阅读说明：本技术 一种消毒剂灭菌效果的鉴定和评价方法 (Method for identifying and evaluating sterilization effect of disinfectant ) 是由 王娟 张文英 南紫萱 梁芳慧 岳琳 张伟亮 贾鹏飞 葛凤燕 张星辰 刘占旗 邢云 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种消毒剂灭菌效果的鉴定和评价方法,属于微生物的测定或检测技术领域。包括以下步骤(1)标记8支试管(2)加入生理盐水,1-5号加9mL,6-8号加10mL,20±2℃水浴(3)1试管加1mL菌液混匀后,取1mL移入第2试管,混匀,从第2试管内取1mL移入第3、4和5,将3-5试管分别混匀后,将6-8试管依次倒入3-5试管混匀后,再分别移取10mL于6-8试管内(4)加入消毒剂于3-7作为实验样；第8管内作为对照样(5)定性和定量培养(5)观察结果计算抑菌率。本发明检测方法可以检测任意浓度消毒剂,可以同时检测两批及以上的消毒剂抑菌效果,检测浓度范围广,节省时间。(The invention discloses a method for identifying and evaluating the sterilization effect of a disinfectant, belonging to the technical field of determination or detection of microorganisms. Marking 8 test tubes (2), adding physiological saline, adding 9mL into No. 1-5 test tubes, adding 10mL into No. 6-8 test tubes, adding 1mL of bacterial liquid into 1 test tube in a water bath (3) at 20 +/-2 ℃, uniformly mixing, transferring 1mL into the No. 2 test tube, uniformly mixing, transferring 1mL from the No. 2 test tube into No. 3, 4 and 5 test tubes, respectively uniformly mixing 3-5 test tubes, sequentially pouring 6-8 test tubes into 3-5 test tubes, uniformly mixing, then respectively transferring 10mL into 6-8 test tubes, adding a disinfectant into 3-7 test tubes (4) to serve as experimental samples; and (4) in the 8 th tube, qualitatively and quantitatively culturing as a control sample (5) and observing results to calculate the bacteriostasis rate. The detection method can detect the disinfectant with any concentration, can simultaneously detect the bacteriostatic effect of two or more batches of the disinfectant, has wide detection concentration range and saves time.)

一种消毒剂灭菌效果的鉴定和评价方法

技术领域

本发明涉及微生物的测定或检测技术领域。

背景技术

随着生活水平的日益提高，人们对卫生的要求也日益增加。伴随着各种各样的消毒剂的产生，人们对其抑菌效果的要求越来越高。目前施行的检测方法为GB15981-1995，将消毒剂用蒸馏水稀释至一系列浓度梯度后，再加入稀释好的菌悬液混合均匀一段时间后，取少量加入中和剂，中和10分钟后，取出少量加入营养肉汤，观察是否浑浊来判断其抑菌效果。该检测方法虽然所需仪器设备简单、现象明显，易于观察，能够准确评价消毒剂对微生物的杀灭作用。但是此方法只能按照一定的浓度梯度稀释消毒剂，检测过程所用时间较长，因此急需一种适用于各种浓度消毒剂、并且检测周期短的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种消毒剂灭菌效果的鉴定和评价方法，本发明检测方法用稀释后的菌悬液与消毒剂均匀混合以检测任意浓度消毒剂，可以同时检测两批及以上的消毒剂的抑菌效果，检测浓度范围广，节省了大量时间。

一种消毒剂灭菌效果的鉴定和评价方法，操作均在无菌台内完成，包括以下步骤(1)将8支灭菌试管排列于试管架上，并标记试管号码；(2)每支试管均加入灭菌后的0.9％的生理盐水，其中1-5号试管加入9mL，6-8号试管加入10mL，将8支试管放入20±2℃的水浴中；(3)于第1试管内加1mL菌液混匀后，取1mL溶液移入第2试管，再次混匀，从第2试管内取3个1mL分别移入第3试管、第4试管、第5试管,将3-5试管的溶液分别混匀后，将6-8号试管的溶液依次倒入3-5号试管中，混匀,再分别从3-5号试管移取10mL溶液于6-8号试管内；(4)加入所需任意浓度消毒剂于3-7号试管内混匀后作用3min作为实验样；第8号试管内不加入消毒剂作为对照样；(5)定性试验：从3-8号试管内各取1mL溶液分别放入9ml营养肉汤管内，将接种细菌的营养肉汤管37℃培养48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7天；定量试验：分别从3-8号试管中吸取0.1mL溶液接种于琼脂培养基，用灭菌的三角涂布棒涂匀，倒置放入恒温培养箱37℃培养24h；(6)观察结果：①定性试验：若营养肉汤管浑浊，则表示有菌生长，记为阳性(+)，若培养至第7天，营养肉汤管澄清，则表示无菌生长，记为阴性(-)；②定量试验：观察菌落数量及形态，并做涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长，计算抑菌率：

Y——抑菌率；

W——对照样细菌个数(将菌液稀释到一定浓度，可以涂板之后在平皿上数清菌落的个数，以此计算对照样菌落个数)；

Q——实验样细菌个数。

根据计算得到的抑菌率判断其抑菌效果，抑菌率≥99.9％为合格。

步骤(3)所用菌液的制备方法为：

(1)冻干菌的活化

将冻干菌融化分散在5mL的营养肉汤中成悬浮状,在37℃±2℃下培养18h-24h制成菌悬液，用接种环取菌悬液以划线法接种到琼脂培养基平皿上,在37℃±2℃下培养18h-24h，从培养皿上取典型菌落接种在琼脂培养基斜面试管内,在37℃±2℃下培养18h-24h，将斜面试管贮存于5℃-10℃冰箱内作为保存菌,保存期不超过一个月,每月传代一次,传代次数不超过10代；

(2)试验菌液的制备

1)用接种环取保存菌,以划线法接种到琼脂培养基平皿上,37℃±2℃下培养24h；该平皿在5℃-10℃条件下保存,在1周内使用；

2)取营养肉汤20mL放入100mL的三角烧瓶内,用接种环取步骤1)平皿上的典型菌落接种在肉汤内培养；培养条件为:温度37℃±2℃，调节转速为130r/min,时间18h-24h；

3)用蒸馏水20倍稀释营养肉汤,用其调节培养后的菌浓度为1X108CFU/mL-5X108CFU/mL，作为试验菌液。

所用菌为大肠杆菌Escherichia coli(8099或ATCC11229)革兰氏阴性。

琼脂培养基的组成为：每1000mL琼脂培养基中含有胰蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂粉17.5g、酵母浸粉5g，余量为蒸馏水；灭菌后调节pH值为7.2±0.2。

营养肉汤的组成为：每1000mL营养肉汤中含有胰蛋白胨15g、植物蛋白胨5g、氯化钠5g，余量为蒸馏水；灭菌后调节pH值为7.2±0.2。

本发明所用设备包括以下设备：桌上式洁净工作台、恒温培养箱、微量移液管、平皿、试管、三角瓶、酒精灯、三角涂布棒等实验室常用仪器；高压灭菌锅：温度保持在121℃，压力能保持在103kPa。

试剂：试验所用试剂应是分析纯或适用微生物试验用的。试验用水应是用于制备微生物培养基的分析纯级的纯水即前述蒸馏水，可用离子交换、蒸馏或用反渗装置过滤等方法制取，应无毒和无抑菌物质。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

与GB15981-1995相比：本发明所采用的检测方法用稀释后的菌悬液与消毒剂均匀混合可以检测任意浓度和任意批次消毒剂的抗菌性能，检测浓度范围广。

国标法用稀释了一定浓度梯度的消毒剂与菌悬液均匀混合以检测消毒剂的抗菌性能，检测不同浓度、不同批次的消毒剂过程繁琐费时、操作复杂。而本发明的检测方法可同时检测不同浓度、不同批次的消毒剂，节省了大量时间。

本发明可同时进行消毒剂定性消毒试验和消毒剂定量消毒试验，大大节省了时间。

附图说明

图1为消毒剂浓度分别为5ppm、10ppm、15ppm的抑菌效果图

图2为消毒剂浓度分别为3ppm、10ppm、30ppm、300ppm的抑菌效果图

图3为消毒剂浓度分别为10ppm、30ppm、300ppm、3000ppm的抑菌效果图

图4为消毒剂浓度分别为3ppm、15ppm、30ppm的抑菌效果图

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

实施例1

(1)将8支灭菌试管排列于试管架上，并标记试管号码；(2)每支试管均加入灭菌后的0.9％的生理盐水，其中1-5号试管加入9mL，6-8号试管加入10mL，将8支试管放入20±2℃的水浴中；(3)于1号试管内加1mL菌液混匀后，取1mL移入2号试管，再次混匀，从第2试管内取三个1mL分别移入3号试管、4号试管、5号试管,将3-5试管的溶液分别混匀后，将6-8号试管的溶液依次倒入3-5号管中，混匀,再分别从3-5号管移取10mL溶液于6-8号试管内。(4)从3号试管内取出30μl生理盐水，再取1000ppm的PHMG消毒剂30μl(即消毒剂浓度为3ppm)于3号试管内混匀，从4号试管内取出50μl生理盐水，再取消毒剂50μl于4号试管内混匀，从5号试管内取出100μl生理盐水，再取消毒剂100μl于5号试管内混匀，从6号试管内取出300μl生理盐水，再取消毒剂300μl于6号试管内混匀，从7号试管内取出500μl生理盐水，再取消毒剂500μl于7号试管内混匀后作用3min作为实验样；第8号试管内不加入消毒剂(即消毒剂浓度为0ppm)作为对照样；(5)定性试验：从3-8号试管内各取1mL分别放入9ml营养肉汤管内。将接种细菌的肉汤管放37℃培养48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7天。定量试验：分别从3-8号试管中吸取0.1mL溶液接种于琼脂培养基，用灭菌的三角涂布棒涂匀，倒置放入恒温培养箱37℃培养24h；(6)观察结果：①定性试验：若肉汤管浑浊，则表示有菌生长，记为阳性(+)，若培养至第7天，肉汤管澄清，则表示无菌生长，记为阴性(-)。②定量试验：观察菌落数量及形态，并做涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长，计算抑菌率：

消毒剂浓度

0ppm

3ppm

5ppm

10ppm

30ppm

50ppm

抑菌率

0％

96.75％

98.78％

99.84％

99.99％

99.99％

阳性/阴性

+

+

-

-

-

-

实施例2

(1)将6支灭菌试管排列于试管架上，并标记试管号码；(2)每支试管均加入灭菌后的0.9％的生理盐水，其中1-4号试管加入9mL，5-6号试管加入10mL，将6支试管放入20±2℃的水浴中；(3)于第1试管内加1mL菌液混匀后，取1mL移入第2试管，再次混匀，从第2试管内取三个1mL分别移入第3试管、第4试管,将3-4试管分别混匀后，将6-8号试管的溶液依次倒入3-5号管中，混匀,再分别从3-5号管移取10mL溶液于6-8号试管内。(4)从3号试管内取出30μl生理盐水，再取10000ppm的纳米银离子抗菌剂30μl(即抗菌剂浓度为30ppm)于3号试管内混匀，从4号试管内取出60μl生理盐水，再取抗菌剂60μl于4号试管内混匀，从5号试管内取出100μl生理盐水，再取抗菌剂100μl于5号试管内混匀后作用3min作为实验样；第6号试管内不加入抗菌剂(即抗菌剂浓度为0ppm)作为对照样；(5)定性试验：分别从3-6号试管内取1mL分别放入9ml营养肉汤管内。将接种细菌的肉汤管放37℃培养48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7天。定量试验：分别从3-6号试管中吸取0.1mL接种于琼脂培养基，用灭菌的三角涂布棒涂匀，倒置放入恒温培养箱37℃培养24h；(6)实验结果：①定性试验：若肉汤管浑浊，则表示有菌生长，记为阳性(+)，若培养至第7天，肉汤管澄清，则表示无菌生长，记为阴性(-)。②定量试验：观察菌落数量及形态，并做涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长，计算抑菌率：

消毒剂浓度	0ppm	30ppm	60ppm	100ppm
					抑菌率	0％	64.76％	86.45％	97.65％
阳性/阴性	+	+	+	-

实施例3

(1)将8支灭菌试管排列于试管架上，并标记试管号码；(2)每支试管均加入灭菌后的0.9％的生理盐水，其中1-5号试管加入9mL，6-8号试管加入10mL，将8支试管放入20±2℃的水浴中；(3)于第1试管内加1mL菌液混匀后，取1mL移入第2试管，再次混匀，从第2试管内取三个1mL分别移入第3试管、第4试管、第5试管,将3-5号试管分别混匀后，将6-8号试管的溶液依次倒入3-5号管中，混匀,再分别从3-5号管移取10mL溶液于6-8号试管内。(4)从3号试管内取出50μl生理盐水，再取10000ppm的壳聚糖消毒剂50μl(即消毒剂浓度为50ppm)于3号试管内混匀，从4号试管内取出100μl生理盐水，再取消毒剂100μl于4号试管内混匀，从5号试管内取出300μl生理盐水，再取消毒剂300μl于5号试管内混匀，从6号试管内取出500μl生理盐水，再取消毒剂500μl于6号试管内混匀，从7号试管内取出1000μl生理盐水，再取消毒剂1000μl于7号试管内混匀后作用3min作为实验样；第8号试管内不加入消毒剂(即消毒剂浓度为0ppm)作为对照样；(5)定性试验：分别从3-8试管内取1mL分别放入9ml营养肉汤管内。将接种细菌的肉汤管放37℃培养48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7天。定量试验：分别从3-8号试管中吸取0.1mL试液接种于琼脂培养基，用灭菌的三角涂布棒涂匀，倒置放入恒温培养箱37℃培养24h；(6)实验结果：①定性试验：若肉汤管浑浊，则表示有菌生长，记为阳性(+)，若培养至第7天，肉汤管澄清，则表示无菌生长，记为阴性(-)。②定量试验：观察菌落数量及形态，并做涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长，计算抑菌率：

消毒剂浓度

0ppm

50ppm

100ppm

300ppm

500ppm

1000ppm

抑菌率

0％

72.65％

87.64％

95.84％

98.29％

99.99％

阳性/阴性

+

+

+

+

-

-

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。