阅读说明：本技术 L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的分离检测方法 (Separation and detection method of L-glutamic acid diethyl ester hydrochloride and optical isomer thereof ) 是由 韩林 徐浩宇 董达文 蔡伟 徐瑛 宣景安 吴青青 李博 于向东 夏雨 王莲莲 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的分离检测方法,所述分离检测方法采用高效液相色谱法,固定相为硅胶类手性柱,流动相为反相溶剂：高氯酸水溶液-乙腈。本发明所述方法具有分离度好、灵敏度高、专属性强等特点,可以快速、准确地对L-谷氨酸二乙酯盐酸盐进行质量控制。(The invention discloses a separation and detection method of L-glutamic acid diethyl ester hydrochloride and optical isomers thereof, which adopts a high performance liquid chromatography, wherein a stationary phase is a silica gel chiral column, and a mobile phase is a reverse phase solvent: aqueous perchloric acid solution-acetonitrile. The method has the characteristics of good separation degree, high sensitivity, strong specificity and the like, and can quickly and accurately control the quality of the L-glutamic acid diethyl ester hydrochloride.)

L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的分离检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的分离检测方法。

背景技术

L-谷氨酸二乙酯盐酸盐为一种重要的医药化工原料，可用于生产雷替曲塞，培美曲塞等药物，其化学结构式如下：

L-谷氨酸二乙酯盐酸盐中会有一定量的光学异构体存在，即D-谷氨酸二乙酯盐酸盐，其化学结构式如下：

该光学异构体可通过后续反应，残留至药物中，影响药品质量。因此，对L-谷氨酸二乙酯盐酸盐中光学异构体杂质需要进行质量控制。控制L-谷氨酸二乙酯盐酸盐中光学异构体的含量，对提高药品质量、保证广大患者用药安全具有重大意义。

氨基酸类小分子光学异构体的分离检测一直是药物合成中质量控制的重点和难点。而L-谷氨酸二乙酯盐酸盐的存放过程中会有少量降解杂质焦谷氨酸乙酯产生，其结构式如下：

更增加了光学异构体的分离检测难度。文献CN104515815A公开了一种L-谷氨酸二乙酯的分析检测方法，对L-谷氨酸二乙酯及其杂质分离。但该方法为有关物质检测方法，不足以对L-谷氨酸二乙酯的光学异构体分离检测。目前并无文献报道通过高效液相色谱法检测其光学异构体。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本发明提供了一种灵敏、简便、快速的L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的分离检测方法，所述方法基于反相液相色谱，成熟通用、简单快速，具有分离度好、灵敏度高、专属性强等特点。

本发明提供了一种L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的分离检测方法，该检测方法包括以下步骤：

1)配制供试品溶液：取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐，加水溶解并稀释制成L-谷氨酸二乙酯盐酸盐供试品溶液；

2)采用高效液相色谱法测定，精密量取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；

其中，高效液相色谱法的色谱条件包括：

流动相：高氯酸水溶液和乙腈；

色谱柱：以手性冠醚键合硅胶为固定相。

在本发明所述分离检测方法中，所述色谱条件还包括：

检测波长：200nm～230nm，优选200nm～210nm，更优选205nm；

柱温：20℃～35℃，优选25℃；

流动相的流速：0.4ml/min～1.2ml/min，优选为1.0ml/min；

进样量：10μl-30μl，优选为20μl。

在本发明的上述分离检测方法中，所述流动相中高氯酸水溶液与乙腈的体积比为2:8～8:2，优选地为(65:35)～(55:45)。

在本发明的上述分离检测方法中，所述流动相中高氯酸水溶液pH为1.0～6.0，优选地，为2.0～3.0。

在本发明的上述分离检测方法中，所述L-谷氨酸二乙酯盐酸盐供试品溶液中L-谷氨酸二乙酯盐酸盐的浓度为3mg/ml～7mg/ml，优选地为6mg/ml。

在本发明的上述分离检测方法中，所述的分离检测方法还包括配制对照溶液：精密量取所述L-谷氨酸二乙酯盐酸盐供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

在本发明的上述分离检测方法中，所述的分离检测方法还包括配制光学异构体贮备液：取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐光学异构体约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为光学异构体贮备液。

在本发明的上述分离检测方法中，所述的分离检测方法还包括配制分离度溶液：取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐约60mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取上述光学异构体贮备液1ml加入，再加水稀释至刻度，摇匀，即得。

在本发明的上述分离检测方法中，所述的分离检测方法包括：精密量取对照溶液和/或光学异构体贮备液和/或分离度溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1为实施例1中分离度溶液的液相色谱图；

图2为实施例1中供试品溶液的液相色谱图；

图3为实施例2中分离度溶液的液相色谱图；

图4为实施例3中分离度溶液的液相色谱图；

图5为实施例4中分离度溶液的液相色谱图；

图6为实施例5中分离度溶液的液相色谱图；

图7为对比例中更换色谱柱后混合溶液的液相色谱图；

图8为对比例中优化方法后混合溶液的液相色谱图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1

1.1色谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱柱：DAICEL CROWNPAKCR-I(+)，3.0×150mm，5μm；

流动相：pH2.0高氯酸水溶液-乙腈(高氯酸水溶液与乙腈的体积比为60:40)；

检测波长：205nm；

柱温：25℃；

进样量：20μl；

流速：1.0ml/min；

运行时间：20min。

1.2样品配制

空白溶液：水。

供试品溶液：取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐约60mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

光学异构体贮备液：取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐光学异构体约30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为光学异构体贮备液。

分离度溶液：取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐约60mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取光学异构体贮备液1ml加入，再加水稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3测定

取分离度溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。光学异构体与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐依次出峰，分离度应大于1.5。

分别取供试品溶液、对照溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按照自身对照法计算光学异构体的含量。

分离度溶液结果见附图1，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐在8.926min，光学异构体在7.559min，分离度大于1.5，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体完全分离。

供试品溶液结果见附图2，可以看出该条件下L-谷氨酸二乙酯盐酸盐在8.916min左右，光学异构体在7.559min左右，焦谷氨酸乙酯在13.025min左右，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐、光学异构体、焦谷氨酸乙酯达到基线分离。

实施例2

2.1色谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱柱：DAICEL CROWNPAKCR-I(+)，3.0×150mm，5μm；

流动相：pH2.0高氯酸水溶液-乙腈(高氯酸水溶液与乙腈的体积比为60:40)；

检测波长：205nm；

柱温：25℃；

进样量：20μl；

流速：0.8ml/min；

运行时间：20min。

2.2样品配制

同实施例1

2.3测定

取分离度溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，光学异构体与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐依次出峰，分离度应大于1.5。

分别取供试品溶液、对照溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按照自身对照法计算光学异构体的含量。

分离度溶液结果见附图3，可以看出该条件下L-谷氨酸二乙酯盐酸盐主峰在11.234min，光学异构体在9.504min，分离度大于1.5，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体完全分离。

实施例3

3.1色谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱柱：DAICEL CROWNPAKCR-I(+)，3.0×150mm，5μm；

流动相：pH2.0高氯酸水溶液-乙腈(高氯酸水溶液与乙腈的体积比为60:40)；

检测波长：205nm；

柱温：25℃；

进样量：20μl；

流速：1.2ml/min；

运行时间：20min。

3.2样品配制

同实施例1

3.3测定

取分离度溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。光学异构体与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐依次出峰，分离度应大于1.5。

分别取供试品溶液、对照溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按照自身对照法计算光学异构体的含量。

分离度溶液结果见附图4，可以看出该条件下L-谷氨酸二乙酯盐酸盐主峰在7.408min，光学异构体在6.272min，分离度大于1.5，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体完全分离。

实施例4

4.1色谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱柱：DAICEL CROWNPAKCR-I(+)，3.0×150mm，5μm；

流动相：pH2.0高氯酸水溶液-乙腈(高氯酸水溶液与乙腈的体积比为55:45)；

检测波长：205nm；

柱温：25℃；

进样量：20μl；

流速：1.0ml/min；

运行时间：20min。

4.2样品配制

同实施例1

4.3测定

取分离度溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。光学异构体与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐依次出峰，分离度应大于1.5。

分别取供试品溶液、对照溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按照自身对照法计算光学异构体的含量。

分离度溶液结果见附图5，可以看出该条件下光学异构体在7.986min，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐在9.523min，分离度大于1.5，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体完全分离。

实施例5

5.1色谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱柱：DAICEL CROWNPAKCR-I(+)，3.0×150mm，5μm；

流动相：pH2.0高氯酸水溶液-乙腈(高氯酸水溶液与乙腈的体积比为65:35)；

检测波长：205nm；

柱温：25℃；

进样量：20μl；

流速：1.0ml/min；

运行时间：20min。

5.2样品配制

同实施例1

5.3测定

取分离度溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。光学异构体与L-谷氨酸二乙酯盐酸盐依次出峰，分离度应大于1.5。

分别取供试品溶液、对照溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按照自身对照法计算光学异构体的含量。

分离度溶液结果见附图6，可以看出该条件下L-谷氨酸二乙酯盐酸盐主峰在8.934min，光学异构体在7.560min，分离度大于1.5，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其异构体完全分离。

对比例

采用CN104515815A液相色谱条件，进行光学异构体分离检测

1.色谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱柱：Agilent XDB-C18，4.6×150mm，5μm；

流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液-0.05mol/L磷酸氢二钠溶液-乙腈(磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、乙腈的体积比为80:5:15)；

检测波长：210nm；

柱温：27℃；

进样量：20μl；

流速：1.0ml/min；

运行时间：30min。

2.样品配制

空白溶液：水。

供试品溶液：取L-谷氨酸二乙酯盐酸盐约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

光学异构体溶液：取光学异构体约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为光学异构体贮备液。

L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的混合溶液：分别取供试品溶液2ml，光学异构体溶液2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。

3.测定

取分离度溶液10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。L-谷氨酸二乙酯盐酸盐与光学异构体完全重叠，无法进行光学异构体分离检测。

将色谱柱更换为手性冠醚键合硅胶柱，如DAICEL CROWNPAKCR-I(+)，3.0×150mm，5μm，其他色谱条件不变，结果见附图7，可以看出L-谷氨酸二乙酯盐酸盐与光学异构体色谱峰基本重叠，峰形很差，存在包裹现象；优化其流动相中磷酸盐比例，改变流动相pH后，结果见附图8，可以看出L-谷氨酸二乙酯盐酸盐与光学异构体色谱峰存在分离迹象，但难以达到基线分离。

这就证明，CN104515815A的液相方法不适合L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的检测分离，同时本发明中色谱柱、流动相的组成等色谱参数对L-谷氨酸二乙酯盐酸盐及其光学异构体的检测分离起到关键作用。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。