阅读说明：本技术 人源已糖激酶2小分子抑制剂及其应用 (Human hexokinase 2 small molecule inhibitor and application thereof ) 是由 刘焕香 谈硕彦 袁苗苗 刘瑞娟 郭婧筠 彭立增 姚小军 于 2020-03-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种以人源已糖激酶2为靶点的小分子抑制剂及其应用,属于制药技术领域。本发明将已糖激酶2作为受体,选取其抑制剂结合口袋,利用Glide程序进行分子对接,从160多万个化合物中虚拟筛选得到靶向人源已糖激酶2的小分子抑制剂LY2019-001,并进行酶活抑制实验和MTT细胞增值抑制实验,验证了化合物LY2019-001对已糖激酶2的抑制作用以及对宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2及肺癌细胞A549的生长抑制作用。所发现的小分子及其药用盐可以为治疗已糖激酶2有关的疾病,例如肝癌、肺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的新药研发提供基础。本发明的先导化合物可进行进一步的结构优化,具有较好的应用前景。(The invention provides a small molecule inhibitor taking human hexokinase 2 as a target point and application thereof, belonging to the technical field of pharmacy. The invention takes hexokinase 2 as a receptor, selects an inhibitor binding pocket thereof, utilizes a Glide program to carry out molecular docking, virtually screens more than 160 ten thousand compounds to obtain a small molecular inhibitor LY2019-001 targeting human hexokinase 2, carries out an enzyme activity inhibition experiment and an MTT cell proliferation inhibition experiment, and verifies the inhibition effect of the compound LY2019-001 on hexokinase 2 and the growth inhibition effect on cervical cancer cells HeLa, liver cancer cells HepG2 and lung cancer cells A549. The found small molecules and medicinal salts thereof can provide a basis for the development of new drugs for treating diseases related to hexokinase 2, such as liver cancer, lung cancer, endometrial cancer, breast cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer or prostate cancer. The lead compound can be further structurally optimized, and has a good application prospect.)

人源已糖激酶2小分子抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生化制药技术领域，具体涉及以已糖激酶2(HK2)为靶点的抑制人已糖激酶2活性的小分子抑制剂的发现，并探讨了发现的小分子抑制剂对宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2及肺癌细胞 A549的生长抑制作用。

背景技术

早在二十世纪初，Warburg等发现与大多数细胞不同，即使在氧供充足的条件下，肿瘤细胞也更多选择将丙酮酸直接转化成乳酸(即糖酵解途径)作为主要产能方式，尤其是在那种生长比较迅速的恶性肿瘤细胞，糖酵解呈现出的比率更高，这种现象被称为“Warburg效应”。己糖激酶(Hexokinase， HK)是催化糖酵解途径第一步的限速酶，它催化ATP上的磷酸转移至葡萄糖，并使其转化成6-磷酸葡萄糖，是不可逆反应。哺乳动物组织中含有四种己糖激酶的亚型，即己糖激酶1-4。正常组织中己糖激酶的表达很低，其分布也有组织差异。HK1主要分布于脑组织中；HK2则主要存在于脂肪及骨骼肌组织中；HK3仅少量存在于肝、肾和肠等组织中；HK4(即葡萄糖激酶GK)仅存在于肝和胰等组织中，并可使葡萄糖以外的己糖磷酸化。但是在恶性肿瘤细胞中己糖激酶表达明显增高，并且增高的己糖激酶中以HK2为主(John E Wilson等人.J Exp Biol,2003,206(Pt 12),2049-57)。研究发现HK2在多种人肿瘤组织、肿瘤细胞，肿瘤模型和快速增殖细胞(如胚胎细胞)中存在高表达。肿瘤线粒体外膜结合的HK的活性越高,则肿瘤糖酵解的速度就越高(Bustamante E等人.J BiolChem,1981,256(16): 8699-8704.)。若抑制该酶的活性,则抑制了肿瘤细胞的糖酵解,使肿瘤细胞不能获得足够的6-磷酸葡萄糖，达到治疗恶性肿瘤的目的。

尽管HK2是潜在的癌症治疗靶标，但几乎没有发现有效的HK2抑制剂。如今，二甲双胍(Met)， 2-脱氧葡萄糖(2-DG)和3-溴丙酮酸(3-BrPA)是最常见的HK2抑制剂。但是均存在治疗活性低，不稳定，有明显的不良反应等缺点(Salani B等人.Sci Rep-UK.2013,3:2070.)，仍然需要发现改良的新型HK2抑制剂。

虚拟筛选(virtual screening)是开发新药中常用的方法，该方法通过选择小分子数据库进行计算法筛选出可能有治疗效用的化学分子，研究它们与药物靶点的结合作用，最终选择相互作用约束力排名最高的化合物作为先导化合物并用于下一步的研究。与实体的药物筛选方法相比，虚拟筛选使用计算机具有明显的优势，可以更快，更经济地找到候选新药物，降低了药物筛选的成本，缩短了新药研发周期。

发明内容

本发明的目的是提供靶向人已糖激酶2的先导化合物及其药用盐在制备已糖激酶2抑制剂中的应用。其中所述的已糖激酶2介导的疾病包括下列癌症：肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌。

本发明在对靶标已糖激酶2抑制剂结合口袋的研究基础上，筛选得到具有新结构实体的靶向人已糖激酶2的小分子抑制剂LY2019-001。

本发明通过基于已糖激酶2蛋白结构的虚拟筛选，通过利宾斯基规则筛选、打分函数评分、对人已糖激酶2活性的抑制实验和MTT法检测化合物对细胞增殖的抑制作用等多因素综合分析，最终获得了具有药理活性的靶向人已糖激酶2的活性化合物LY2019-001。

本发明的化合物LY2019-001经酶水平和细胞水平实验证实，在体外有抑制人已糖激酶2活性效果(IC50＝17.5μM)，且对宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2及肺癌细胞A549的生长有抑制作用(IC50 分别为62.1μM、62.5μM、54.6μM)。本发明的化合物LY2019-001可进一步的结构优化，制备治疗已糖激酶2蛋白相关疾病(包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌)的制剂或药物。

本发明的靶向人已糖激酶2蛋白的化合物的优点有：

1、具有靶向已糖激酶2蛋白，抑制已糖激酶2活性的作用；

2、对宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2及肺癌细胞A549的生长有抑制作用

3、所述的化合物LY2019-001及其药用盐衍生物可用于制备以已糖激酶2蛋白为靶标的疾病(包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌)的制剂或药物；

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的靶向人已糖激酶2的化合物进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为本发明的化合物LY2019-001的化学结构式。

图2为小分子化合物LY2019-001在蛋白水平上对已糖激酶2活性的抑制作用。

具体实施方式

实施例1

1、小分子化合物LY2019-001的高通量虚拟筛选方法

(1)基于分子对接的虚拟筛选

从蛋白质结构数据库PDB下载己糖激酶2的晶体结构(PDB code：5HEX)，对结构进行优化、加电荷与氢原子，选取其抑制剂结合口袋，利用薛定谔软件的Glide模块，从Chemdiv和specs两个化合物数据库提供的的130多万个化合物中进行基于分子对接的高通量虚拟筛选。最终Chemdiv数据库保留49个化合物，Specs数据库保留13个，共62个化合物(见下列结构式)用于下一步酶水平活性抑制实验。

2、虚拟筛选得到的62个小分子化合物对已糖激酶2活性的抑制效果

使用己糖激酶-II抑制剂筛选试剂盒(Abcam)对62个小分子化合物进行酶水平抑制实验，发现了小分子化合物LY2019-001对已糖激酶2有良好的激酶活性抑制作用(如图2)，小分子化合物 LY2019-001抑制已糖激酶2的半数有效抑制浓度为17.5μM。

3、MTT实验测定小分子化合物对细胞生长抑制作用

利用MTT实验测定小分子化合物LY2019-001对多种癌细胞的生长抑制作用，发现小分子化合物 LY2019-001对宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2及肺癌细胞A549的生长抑制的半数有效抑制浓度分别为62.1μM、62.5μM、54.6μM。