一种荞麦灰斑病抗性鉴定方法
阅读说明：本技术 一种荞麦灰斑病抗性鉴定方法 (Resistance identification method for gray leaf spot of buckwheat ) 是由 卢文洁 王莉花 王艳青 尹桂芳 孙道旺 于 2021-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种荞麦灰斑病抗性鉴定方法,包括以下步骤：1)选取健康的活体荞麦植株,用灭菌针头刺伤叶片表面,无菌水喷雾湿润针刺点,将荞麦灰斑病病原菌圆形菌饼接种于叶片针刺点,得接种植株；2)将接种植株在温室内进行培养,培养完成后观察记录接种植株的叶片病斑侵染情况；3)根据病斑扩展情况进行分级,根据所属的级别计算叶片的病情指数,进行抗性评价。本发明所提供的鉴定方法操作便捷、高效、准确、稳定,可应用于大批量荞麦种质资源材料的抗病性鉴定。(The invention relates to a resistance identification method for gray leaf spot of buckwheat, which comprises the following steps: 1) selecting healthy living buckwheat plants, stabbing the surfaces of leaves by using a sterilizing needle, spraying sterile water to wet the stabbed points, and inoculating the circular cakes of the pathogenic bacteria of the gray leaf spot of the buckwheat to the stabbed points of the leaves to obtain inoculated plants; 2) culturing the inoculated plant in a greenhouse, and observing and recording the infected condition of the leaf spots of the inoculated plant after the culture is finished; 3) grading according to the extension condition of the lesion spots, calculating the disease index of the leaves according to the grade of the lesion spots, and evaluating the resistance. The identification method provided by the invention is convenient, efficient, accurate and stable to operate, and can be applied to the disease resistance identification of large-batch buckwheat germplasm resource materials.)
技术领域
本发明涉及一种农作物病害抗性鉴定方法，具体涉及一种荞麦灰斑病抗性鉴定方法。
背景技术
荞麦灰斑病是由小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)引起的一种真菌病害。荞麦灰斑病主要侵染危害叶片，发病初期，叶片上的病斑为圆形或近圆形，病斑中央向下凹陷，病斑边缘稍稍隆起，且病健交界处有明显的黄色晕圈。随着病情发展，病斑逐渐向周围扩大，变成椭圆形或者长圆形病斑，严重时病斑相互联结在一起，形成不规则的大病斑，造成叶片干枯脱落。目前，荞麦灰斑病已成为严重影响荞麦生产的主要病害之一。因此，荞麦灰斑病的有效防控已成为荞麦产业持续稳定发展的关键。
利用抗病品种是荞麦灰斑病最经济有效的防控措施。当前，尚无荞麦灰斑病抗性鉴定方法及抗病性的荞麦种质资源，严重制约了荞麦灰斑病抗病性品种的选育。因此，当前研究建立荞麦灰斑病的抗性鉴定方法成为筛选抗病种质资源和选育抗病品种的关键。操作便捷、高效、准确、稳定的荞麦灰斑病抗性鉴定方法，可为筛选抗病性荞麦种质资源及抗病育种研究提供重要的技术支撑，并为有效防控荞麦灰斑病提供重要的研究基础。
发明内容
为了达到对未知荞麦品种所携带的灰斑病抗性进行快速的判断，迫切需要一种普适性强、准确性高，不随荞麦品种迁移的病原菌抗性鉴定方法以及配套的抗性评价体系。荞麦灰斑病病原菌小孢拟盘多毛孢主要通过侵染荞麦叶片，使植株叶片感染发病，发病严重时导致植株叶片病斑连片，多雨或干旱条件下，叶片腐烂或干枯脱落，影响植株结实率低，使荞麦产量损失严重。
本发明的目的是提供一种荞麦灰斑病抗性的鉴定方法，包括：
选取生长至15-18天的健康荞麦植株，刺伤荞麦叶片表面，将灰斑病病原菌接种至叶片刺伤处，接种培养10-14天后观察荞麦叶片病斑侵染情况。
在本发明提供的鉴定方法中，所述刺伤包括，使用针头避开叶脉，刺伤叶表，不刺穿叶片。本发明提供的刺伤方法有利于病原菌的孢子从刺伤的伤口侵染叶片，加快接种叶片发病。
在本发明提供的鉴定方法中，接种所用病原菌为在PDA培养基25℃恒温黑暗活化培养后的灰斑病病原菌圆形菌饼；
优选地，所述菌饼为直径5mm的圆形菌饼。
本发明提供的鉴定方法，在接种36h后去掉病原菌菌饼。
在本发明提供的鉴定方法中，所述接种培养为：将接种病原菌后的荞麦植株，在温度25-28℃、相对湿度75-90％的条件下培养。
在本发明提供的鉴定方法中，根据病斑侵染情况进行分级，根据分级情况计算荞麦的病情指数，根据病情指数进行抗性评价。
荞麦的不同生长阶段、病原菌的侵染时间长短，使得荞麦在被病原菌侵染后，表现出的病斑大小差别很大。本发明经过长期的实验探究，确定了15-18天荞麦叶片在接种病原菌10-14天后表现出的侵染情况，是稳定且可准确反映荞麦植株整体抗性能力的，并根据稳定的病斑大小制定了荞麦叶片灰斑病的发病等级。
在本发明提供的鉴定方法中，根据病斑的大小划分发病等级包括：
0级：无病斑，未发病；
1级：病斑直径为0.01-0.50mm；
3级：病斑直径为0.51-2.00mm；
5级：病斑直径为2.01-4.00mm；
7级：病斑直径为4.01-6.00mm；
9级：病斑直径≥6.01mm。
在本发明提供的鉴定方法中，抗性等级的确定包括：
(1)根据发病等级计算得到病情指数，
(2)根据病情指数划分抗性等级，
高抗：病情指数≤25；
中抗：25<病情指数≤40；
中感：40<病情指数≤55；
高感：病情指数＞55。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述的鉴定方法在荞麦种质资源创新、提高荞麦产量中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
(1)本发明选择在15-18天的荞麦植株，进行叶片病原菌接种及鉴定，在节省鉴定时间的同时，获得了最精确的荞麦植株抗性结果。
(2)本发明在接种10-14天后，观察记录叶片的病斑侵染情况，此时，所获得的侵染结果最能反映荞麦植株的抗性水平。
(3)本发明所述的方法直接将病原菌的菌饼接种于荞麦叶片的针刺部位即可，操作简单，发病快，成本低，效率高。
(4)本发明根据灰斑病病原菌在不同荞麦品种叶片上的生长特性，采用相对级数值0、1、3、5、7、9共9级6个不同水平对接种叶片的病斑直径进行分级，并计算病情指数，根据严重度判别抗病性；本发明提供的病害分级是根据调查的病斑直径数据在Excel系统下进行排序，以无症状对应的样品的部位严重度指标设置为0级，其余数据自低至高的连续读取数值分割为5段，各段分别代表一个病害严重度级别，即0、1、3、5、7、9共9级6个不同水平进行分级；本发明根据不同级别的叶片感染程度计算病情指数，数据采用SPSS19.0统计软件进行显著性分析，根据显著性确定病害抗感病情指数的划分。结果证实采用本发明确定的测评方法可准确地对荞麦的抗性进行评价。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例是采用本发明提供的抗性鉴定方法，进行荞麦灰斑病抗性的具体评价实例。
试验以在田间分别表现为高抗的荞麦材料米黑10号，中抗的荞麦材料米棕5号，中感的荞麦材料ZY81，高感的荞麦材料ZY57为供试材料。荞麦材料种子由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所作物种质资源保存中心提供。
灰斑病病原菌菌株及来源：灰斑病病原菌的强致病性菌株HM-12，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所荞麦病害课题组提供。
本实施例中，抗性鉴定方法的步骤如下：
(1)在荞麦植株生长至15-18天，选取荞麦植株相对一致的健康叶片，用灭菌针头轻轻刺伤叶表，避开叶脉，但不刺穿叶片，用无菌水喷雾湿润刺伤部位。
(2)将荞麦灰斑病的病原菌移植至PDA培养基平板25℃恒温黑暗活化培养5天，用直径大小为5mm的打孔器于菌落边缘打孔取圆形菌饼，备用。
(3)用灭菌接种针挑取菌圆形饼于叶片刺伤点进行接种，接种36h后取掉菌饼。
(4)将所述接种植株在温度为25-28℃、相对湿度为75-90％左右的温室内进行培养，培养10-14天后观察记录荞麦叶片病斑侵染情况。
(5)根据病斑扩展直径进行分级，根据所属的级别计算叶片的病情指数，进行抗性评价(见表1)，荞麦灰斑病发病等级划分标准和抗性等级划分标准如下：
发病等级划分标准：
A、根据病斑的大小划分发病等级：
0级：无病斑，未发病；
1级：病斑直径为0.01-0.50mm；
3级：病斑直径为0.51-2.00mm；
5级：病斑直径为2.01-4.00mm；
7级：病斑直径为4.01-6.00mm；
9级：病斑直径≥6.01mm。
B、将所述发病等级带入病情指数计算公式，得病情指数：
C、根据以病情指数划分的抗性等级，鉴定所述荞麦的抗性；
所述抗性等级的划分标准为：
高抗(HR)：病情指数≤25；
中抗(MR)：25<病情指数≤40；
中感(MS)：40<病情指数≤55；
高感(HS)：病情指数＞55。
表1供试荞麦材料灰斑病病原菌人工接种抗性鉴定结果
*：病斑直径和病情指数均为5个重复的平均值。
由以上结果可以看出，对于田间表现抗感的荞麦材料，通过抗性鉴定试验，其抗性鉴定结果与已知的实际情况相吻合。
实施例2
本实施例采用与实施例1相同的灰斑病抗性鉴定的方法，对ZY57、ZY26、云荞2号、ZY81、米棕5号、米黑10号、灰苦9号进行灰斑病抗性鉴定。
本实施例的抗性鉴定步骤如下：
由一个实验人员采用阿拉伯数字对7个不同荞麦材料的健康植株进行编号后，将只带有编号的植株交给另外一个实验人员，按照与实施例1相同的方法进行实验。待实验结束后，对照编号查材料名称。结果显示，7个不同荞麦材料对灰斑病的抗性表现差异明显，而且7个不同荞麦材料ZY57、ZY26、云荞2号、ZY81、米棕5号、米黑10号、灰苦9号的抗性结果与大田中实际表现的结果一致(见表2)。抗性鉴定验证试验再次证实，抗性鉴定结果与已知的实际情况相吻合。因此，验证了此方法可用于荞麦灰斑病的抗性快速鉴定。
表2不同荞麦材料灰斑病病原菌人工接种抗性鉴定结果
症状
材料编号
病斑直径(mm)*
病情指数*
抗性类型
品种名称
有病斑
1
6.25
64.07
HS
ZY26
有病斑
2
2.33
32.51
MR
米棕5号
有病斑
3
3.75
48.06
MS
云荞2号
有病斑
4
1.85
23.45
HR
米黑10
有病斑
5
4.95
50.49
MS
ZY81
有病斑
6
3.92
29.18
MR
灰苦9号
有病斑
7
5.74
62.37
HS
ZY57
*：病斑直径和病情指数均为5个重复的平均值。
由此可见，本发明的抗性鉴定方法具有操作简单、准确、高效、稳定，检测周期短等优点，适合对大批量材料进行快速的抗病性鉴定，具有广阔的应用前景。
对比例1采用不同生长时期的荞麦植株
以在田间分别表现为高抗的荞麦材料米黑10号，中抗的荞麦材料米棕5号，中感的荞麦材料ZY81，高感的荞麦材料ZY57作为供试材料。选取不同生长时期的米黑10号、米棕5号、ZY81和ZY57接种灰病斑病原菌，接种培养12天后观察病斑扩展情况(见表3)。
通过实验可看出，生长5天的荞麦植株只有2片子叶，未长出真叶，不宜接种。生长10天的荞麦植株已长出2片真叶，但叶片小且幼嫩，无法承载病原菌菌饼，叶柄易折断。生长15天、18天的荞麦植株，已有2-3片真叶，叶片大小适中，能够接种病原菌菌饼，且接种后病原菌侵染快，叶片发病快，病斑明显。生长20天的荞麦植株，荞麦叶片较大，接种后病原菌侵染发病较慢，病斑扩展较慢。生长25天的荞麦植株，荞麦叶片宽大，接种后病原菌侵染发病慢，病斑扩展慢。因此，从实验结果可看出，生长15天、18天的荞麦植株叶片最适宜接种，能在节省鉴定时间的基础上，获得更准确的抗性水平。
表3供试材料不同生长期人工接种灰斑病病原菌12天后的病斑直径
*：病斑直径为5个重复的平均值。
对比例2观察时期不同
以在田间分别表现为高抗的荞麦材料米黑10号，中抗的荞麦材料米棕5号，中感的荞麦材料ZY81，高感的荞麦材料ZY57作为供试材料。在供试材料生长至16天，对植株叶片接种荞麦会病斑病原菌，分别在接种培养2天、5天、10天、12天、14天、16天、20天、25天观察接种症状。
表4结果显示，接种培养2天，四种供试材料的接种点均未出现症状。接种5天后调查发现，高抗的荞麦材料米黑10号和中抗的荞麦材料米棕5号接种点出现褪色症状，中感的荞麦材料ZY81和高感的荞麦材料ZY57接种点仅出现微小病斑。接种10天、12天、14天调查发现，四种供试材料病斑均逐渐扩大，且不同材料间的病斑差异明显。在接种16天、20天、25天后发现，高抗的荞麦材料米黑10号和中抗材料米棕5号的病斑直径基本无变化，中感的荞麦材料ZY81和高感的荞麦材料ZY57的病斑直径仅有微小增加。因此在接种病原菌后，观察的最佳时间为接种培养10天、12天、14天，在此观察期间，供试材料病斑基本稳定，无明显变化，不仅从症状上能够很好的区分效果，而且能够获得更准确的抗性水平。
表4供试材料人工接种灰斑病病原菌后不同观察时间的病斑直径
*：病斑直径为5个重复的平均值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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