阅读说明：本技术 一种用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除方法 (Antibacterial activity removing method for rifampicin capsule microorganism limit control bacteria inspection ) 是由 刘彩香 胡建航 何遵卫 刘静 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除方法,具体包括S1、在45℃的含有浓度为5～15％的甲醇或者0.1mol/L硫代硫酸钠的pH5.8～6.5的磷酸盐缓冲液中加入供试品,使供试品浓度为0.1g/mL；S2、保温45℃,30分钟充分溶解取上清液,即得去除抗菌活性的供试液,使得去除活性后的利福平胶囊供试液能够很好地适用于微生物限度控制菌检查。步骤S2中还可以另行加入离心搅拌的过程,能够使去除利福平药物抑菌活性的效果更好。(The invention discloses an antibacterial activity removing method for rifampicin capsule microorganism limit control bacteria inspection, which specifically comprises the steps of S1, adding a test sample into a phosphate buffer solution with the concentration of 5-15% of methanol or 0.1mol/L sodium thiosulfate and the pH value of 5.8-6.5 at 45 ℃ to ensure that the concentration of the test sample is 0.1 g/mL; s2, keeping the temperature at 45 ℃, fully dissolving the mixture for 30 minutes and taking the supernatant to obtain the test solution without the antibacterial activity, so that the rifampicin capsule test solution without the activity can be well suitable for the microbial limit control bacteria examination. In step S2, a centrifugal stirring process may be added to improve the effect of removing the bacteriostatic activity of rifampicin.)

一种用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除 方法

技术领域

本发明属于微生物限度检查领域，特别是一种用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除方法。

背景技术

微生物限度检查是检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括微生物计数(细菌数、霉菌数、酵母菌数)及控制菌检查。

利福平是一种所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，一般为胶囊或者片剂口服药，主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染，外用可治疗沙眼等。利福平作为一种非无菌产品，需要对其进行微生物限度检测。由于利福平本身存在抗菌活性，在制备供试品进行微生物限度控制菌检测时，需要先进行抗菌活性的去除或灭活，然而现有的《中华人民共和国药典(2015年版)》(以下简称中国药典)的通则1106“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”中，仅仅公开了常见干扰物的中和剂和灭活方法，但并未就具体某种药物如何灭活进行讨论。

利福平胶囊属于一种膜剂供试品，现有文献中，例如眼用利福平微生物限度检查法的验证(王蕾，仇其原，2009；26)和滴眼用利福平微生物限度检查方法的建立(赵雪卫、王红然，2013，06)虽然公开了滴眼用利福平微生物限度检查方法，但是文中并未提供利福平抗菌活性的去除或灭活的方法，而采用中国药典及其他已公开的现有技术也不能满足对利福平胶囊供试液抗菌活性进行去除或灭活的要求，从而影响微生物限度检测精度。因此，需要针对利福平药物专门研究一种能够满足要求的灭活方法。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除方法，通过选择特定的磷酸盐缓冲液，有效实现了利福平胶囊的抑菌灭活。具体通过以下技术实现。

一种用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除方法，包括以下步骤：

S1、在含有浓度为5～15％的甲醇或者0.1mol/L硫代硫酸钠的pH5.8～6.5的磷酸盐缓冲液中加入供试品，使供试品浓度为0.1g/mL；

S2、保温，充分溶解取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

采用上述方法制备的供试液，接种大肠埃希菌(即大肠杆菌)通过采用薄膜过滤法，然后将滤膜转移至培养基中进行培养，最终偶然发现运用含有5～15％的甲醇的pH5.8～6.5的磷酸盐缓冲液时，经过18～24h培养基中有菌生长，运用含有0.1mol/L硫代硫酸钠的pH5.8～6.5的磷酸盐缓冲液时，经过48h培养基中有菌生长。最后经鉴定，确认生长的菌为接种时加入的大肠埃希菌。加入的甲醇或硫代硫酸钠浓度，以及磷酸盐缓冲液的pH值对检测出细菌生长所经历的时间长短有显著的影响。

优选地，步骤S1中，甲醇的浓度为10％。该浓度为最佳值。

优选地，步骤S1中：磷酸盐缓冲液的pH值为6.0。该pH值为磷酸盐缓冲液的最佳值。

当甲醇的浓度为10％，磷酸盐缓冲液的pH值为6.0时，采用上述方法只需要18h就能观测到有细菌生长，且经验证即为接种的大肠埃希菌。

优选地，步骤S2还包括离心过程，步骤S2具体为：保温，充分溶解，经400～700r/min，离心4～8min，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。利用离心作用，更好的去除残留抗菌活性成分，能够使供试液纯度更高，最终检测到有细菌生长所花时间只要16h。

优选地，步骤S1、S2中液体温度均为45℃。优选地，步骤S2中，充分溶解的时间为30min。

更优选地，步骤S2中，离心的转速为500r/min。

更优选地，步骤S2中，离心的时间为5min。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

1、针对药物利福平胶囊，提供了一种能够有效实现抑菌活性去除灭活的方法，并经过验证，确认了灭活的有效性和对微生物无毒性；

2、为利福平胶囊类的药品提供了微生物限度控制菌检查方法的直接指导，在现有《中国药典》(2015年版)的基础上方便检测人员的理解，提供了有效的参考方案。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的含有浓度为10％的甲醇的pH6.0的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

实施例2

本实施例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤S1的磷酸盐缓冲液中甲醇浓度为15％。

实施例3

本实施例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，与实施例1基本相同，不同之处在于，步骤S1的磷酸盐缓冲液中甲醇浓度为5％。

实施例4

本实施例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，与实施例1基本相同，不同之处在于，将步骤S1的磷酸盐缓冲液中10％的甲醇替换为浓度为0.1mol/L的硫代硫酸钠。

实施例5

本实施例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的含有浓度为10％的甲醇的pH6.0的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解，经500r/min，离心5min，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

实施例6

本实施例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的含有浓度为10％的甲醇的pH6.0的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解，经400r/min，离心8min，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

实施例7

本实施例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的含有浓度为10％的甲醇的pH6.0的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解，经700r/min，离心4min，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

对比例1

本对比例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的pH7.0的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

对比例2-6

本对比例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的pH7.0的含有特定浓度的某物质的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

对比例2-6所述特定浓度的某物质分别为：20％乙醇，或10％乙醇，或5％乙醇，或0.1mol/L硫代硫酸钠，或10％甲醇。

对比例7

本对比例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的pH6.0的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

对比例8-10

本对比例所提供的用于利福平胶囊微生物限度控制菌检查的抗菌活性去除的方法，包括以下步骤：

S1、取供试品10g，加入45℃的pH6.0的含有特定浓度的某物质的磷酸盐缓冲液至100mL，制成供试液；

S2、保温45℃，30分钟充分溶解，取上清液，即得去除抗菌活性的供试液。

对比例8-10的所述特定浓度的某物质分别为：20％乙醇，或10％乙醇，或5％乙醇。应用例1：按照实施例和对比例的方法进行验证(以大肠埃希氏菌为例)

基于《中国药典》1106公开的控制菌检查法，以大肠埃希氏菌为判断标准，采用薄膜过滤法进行控制菌检查，以验证最终结果所得到的菌落是否为大肠埃希氏菌。具体方法如下：

P1、按照实施例和对比例的方法制备供试液；

P2、取上述供试液10mL，取上述上清液10mL，按5：5比例分为2个膜，滤膜孔径为0.45μm，直径为50mm；分别加入100mL不超过45℃的冲洗液冲洗薄膜，按薄膜过滤法将薄膜的菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基中，培养，检测是否产生菌落，并记录产生菌落的时间。

所用的冲洗液为各实施例和对比例的步骤S1中用于溶解供试品的缓冲液，即冲洗液与供试液相比，仅缺少了供试品(利福平胶囊)。

经过培养，采用实施例1制备的供试液及上述方法，最终在培养后18h发现有菌生长，采用实施例2、3制备的供试液及上述方法，最终在培养后约20h发现有菌生长，采用实施例4制备的供试液及上述方法，最终在培养后约48h发现有菌生长，说明实施例1-4的供试液已经有效去除了利福平的抗菌活性；采用实施例5制备的供试液及上述方法，最终在培养后16h发现有菌生长，采用实施例6、7制备的供试液及上述方法，最终在培养后约17h发现有菌生长，说明在制备供试液时步骤S2中加入搅拌离心过程，能够使去除利福平抗菌活性的效果更好。

而对比例1、2-6、7制备的供试液按照上述方法被截留在滤膜上，即不能实现薄膜过滤，无法完成测定控制菌等后续步骤，而中国药典中严格限定了滤膜的孔径，不能选用更大孔径的滤膜。对比例8-10制备的供试液按照上述方法能够实现过滤，但是均未发现细菌生长。

综上可知，只有选用本发明的pH值为5.8～6.5的含有浓度为5～15％的甲醇或者0.1mol/L硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲液，才能有效实现利福平药物抗菌活性的去除。

应用例2：取采用实施例5的方法制备的供试液进行微生物限度检测的控制菌检查结果验证(以大肠埃希菌为例)

1、供试液制备

取供试品10g，加入不超过45℃的pH6.0磷酸盐缓冲液(0.1mol/L磷酸氢二钠溶液6000mL，加盐酸约40mL，调节pH值至6.0±0.05)至100mL，制成供试液，保温不超过45℃，30min充分溶解，经500转/分，离心5min后取上清液。

2、大肠埃希菌检查方法适用性试验(采用薄膜过滤法)

(1)增菌培养：选择实施例2制备的供试液；按3：3：4比例分为三个膜，分别加入100mL不超过45℃的含浓度10％的甲醇的pH6.0磷酸盐缓冲液中，并以此缓冲液(即45℃的含浓度10％的甲醇的pH6.0磷酸盐缓冲液)作为冲洗液冲洗薄膜。每个膜总冲洗量为800mL，每次冲洗量为100mL，在最后一次的冲洗液中加入菌液，按供试液比例共加入不大于100cfu的大肠埃希菌，取出滤膜转移至100mL胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30℃-35℃培养18h。

(2)选择和分离培养：取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，43℃培养24h，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，35℃培养18h。

(3)阴性对照试验：取稀释剂10mL，不加试验菌液，同供试液操作。

3、验证结果：本应用例的验证结果为，阴性对照试验无菌生长；试验组在规定的温度和最短时间下培养，选择性培养基平板上有典型菌落生长。经鉴定、确证为所加试验菌(大肠埃希菌)，说明建立的方法适用于该品种大肠埃希菌检查。