阅读说明：本技术 一种金枪鱼肽、其提取方法及作为降压剂的应用 (Tuna peptide, extraction method thereof and application of tuna peptide as antihypertensive agent ) 是由 方诩 韩丽娟 贾洋洋 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种金枪鱼肽、其提取方法及作为降压剂的应用。金枪鱼肽是一种具有良好的保健效果的成分,从金枪鱼加工产品的下脚料中提取金枪鱼肽是一种具有显著经济意义的资源利用方式。传统制备方法提取的金枪鱼肽往往伴随纯度、感官不良等缺陷。本发明提供了一种同时采用微生物和复合蛋白酶进行发酵和酶解的处理方法,将多肽充分的从金枪鱼生产的下脚料蛋白酶解液中充分的释放,增加提取效率,同时结合树脂吸附,同时具有无腥味、环境友好、提取率高,纯度高等优点。(The invention particularly relates to tuna peptide, an extraction method thereof and application of the tuna peptide as a blood pressure reducing agent. Tuna peptide is a component with good health care effect, and extraction of the tuna peptide from leftovers of processed products of the tuna is a resource utilization mode with remarkable economic significance. Tuna peptide extracted by the traditional preparation method is often accompanied with the defects of poor purity, poor sense and the like. The invention provides a treatment method for fermentation and enzymolysis by simultaneously adopting microorganisms and compound protease, which sufficiently releases polypeptide from leftover protein enzymolysis liquid produced by tuna, increases the extraction efficiency, is combined with resin adsorption, and has the advantages of no fishy smell, environmental friendliness, high extraction rate, high purity and the like.)

一种金枪鱼肽、其提取方法及作为降压剂的应用

技术领域

本发明属于蛋白多肽提取方法技术领域，具体涉及一种金枪鱼肽、所述金枪鱼肽的提取方法及作为降压活性成分在制备降压制剂中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

黄鳍金枪鱼背部肌肉粗蛋白含量为26.2％。脂肪含量仅0.2％，是高蛋白、低脂肪的健康食品；根据1973年FAO/WHO推荐的必需氨基酸需要量模式(成人模式)对黄鳍金枪鱼背部肌肉蛋白进行评价，背部肌肉中呈味氨基酸占氨基酸总量的41.31％且含有丰富的矿物元素，如钾、磷、钠、镁、钙、锌、硒等。黄鳍金枪鱼背部肌肉是营养丰富、味道鲜美的优质原料。

目前，金枪鱼的销售模式主要有鲜销，加工为罐头，调味品等食品。但是在金枪鱼的深加工过程中往往会产生大量的如鱼头、内脏、鱼皮等高蛋白下脚料，从而造成资源的浪费。因此，这些高蛋白下脚料的充分利用既有利于资源的再利用，同时会一定程度上增加企业的利润。

现有研究表明，金枪鱼肽具有很好的保健，如减少血液中的脂肪，提高肝脏细胞的再生能力；金枪鱼体内的鹅肌肽具有分解乳酸、加快尿酸排出的功效，有望应用于痛风患者。因此，利用金枪鱼下脚料生产多肽成为了一种较好的资源利用的方式。

目前，金枪鱼肽的提取方法主要有酶解工艺，结合离心、醇沉的方法得到肽的粗提取物。但是发明人认为，现有提取方法得到的金枪鱼肽纯度不理想，往往伴随腥味，增加了后续处理难度，严重影响市场价值。

发明内容

针对上述研究背景，本发明提供了一种优化的金枪鱼肽提取方法，采用该方法提取得到的金枪鱼肽属于小分子肽，且纯度较高、没有异味，后续加工的难度低，是一种高经济价值的产品。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种金枪鱼肽的提取方法，所述提取方法包括向金枪鱼中加入复合蛋白酶及微生物同时进行发酵和酶解得到吸收液，所述吸收液经纯化制备所述金枪鱼肽。

本发明提供提取方法，优选的技术方案中，通过树脂进行纯化。依据本发明研究发现，将复合蛋白酶与微生物共同加入金枪鱼中同时进行发酵和酶解，这种方式制备得到的金枪鱼提取物能够有效的消除异味，并且金枪鱼肽分子量显著降低，后续树脂纯化难度也相对降低。该方法得到的金枪鱼肽克服了现有产品存在异味、纯度低的缺陷，经验证，该产品还具有良好的降血压活性，应用于临床药物或保健品有望具有良好的效果。

本发明第二方面，提供第一方面所述金枪鱼肽的提取方法制备的金枪鱼肽。

本发明第三方面，提供第二方面所述金枪鱼肽作为降压剂的应用。

经本发明研究证明，所述金枪鱼肽具有良好的ACE抑制活性，有望作为一种降压活性成分配合辅料或与其他降压活性成分联合应用于药物、保健品的制备。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

上述研究结果首次提供了一种同时采用复合蛋白酶及微生物对金枪鱼原料进行发酵和酶解的制备方式，该培养方式能够使金枪鱼肽从原料中充分的溶出，具有良好的回收效率，并且制备得到的金枪鱼肽纯度高、没有不良气味，市场价值更高。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种金枪鱼肽的提取方法、该提取方法制备的金枪鱼肽及应用。

本发明第一方面，提供一种金枪鱼肽的提取方法，所述提取方法包括向金枪鱼中加入复合蛋白酶及微生物同时进行发酵和酶解得到吸收液，所述吸收液经纯化制备所述金枪鱼肽。

优选的，所述金枪鱼肽提取方法具体包括以下步骤：

(1)向金枪鱼中加水进行匀浆得到匀浆液；

(2)采用培养液稀释匀浆液至固形物浓度为8～12％，加入复合蛋白酶，同时接种微生物进行发酵和酶解得到酶解液；

(3)将酶解液灭菌离心得到吸收液，将吸收液通过树脂纯化得到金枪鱼肽洗脱液，通过浓缩干燥所述金枪鱼肽。

步骤(1)中，进一步优选的，金枪鱼为金枪鱼肉或金枪鱼加工过程中的下脚料，具体包括鱼头、内脏、鱼皮等高蛋白下脚料。

进一步优选的，所述匀浆时间为0.8～1.2小时。

步骤(2)中，进一步优选的，所述培养液为微生物培养所需的培养液；具体的，为葡萄糖培养液。

进一步优选的，所述复合蛋白酶为食品加工领域常用添加物质，为用于水解动植物蛋白的蛋白酶，更进一步的，为中性以及酸性蛋白酶。本发明采用的复合蛋白酶为常见蛋白酶的复合产品，例如，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或其他菌株发酵所得到的蛋白酶，研究过程中发现，所述复合蛋白酶采用市售产品即可，中性至酸性条件下使用的复合蛋白酶均可满足生产需求。

进一步优选的，所述复合蛋白酶的浓度为2-5％(质量分数)。

进一步优选的，所述微生物为产蛋白酶的细菌；在一种具体的实施方式中，所述微生物为热带假丝酵母菌。

进一步优选的，所述发酵、酶解时间为44～50h。

进一步优选的，所述发酵、酶解温度为25℃-35℃。

进一步优选的，所述灭菌时间为10～60min。

进一步优选的，所述离心参数为5000-9000rpm，离心15-20min。

步骤(3)中，进一步优选的，所述树脂为大孔吸附树脂。

进一步优选的，所述树脂上样量与树脂等重。

进一步优选的，所述洗脱液量为树脂重的6～7倍量。

进一步优选的，所述洗脱流速控制在每小时1～1.2个柱床体积。

进一步优选的，所述洗脱液为30％-75％的乙醇溶液洗脱。

本发明研究发现，当洗脱液浓度处于上述浓度范围内时，可以保持较高的洗脱回收率，当浓度达到75％时，洗脱回收率最高；当乙醇浓度进一步升高之后，洗脱效率反而开始降低。

进一步优选的，采用浓度75％的乙醇溶液对树脂中的金枪鱼肽进行解吸附。

进一步优选的，所述浓缩采用真空减压浓缩，浓缩温度≤80℃，浓缩真空度≤-0.08Mpa。

进一步优选的，所述浓缩至浓膏比重1.1～1.15，然后进行喷雾干燥，即得金枪鱼肽。

本发明第二方面，提供第一方面所述金枪鱼肽的提取方法或得到金枪鱼肽。

本发明第三方面，提供第二方面所述金枪鱼肽作为降压剂的应用。

所述金枪鱼肽作为降压剂的应用包括将金枪鱼肽作为降血压活性成分应用于制备降压产品，优选的，所述应用方式包括将金枪鱼肽作为活性成分与辅助成分共同用于制备降血压产品，还包括将金枪鱼肽与其他具有降压作用、或辅助降压作用的成分共同用于制备降压产品。

进一步优选的，所述降压产品包括降血压药物、降血压保健品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1)原料匀浆破碎：用清水清洗金枪鱼，去除内脏及泥沙，然后加入一定量的蒸馏水并搅拌均匀，高压匀浆机处理1小时，得到匀浆液。

2)发酵及酶解：用培养液稀释成10％的固形物浓度，向匀浆液中加入5％的复合蛋白酶，同时接种热带假丝酵母(10％)在30℃条件下发酵酶解72h。

3)离心及高温灭菌：将上述所得的溶液高温灭菌10-60min，冷却后9000rpm离心15-20min。

4)树脂吸附精制：将浓缩的吸收液上到装有大孔吸附树脂的柱子上，上样量为树脂重量等量的吸收液；上样流速控制在每小时2个柱床体积；用质量分数15％的乙醇解析树脂吸附的金枪鱼肽有效成分，洗脱液量为树脂重的6～7倍量，洗脱流速控制在每小时1～1.2个柱床体积，收集得到金枪鱼肽洗脱液。

5)浓缩干燥：将得到的精制液进行真空减压浓缩，浓缩温度≤80℃，浓缩真空度≤-0.08Mpa，浓缩至浓膏比重1.1～1.15，然后进行喷雾干燥，即得金枪鱼肽。

实施例2

1)原料匀浆破碎：用清水清洗金枪鱼，去除内脏及泥沙，然后加入一定量的蒸馏水并搅拌均匀，高压匀浆机处理1小时，得到匀浆液。

2)发酵及酶解：用培养液稀释成8％的固形物浓度，向匀浆液中加入3％的复合蛋白酶，同时接种热带假丝酵母在35℃条件下发酵酶解48h。

3)离心及高温灭菌：将上述所得的溶液高温灭菌10-60min，冷却后6000离心15-20min。

4)树脂吸附精制：将浓缩的吸收液上到装有大孔吸附树脂的柱子上，上样量为树脂重量等量的吸收液；上样流速控制在每小时2个柱床体积；用质量分数0％的乙醇解析树脂吸附的金枪鱼肽有效成分，洗脱液量为树脂重的6～7倍量，洗脱流速控制在每小时1～1.2个柱床体积，收集得到金枪鱼肽洗脱液。

5)浓缩干燥：将得到的精制液进行真空减压浓缩，浓缩温度≤80℃，浓缩真空度≤-0.08Mpa，浓缩至浓膏比重1.1～1.15，然后进行喷雾干燥，即得金枪鱼肽。

实施例3

1)原料匀浆破碎：用清水清洗金枪鱼，去除内脏及泥沙，然后加入一定量的蒸馏水并搅拌均匀，高压匀浆机处理1小时，得到匀浆液。

2)发酵及酶解：用培养液稀释成15％的固形物浓度，向匀浆液中加入2％的复合蛋白酶，同时接种热带假丝酵母在25℃条件下发酵酶解120h。

3)离心及高温灭菌：将上述所得的溶液高温灭菌10-60min，冷却后5000-9000rpm离心15-20min。

4)树脂吸附精制：将浓缩的吸收液上到装有大孔吸附树脂的柱子上，上样量为树脂重量等量的吸收液；上样流速控制在每小时2个柱床体积；用质量分数30％的乙醇解析树脂吸附的金枪鱼肽有效成分，洗脱液量为树脂重的6～7倍量，洗脱流速控制在每小时1～1.2个柱床体积，收集得到金枪鱼肽洗脱液。

5)浓缩干燥：将得到的精制液进行真空减压浓缩，浓缩温度≤80℃，浓缩真空度≤-0.08Mpa，浓缩至浓膏比重1.1～1.15，然后进行喷雾干燥，即得金枪鱼肽。

实施例4

1)原料匀浆破碎：用清水清洗金枪鱼，去除内脏及泥沙，然后加入一定量的蒸馏水并搅拌均匀，高压匀浆机处理2小时，得到匀浆液。

2)蛋白酶酶解：向匀浆液中加入5％中性蛋白酶和复合蛋白酶，在30℃条件下酶解8h得酶解液，其中中性蛋白酶和复合蛋白酶的质量比为3：1，反应pH为5-8。

3)沸水浴5-15灭活酶。

4)将所得的溶液5000rpm/min离心，取上清。

5)浓缩干燥：将得到的上清进行真空减压浓缩，即得金枪鱼肽。

采用凯氏定氮法对上述实施例中制备得到的金枪鱼肽纯度进行测定，测定方式如下：采用15％三氯醋酸溶液将样品中大分子蛋白完全沉淀，同时小分子肽保留在该溶液中，除去蛋白质沉淀，上清液按照GB/T5009.5-2003规定的方法测定总氮含量。所述纯度＝小分子肽/凯氏定氮测得的总量×100％。

实施例1-4中制备方的回收率及得到的金枪鱼肽效果如下表1所示：

表1金枪鱼肽实验结果

实施例5 ACE抑制率实验

本实施例中，采用ACE的抑制率作为降压的指标。紫外分光光度法参照Cushmand(1971)和经Toriki(1993)改进的方法检测金枪鱼肽下脚料回收得到的小分子肽的ACE抑制率。

量取0.25mL反应液(K₃PO₄ 100mmol/L,pH 8.3；NaCl 300mmol/L；马脲酰组氨酰亮氨酸(HHL)5mmol/L)加入到试管中,依次加入1mL样品溶液(对照组加双蒸水),0.15mL ACE溶液(5mmol/L)于反应液中,37℃水浴保温30min。加入1mol/L的HCl 0.25mL,充分搅拌以终止反应。加入1.5mL乙酸乙酯,充分搅拌萃取反应生成的马尿酸,收集上清液。将上清液于100℃水浴加热约20min,以蒸发掉乙酸乙酯,然后加入3mL蒸馏水,充分振荡,228nm下测其吸光值。根据各酶解液反应值与空白样品对照,计算所得样品的ACE抑制率。计算公式为:

ACE抑制率(％)＝[(A–Acontrol)/A]×100％式中,A为添加1mL样品时的吸光值；Acontrol为1mL，蒸馏水代替1mL样品时的吸光值。

表2制备小分子肽对ACE的抑制率即降压效果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。