具体实施方式

为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

本发明公开了一种对伊枯草菌素(Iturin)抑菌活性的定量测定方法。伊枯草菌素(Iturin)对生长于MH培养基琼脂(含琼脂17g/L)平板上的耐药性大肠杆菌(Ecoli K12D31)的生长具抑制作用，并在琼脂板上形成透明的抑菌圈。

本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法针对解淀粉芽孢杆菌发酵所得的发酵液、发酵浓缩液(浓缩10倍量)、发酵产品剂中的伊枯草菌素(Iturin)的抑菌活性进行定量测定。其抑菌圈直径(D，mm)与伊枯草菌素的浓度(M，μg/ml)之间具有如下线性关系：lnM＝0.015D²+7.313。因此，点样肽液的抑菌活性(Arbitrary Units，AU/ml)可按如下公式计算：AU/ml＝1500e^Y(Y＝0.015D²)。

本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法，对于肽产品中伊枯草菌素的提取方法中对于白炭黑预混肽、伊枯草菌素产品，将产品稀释后加入65％酒精，以超声波仪处理；离心，吸取上清液点样于含指示菌的培养基平板上。

本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法中，肽液点样和细菌培养方法：对于每一个待测样液，吸取3份液(每份10μl)，分别点样于含指示菌的培养平板的每区的对应标号的孔中，并立即置于4℃冰箱中静置6h，后转移到37℃培养箱中培养24h，测定每一个抑菌圈的直径(mm)。

本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法以耐药性大肠杆菌K12D31株作指示菌，以MH为培养基，以3mm外径的打孔器打孔，加药量为10μl；加药后，平板先放于4℃正置6h，后置于37℃恒温培养24h，最后测量含菌琼脂平板上的抑菌圈直径；本发明特指伊枯草菌素抗菌活性的定量测定方法。

实施例一本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法

1、检测原理

抗菌肽粗品(含水分7％)中的抗菌肽(伊枯草菌素)对生长于MH培养基琼脂平板上的耐药性大肠杆菌(EcoliK₁₂D₃₁)的生长具抑制作用，并在琼脂板上形成透明的抑菌圈。在本发明的操作条件下，伊枯草菌素的抑菌圈直径(D，mm)与伊枯草菌素的浓度(M，μg/ml)之间具有如下线性关系：lnM＝0.015D²+7.313。因此，点样肽液的抑菌活性(ArbitraryUnits，AU/ml)可按如下公式计算：

AU/ml＝1500e^Y(Y＝0.015D²)。

2、试剂和材料

2.1指示菌：大肠杆菌(EcoliK₁₂D₃₁)。

2.2硫酸链霉素母液

称取硫酸链霉素(MW＝1457.38，纯度99％，购自广州市齐云生物科技有限公司)1g，溶于9ml纯水中，制得含硫酸链霉素100mg/ml的母液，过滤灭菌备用。

2.3MH肉汤

按说明要求称取MH肉汤粉(BR，广东环凯微生物科技有限公司)配制，调pH＝7.0，高压灭菌20分钟，冷却后加入硫酸链霉素母液50μl混匀备用。

2.4MH固体培养基

取3.8克MH琼脂(BR，广东环凯微生物科技有限公司)，溶于100mL水，调pH＝7.0，高压灭菌20分钟后备用。

2.5MH固体平板

按4.3所述的方法制备，等培养基于室温条件下凝固后置于4℃冰箱中保存备用。

2.6酒精(65％)。

2.7打孔器，不锈钢材质园管，材厚0.2mm，外径3.0mm，长100mm。

2.8玻璃培养皿，外径(内径)为90(85)或180(173.8)或200(195)mm。

3、仪器

3.1电子天平，赛多利斯TE124S，±0.0001克。

3.2高压蒸汽灭菌锅，HIRAYAMA。

3.3超净工作台，SW-CJ-1F/1FD，苏州苏净集团苏净安泰公司生产。

3.4酸度计，德国赛多利斯PB10。

3.5气浴恒温振荡器，往复式CHA-SA。

3.6可见分光光度计，美谱达V-1200。

3.7隔水式恒温培养箱，GHP9080，上海恒一科学仪器有限公司生产。

3.8水浴锅，HWS-12。

3.9其它接种环、酒精灯、刻度吸管、培养皿(外径90mm)和游标卡尺等。

4、操作步骤

4.1对待检测样品进行对应的处理，得到伊枯草菌素样液，包括以下情况中的至少一种：

(1)对于灭菌前的发酵液，先用无菌水稀释2倍，离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清，后吸取上清液3份，每份10μl，点样于含指示菌的培养基平板上。

(2)对于灭菌后的发酵液，直接离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清，后吸取上清液3份，每份10μl，点样于含指示菌的培养基平板上。

(3)对于伊枯草菌素发酵液浓缩膏，先用无菌水稀释10倍，离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清，吸取上清液3份，每份10μl，点样于含指示菌的培养基平板上。

(4)对于伊枯草菌素初级预混剂(白炭黑肽制剂)，先用白炭黑稀释2倍(1g白炭黑肽+1g白炭黑)，于试管中经涡旋振荡(2500rpm)2分钟后再称取0.2500g称样，装于试管中，加入4ml的65％酒精，以超声波仪(35W，40kHz)处理20分钟；离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清，吸取上清液3份，每份10μl，点样于含指示菌的培养基平板上。

(5)对于伊枯草菌素产品样品，直接称取0.2500g样，装于试管中，加入2ml的65％酒精，以超声波仪处理20分钟；离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清，后吸取上清液3份，每份10μl，点样于含指示菌的培养基平板上。

上述(1)至(5)的操作总结如下表1所示。

表1不同阶段产品的抗菌肽(伊枯草菌素)的稀释或提取方法

4.2对数期指示菌制备

将耐受链霉素的大肠杆菌突变株(K₁₂D₃₁)菌种划线于MH平板(内径90mm)上，37℃培养至其上生长有明显的菌落。挑一菌落于MH肉汤中(含链霉素50μg/ml)，置于恒温摇床37℃振荡培养，培养至其OD_600nm＝0.5(以液体MH肉汤作空白)。

4.3含指示菌的MH培养平板的制备

先将MH固体培养基(含琼脂17g/L)置于50℃水浴中熔融，再加入对数期指标菌液(500μl菌液/100ml培养基)，混匀。取其中24ml含菌培养基倒入内径85mm的培养皿中，使固定培养基厚度达4.22mm(对内径为173.8mm的培养皿，应加入100ml含菌培养基；对内径为195mm的培养皿，应加入126ml含菌培养基)。等培养基凝固，将平板平分成三等份，并以3mm打孔器在培养基平板每区上均匀分布地打上数个孔(每区打孔数为分析样品数)。

4.4肽液点样和细菌培养

对于每一个待测样液，吸取3份液(每份10μl)，分别点样于含指示菌的MH培养平板的每区的对应标号的孔中，并立即置于4℃冰箱中静置6h，后转移到37℃培养箱中培养24h，测定每一个抑菌圈的直径(mm)。

5.结果计算

(1)对于灭菌前的发酵液，抗菌肽的抑菌活性按(a)式计算：

(a)式：A_发酵液(AU/ml)＝2×1500e^Y

其中“2”为稀释倍数，Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直径(mm)。

例如，D＝10mm时，则Y＝1.5000，A发酵液＝13443。

(2)对于灭菌后的发酵液，抗菌肽的抑菌活性按(b)式计算：

(b)式：A发酵液(AU/ml)＝1500e^Y

其中Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直径(mm)。

例如，D＝10.5mm时，则Y＝1.6538，A发酵液＝7838。

(3)对于发酵液浓缩膏，抗菌肽的抑菌活性按(c)式计算：

(c)式：A浓缩膏(AU/ml)＝10×1500e^Y

其中“10”为稀释倍数，Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直径(mm)。

例如，D＝12mm时，则Y＝2.1600，A浓缩膏＝130038。

(4)对于白炭黑预混肽粉，抗菌肽的抑菌活性按(d)式计算：

(d)式：A白炭黑肽(AU/g)＝(2×4/0.25)×1500e^Y

其中“2”为稀释倍数，“0.25”为稀释后预混剂的取样量，“4”为酒精体积，Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直径(mm)。

例如，D＝11mm时，则Y＝1.815，A_白炭黑肽＝294716。

(5)对于肽产品(商品名：纳吐素)，抗菌肽的抑菌活性按(e)式计算：

(e)式：A_{伊枯草菌素产品}(AU/g)＝(2/0.25)×1500e^Y

其中“2”为酒精体积，“0.25”为纳吐素的取样量，Y＝0.015D²，D＝抑菌圈直径(mm)。

例如，D＝4mm时，则Y＝0.24，A_{伊枯草菌素产品}＝15255。

测定结果用三个平行测定的算术平均值表示，保留至整数。

实施例二指示菌对本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法中抑菌圈的影响

本发明以耐受抗生素的大肠杆菌K₁₂D₃₁作指示菌，可较好地区别抗菌剂是抗生素还是抗菌肽，因为耐药指示菌对抗生素具有耐受性，使得抗生素对此指示菌的抑菌圈呈阴影状或多环状，见图1：左上Neo：硫酸新霉素，抑圈呈多环状；右下Lin：林肯霉素，抑圈呈阴影状；左下pep1：抗菌肽(伊枯草菌素)，抑菌圈清彻透明；右上pol：抗菌肽(同类抗菌肽)，抑菌圈清彻透明。阴影状或多环状抑菌圈意味着抗生素杀菌和耐药菌生长繁殖同时进行着，而抗菌肽的抑菌圈却是清彻透明的。

实施例三培养基对本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法中指示菌的影响

在MH培养基上，指示菌(大肠杆菌K₁₂D₃₁)生长均一(见图1)，而在其它营养培养基(如LB培养基)上生长不良，见图2：“灭”为灭菌处理(121℃，20min)后的伊枯草杆菌素；“北”为北里霉素(kitasamycin)；“预”为伊枯草杆菌素原液，预备用于灭菌处理；“M2”为一种芽孢杆菌的发酵液。在LB琼脂固体培养平板上，指示菌生长较差，菌膜厚薄不均；而指示菌在MH琼脂固体培养平板上生长良好，菌膜厚薄均一(见图1)。

所以本发明采用MH培养更有利于指示菌生长，使测定结果更精准。

实施例四孔径和点样量对本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法的影响

以牛津杯(内径6.8mm、外径7.7mm、高10mm)在含指示菌的MH固体培养基平板上打孔，点样量为20μl(含伊枯草菌素粗品1400μg/ml)，先置4℃冰箱中正向静置6小时，后于37℃培养箱中培养18小时，抑菌圈直径为18.97mm(3个数值的平均数)(见图3)。

以外径为3mm的打孔器打孔，点样量为10μl，同法检测，得抑菌圈直径为14.45mm(见图3)。

以小打孔器法，虽所得的抑菌圈直径显著小于牛津杯法(P<0.05)，但其加载量小，只需10μl，而所测得的抑菌圈也很明显。

实施例五点样平板的预处理对本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法的影响

本发明的方法中，在培养细菌之前先将点样平板静置于4℃冰箱6小时。

以伊枯草菌素粗品溶液，点样10μl，在细菌培养之前，分别采用先于4℃冰箱中正向静置6h和在室温(37℃)正向静置6h，然后均在37℃培养箱中培养18h，测定两种处理方法的抑菌圈直径，结果表明：于4℃静置处理的抑菌圈为12.12mm(3个数的平均值)，显著大于室温静置的10.44mm(P<0.05)，较室温静置的提高了16.09％(见图4)，表明本发明的方案中，于4℃预处理有利于提高抑菌敏感度，利于抑菌活性的检测。所以本申请专利采用了在细菌培养前先将点样平板正向静置于4℃冰箱6h。

实施例六培养时间对本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法的影响

按发明方法测定伊枯草菌素粗品对耐药大肠杆菌K₁₂D₃₁，不同指示菌培养时间所测定的抑圈直径值(3个重复数的平均值，mm)各不相同，于培养第14h、16h、18h、20h、22h、24h和26h时测得的抑菌圈直径分别为10.06±0.06、10.27±0.08、11.51±0.04、11.68±0.06、11.82±0.08、11.98±0.10和11.64±0.27(见图5)，其中第20h、22h、24h和26h时的抑菌圈直径大小属同一水平，均显著高于14h、16h和18h的(P>0.05)，这表明：于细菌培养的第24h测定抑菌圈直径的数值较稳定；而且，于第24h测定抑菌圈直径更利于质检品记忆抑圈直径的测定时间。

实施例七

不同抗菌剂对大肠杆菌K₁₂D₃₁的适宜的检测剂量及其抑菌浓度(μg/ml或IU/ml)与抑菌圈直径(mm)之间的回归方程见表2.

从表2可知：

①伊枯草菌素对乳酸菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌等益生性细菌的抑菌圈为阴影状，表明这些益生菌对其具耐受性；而抗生素(硫酸粘杆菌素、硫酸新霉素、盐酸林可霉素)对这些益生菌的抑菌圈透明清晰，即这些益生菌对这些抗生素敏感。

②伊枯草菌素对A型产气荚膜梭菌(G⁺)、猪链球菌(G⁺)、鱼链球菌(G⁺)、大肠杆菌K88(G^—)、鸡白痢沙门氏菌(G^—)、猪霍乱沙门氏菌(G^—)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(G^—)等动物病原菌的抑菌浓度M与抑菌圈直径之间的回归方程的确定系数较小(0.977～0.994)，即其拟合度较差；另外，其适宜测定浓度较高(>2000μg/mL)。

③伊枯草菌素对大肠杆菌K₁₂D₃₁(G^—)的抑菌浓度M与抑菌圈直径之间的回归方程的确定系数较大(0.999)，即其拟合度较好；另外，其适宜测定浓度较低(低至600μg/mL)，且其适宜测定浓度范围较宽(600～12000μg/ml)。

故，本发明采用伊枯草菌素对大肠杆菌K₁₂D₃₁(G^—)，并利用其高拟合度的回归方程(lnM＝0.015D²+7.313，R²＝0.999)来定量测定伊枯草菌素，其测量结果最优。

表2不同抗菌剂对大肠杆菌K12D31的适宜的检测剂量及其抑菌浓度(μg/ml或IU/ml)与抑菌圈直径(mm)之间的回归方程

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。