阅读说明：本技术 一种鉴定评价秀珍菇对奈氏西地西菌诱发的黄斑病抗性水平的方法 (Method for identifying and evaluating resistance level of pleurotus geesteranus to physalospora naissacensis induced maculopathy ) 是由 刘增亮 陈雪凤 吴圣进 张雯龙 周双云 于 2021-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鉴定评价秀珍菇对奈氏西地西菌诱发的黄斑病抗性水平的方法,该方法包括以下步骤：栽培料带接种秀珍菇菌种后,进行菌丝培养80天,待菌丝生理成熟后,温差刺激菌棒出菇；取奈氏西地西菌菌株,震荡培养,获得病原菌悬浮液；选取子实体多、整齐健康的菌棒,在子实体菌盖大小为0.5～1.0cm时接种；置于密闭保鲜盒内再移至合适温度湿度条件下进行培养；培养2天后,取出菌棒,对秀珍菇黄斑病发病情况进行调查,记录菌棒发病子实体的数量及发病等级,计算病情指数,并据此判定秀珍菇品种黄斑病抗性水平。该方法可以准确的鉴定不同品种秀珍菇的黄斑病抗性水平,结果可靠,对推动秀珍菇黄斑病抗病品种的选育工作具有重要意义。(The invention discloses a method for identifying and evaluating resistance level of pleurotus geesteranus to northern leaf blight induced by western Naringi, which comprises the following steps: inoculating pleurotus geesteranus strains on the cultivation material belt, culturing mycelia for 80 days, and stimulating mushroom sticks to grow mushrooms by temperature difference after the mycelia are physiologically mature; taking a western nernstia bacterial strain, and performing shake culture to obtain a pathogenic bacteria suspension; selecting a neat and healthy fungus stick with a plurality of sporocarps, and inoculating when the size of a pileus of the sporocarps is 0.5-1.0 cm; placing the mixture in a sealed fresh-keeping box, and then transferring the mixture to a proper temperature and humidity condition for culture; after culturing for 2 days, taking out the fungus sticks, investigating the disease incidence of pleurotus geesteranus yellow spot, recording the number and disease incidence grade of diseased fruiting bodies of the fungus sticks, calculating disease indexes, and judging the resistance level of pleurotus geesteranus yellow spot. The method can accurately identify the resistance level of the yellow spot of the pleurotus geesteranus with different varieties, has reliable results, and has important significance for promoting the breeding work of the disease-resistant pleurotus geesteranus yellow spot.)

一种鉴定评价秀珍菇对奈氏西地西菌诱发的黄斑病抗性水平 的方法

技术领域

本发明涉及作物抗病性评价领域，特别是涉及一种鉴定评价秀珍菇对奈氏西地西菌诱发的黄斑病抗性水平的方法。

背景技术

秀珍菇，学名黄白侧耳，是一种营养丰富、味道鲜美的食用菌。它的蛋白质含量接近于肉类，比一般蔬菜高3-6倍，长久以来都是人们餐桌上的一道鲜美而又价廉的上档次菜肴。

黄斑病是秀珍菇生产上最重要的病害。前期试验结果表明黄斑病的病原菌是奈氏西地西菌。由于秀珍菇出菇期间环境湿度大，温度高，通风不畅，容易造成黄斑病发生。如果不及时处理，很容易蔓延爆发，导致整个菇棚绝产绝收，造成重大经济损失。

黄斑病发生在秀珍菇子实体上，在出菇期才会发生。秀珍菇等食用菌的出菇期短，若在出菇期施用药剂，极易导致药剂残留而引起食物中毒，进而对产品流通和消费产生严重影响，有时还会对食用菌产生严重药害，所以严禁在秀珍菇出菇期施用药剂。加之黄斑病发生迅速，造成防控秀珍菇黄斑病非常困难。

鉴于此，抗病品种的选育推广无疑将是防控秀珍菇黄斑病最经济有效、环保的方法。而建立简便有效的抗性鉴定技术体系是开展上述研究的前提和关键，但目前尚无秀珍菇黄斑病鉴定评价标准方法的报道，因此，开展秀珍菇黄斑病抗性鉴定方法的研究对推动秀珍菇黄斑病研究意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定评价秀珍菇对奈氏西地西菌诱发的黄斑病抗性水平的方法，以解决上述现有技术存在的问题，为抗黄斑病秀珍菇品种培育筛选、病原菌致病强弱能力鉴定及秀珍菇黄斑病防治奠定技术基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种利用子实体接种鉴定评价秀珍菇黄斑病抗性水平的方法，包括以下步骤：

(1)准备秀珍菇菌棒

栽培料袋接种秀珍菇菌种后，进行菌丝培养8天，待菌丝生理成熟后，温差刺激菌棒出菇；

(2)制备病原菌悬浮液

取黄斑病病原菌菌株，置于液体NB培养基中，震荡培养2天，获得病原菌悬浮液；

(3)秀珍菇出菇及病原菌接种

选取子实体多、整齐健康的菌棒，在子实体菌盖直径大小为0.5-1.0cm时接种；

接种病原菌时采用无菌毛刷蘸取病原菌悬浮液，均匀涂抹在秀珍菇子实体上；

接种病原菌后，将菌棒置于密闭保鲜盒内进行培养；

(4)抗病水平评价

培养结束后，取出菌棒，对秀珍菇黄斑病发病情况进行调查，记录每个菌棒发病子实体的数量及发病等级，计算病情指数，并据此判定秀珍菇品种黄斑病抗性水平。

进一步地，在步骤(2)中，所述震荡培养的条件为28℃、180rpm/min培养48h。

进一步地，在步骤(2)中，所述震荡培养结束后，菌液离心，收集沉淀获得菌体，所述菌体用无菌水稀释，得到所述病原菌悬浮液。

进一步地，所述黄斑病病原菌菌株为奈氏西地西菌。

进一步地，所述离心为5000rpm/min离心2min。

进一步地，所述病原菌悬浮液中病原菌数量为1x10⁸个/ml。

进一步地，在步骤(3)中，所述每个品种接种病原菌的菌棒数不少于10个，每个菌棒上的子实体个数不少于20个。

进一步地，在步骤(3)中，培养时，使所述菌棒在密闭保鲜盒内，距离盒壁2-8cm，出菇面距离盒壁10-20cm。

进一步地，在步骤(3)中，所述培养条件为温度25-30℃，湿度85-100％，培养48h。

本发明公开了以下技术效果：

接种时机的选择非常关键，选择子实体菌盖直径0.5-1.0cm接种，实际生产中，为了促进子实体菌柄生长，此阶段菇棚的环境要求二氧化浓度高，但也造成幼菇的抗病力弱；

接种方式简单，无需刺伤，更符合生产上的自然发病要求；

接种后培养时的环境条件(温度、湿度、密闭环境)非常重要，既要满足秀珍菇正常出菇，又要创造适宜发病的条件。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为黄斑病病原菌在NA培养基上的形态；

图2为电镜下黄斑病病原菌的形态；

图3为秀珍菇黄斑病自然发病情况；

图4为子实体大小适宜接种病原菌的秀珍菇菌棒；

图5为不同品种秀珍菇接种黄斑病病原菌后的发病情况；

图6为秀珍菇子实体菌盖过大接种后的情况；

图7为秀珍菇子实体菌盖过小接种后的情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、秀珍菇菌棒制备

采用秀珍菇常规配方配制原料，装袋后进行彻底灭菌，冷却后按照无菌操作接种不同品种(菌株)的秀珍菇。接种完后放入培养室进行菌丝培养。待菌丝达到生理成熟时，刺激菌棒进行出菇。

2、病原菌制备

黄斑病病原菌为奈氏西地西菌(Liu Z L,Zhou S,Zhang W,et al.First Reportof Cedecea neteri Causing Yellow Rot Disease in Pleurotus pulmonarius inChina[J].Plant Disease,2020.)，由本实验室从广西宜州感染黄斑病的秀珍菇子实体中分离得到，保藏于广西农业科学院微生物研究所，该病原菌在NA培养基上的形态如图1，电镜下的形态如图2所示。该病原菌致使秀珍菇自然发病的发病情况如图3所示。

菌株活化：将黄斑病病原菌菌株置于-80℃冰箱长久保存，接种前取出部分-80℃保存的菌种，置于液体NB培养基中，28℃、180rpm/min震荡培养48小时获得菌液后，将菌液离心(5000rpm/min，2min)，收集沉淀获得菌体，用无菌水稀释至1x10⁸个/ml，获得接种细菌悬浮液，备用。

3、秀珍菇出菇及病原菌接种方法

选择子实体多、整齐健康的菌棒进行后续病原菌接种试验，每个品种接种的菌棒数不小于10个。子实体菌盖大小为0.5-1.0cm时接种(图4)，太大不易发病(图6)，太小接种病原菌后子实体容易直接萎蔫死掉，无法长大(图7)。用无菌的毛刷蘸取病原菌悬浮液，均匀涂抹在秀珍菇子实体上进行接种，每个菌棒涂抹5ml菌液。接种完后将菌棒移至一密封保鲜盒内卧式分层摆放(菌棒在盒内距离盒壁3-8cm为宜，出菇这一面距离盒壁10-20cm为宜，距离太小影响出菇，使子实体无法完全展开，太大不能保持保鲜盒内的高CO₂浓度，导致子实体难以发病)。保鲜盒保持温度25-30℃，湿度85％-100％。48h后取出菌棒，进行拍照(图5)，计算每个菌棒发病子实体的数量(无论菌盖还是菌柄，只要有症状都算发病)，根据发病率进行分级，计算病情指数。

4、病害等级分级标准

计算每个菌棒上发病子实体及子实体总数量，两者相除获得单个菌棒的发病率，根据发病率对菌棒分别进行分级。分级标准如下：

5、不同品种病情指数的计算

病情指数＝(n₀*0+n₁*1+n₃*3+n₅*5+n₇*7)*100/(N*7)。

N代表菌棒总数量，n代表每个发病等级的菌棒数量，0、1、3、5、7代表病害等级。

6、根据病情指数对不同品种秀珍菇黄斑病抗性进行分类，标准如下：

7、不同品种秀珍菇黄斑病抗性水平统计

如表1所示。

表1不同品种秀珍菇黄斑病抗性水平统计

由上表结果可以看出，黄斑病病原菌均可侵染以上各品种秀珍菇材料，并导致植株发病。结果证实了秀珍12确实为高抗黄斑病品种，与实际种植经验一致。因此，本发明利用子实体接种鉴定评价秀珍菇黄斑病抗性水平的方法可以准确的鉴定不同品种秀珍菇的黄斑病抗性水平，结果可靠，对推动秀珍菇黄斑病抗病品种的选育工作具有重要意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。