阅读说明：本技术 一种橄榄叶中苦苷和羟基酪醇含量的快速检测方法 (Method for rapidly detecting content of picroside and hydroxytyrosol in olive leaves ) 是由 冯士令 丁春邦 陈涛 周莉君 张春艳 李天� 袁明 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种橄榄叶中苦苷和羟基酪醇含量的快速检测方法,通过将橄榄叶粉末与甲醇的水溶液混合提取,离心取上清液过滤备用,确定流动相和梯度洗脱程序,将待测样品液体进样,设定检测条件,与标准品进行比较而获得的提取物中羟基酪醇和苦苷的含量。本发明方法检测不同储存和干燥条件下橄榄叶中苦苷和羟基酪醇重复性好,稳定性强,且ZORBAX SB-C18反相色谱柱低成本具有实验室通用性,可以广泛推广使用。(The invention discloses a method for rapidly detecting the contents of picroside and hydroxytyrosol in olive leaves. The method disclosed by the invention has the advantages that the repeatability and the stability of detecting the picroside and the hydroxytyrosol in the olive leaves under different storage and drying conditions are good, the ZORBAX SB-C18 reversed phase chromatographic column is low in cost, has the laboratory universality, and can be widely popularized and used.)

一种橄榄叶中苦苷和羟基酪醇含量的快速检测方法

技术领域

本发明属于天然物检测技术领域，具体涉及一种橄榄叶中苦苷和羟基酪醇含量的快速检测方法。

背景技术

油橄榄(Olea europaeaL.)作为一种经济作物，起初主要种植在地中海沿岸的希腊、意大利等国，后引入我国，主要分布在云南、四川、甘肃、贵州等地。橄榄叶是橄榄种植业的主要副产品，每年在修剪和收获水果时都会被丢弃。这不仅污染环境，还会造成资源的严重浪费。因此，对油橄榄叶进行综合利用开发，是十分必要的。

油橄榄叶中活性物质主要有多酚类、黄酮类、裂环烯醚萜类、双黄酮等，其中橄榄苦苷(Oleuropein，OLE)和羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)是两种主要的多酚类化合物。根据文献报道，橄榄苦苷和羟基酪醇具有良好的抗氧化作用，可以有效的清除自由基，被认为是天然的抗氧剂之一。此外，橄榄苦苷还具有抗真菌、抗病毒、抗癌和降血糖的作用；羟基酪醇具有预防动脉硬化、高血压、脑溢血，降血压、抗癌防癌等作用。因此，含有橄榄苦苷和羟基酪醇的提取物有望成为保健品、药品、化妆品的新原料。

橄榄苦苷和羟基酪醇具有广泛的药理活性，是鲜橄榄叶中酚类化合物，但因羟基酪醇含量少，二者很难被HPLC方法高效检测。目前，常见HPLC方法中流动相组成为两种或三种，梯度洗脱程序复杂，检测时间长。因此，提供一种时间短、稳定性强的检测方法非常具有必要性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种橄榄叶中苦苷和羟基酪醇含量的快速检测方法，该方法在HPLC检测技术上进行优化，新的优化HPLC检测方法流动相成分改为(水和乙腈)，缩短总检测时间仅为35min，且羟基酪醇周围无杂峰出现。该方法检测不同储存和干燥条件下橄榄叶中橄榄苦苷和羟基酪醇重复性好，稳定性强，且ZORBAXSB-C18反相色谱柱低成本具有实验室通用性，可以广泛推广使用。

本发明的技术目的具体通过以下技术方案实现：

一种橄榄叶中苦苷和羟基酪醇含量的快速检测方法，通过将橄榄叶粉末与甲醇的水溶液混合提取，离心取上清液过滤备用，确定流动相和梯度洗脱程序，将待测样品液体进样，设定检测条件，与标准品进行比较而获得的提取物中羟基酪醇和苦苷的含量。

所述的甲醇的水溶液中甲醇的体积浓度为78％。

所述的橄榄叶粉末与甲醇水溶液的质量体积比为1:50g/mL。

所述的流动相为水(A)-乙腈(B)，所述的梯度洗脱程序为：0-10min，90％A-10％B；14-15min，80％A-20％B；30min，90％A-10％B。

所述的检测条件为：流速0.8mL/min，色谱柱为ZORBAXSB-C18，柱温30℃，进样量为10μL，检测波长为280nm。

本发明的有益效果为：

1)羟基酪醇的得出峰时间为29.3min，与其他方法相比时间至少缩短了10min。

2)橄榄叶中羟基酪醇含量低，且受储存和干燥条件影响容易降解，不能被HPLC检测到。该方法不仅同时检测到不同储备条件下(-20℃、4℃及室温)羟基酪醇和橄榄苦苷信号，也能检测到不同干燥条件(冻干、常温晾干、70℃)下二者信号，说明该方法灵敏度高，稳定性强。

3)该方法用的ZORBAXSB-C18反相色谱柱低成本，具有广泛性。

附图说明

图1是羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)标准品在280nm处的HPLC色谱图；

图2是橄榄叶样品羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)在254、260和280nm处的HPLC色谱图；

图3是-20℃条件下羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)的色谱图；

图4是4℃条件下羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)的色谱图；

图5是室温条件下羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)的色谱图；

图6是冻干条件下羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)的色谱图；

图7是常温干燥条件下羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)的色谱图；

图8是70℃干燥条件下羟基酪醇(HT)和橄榄苦苷(OLE)的色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

0.1g橄榄叶粉末与5mL甲醇水溶液(78％，v/v)混合，在37℃下提取20min，然后4000rpm离心4min，上清液经0.45-μm微孔过滤，用于HPLC检测。流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0-10min，90％A-10％B；14-15min80％A-20％B；30min，90％A-10％B。流速0.8mL/min，色谱柱为ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm×5.0μm)，柱温30℃，进样量为10μL，检测波长为280nm。橄榄叶提取物中的羟基酪醇和橄榄苦苷的鉴定是通过将保留时间和UV/VIS光谱与标准品进行比较而获得的。使用Agilent OpenLAB CDS ChemStation版软件分析数据。结果如图2所示和表1所示。

表1.橄榄叶中羟基酪醇和橄榄苦苷在280nm处分析结果

目前，常见的羟基酪醇和橄榄苦苷的HPLC检测方法是利用流动相的多元组合，例如水、甲醇、乙腈、异丙醇、磷酸、甲酸、乙酸或乙酸钠，选择其中两种或三种溶剂以适当的比例，进行多元梯度洗脱，橄榄苦苷出峰时间超过40min。在这套方法中，建立了水-乙腈的二元色谱分离的新方法，羟基酪醇和橄榄苦苷的出峰时间分别为4.8和29.3min，使橄榄苦苷出峰时间缩短了至少10min，同时该方法也能能检测到微量羟基酪醇信号，灵敏度较其他方法高。

新检测方法在常规检测的基础上减少了移动相的溶剂，简化分析条件，缩短总检测时间同时可以检测到微量羟基酪醇的信号，此外，实例中用到的ZORBAX SB-C18反相色谱柱是通用分析柱，低成本，具有普遍性。

实施例2

采用实施例1相同的实验方法检测橄榄叶中羟基酪醇和橄榄苦苷在不同储备和干燥条件下的信号。

结果如图3～8所示，该方法不仅同时检测到不同储备条件下(-20℃、4℃及室温)羟基酪醇和橄榄苦苷信号，也能检测到不同干燥条件(冻干、常温晾干、70℃)下二者信号，说明该方法灵敏度高，稳定性强。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。