7中的荧光信号明显高于宫颈癌细胞HeLa。在人正常肝细胞L-O2中仅发现了AuNCs的荧光信号，FAM的荧光信号几乎没有，这与文献报道的miRNA-21在L-O2细胞中处于低表达相符。因此，证实了本发明比率型荧光探针具有区分miRNA-21不同表达的细胞的能力。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 一种检测miRNA-21的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcagactgat gttgaa 16
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcaacatca gtctgataag cta 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22