下调ythdf2蛋白表达的物质及其应用
阅读说明：本技术 下调ythdf2蛋白表达的物质及其应用 (Substance for down-regulating YTHDF2 protein expression and application thereof ) 是由 季勇 仲艳青 游黛婷 李雪松 于 2021-01-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种下调YTHDF2蛋白表达的物质及其应用；该下调YTHDF2蛋白表达的物质包括基于YTHDF2的小干扰RNA或YTHDF2shRNA的内皮特异性腺相关病毒,可应用于制备治疗心血管疾病药物；本发明开拓了动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物制备的新方法,对于动脉粥样硬化相关血管疾病的防治提供了新的方向。(The invention relates to the technical field of genetic engineering, in particular to a substance for down-regulating YTHDF2 protein expression and application thereof; the substance for down-regulating YTHDF2 protein expression comprises small interfering RNA based on YTHDF2 or endothelial specific gonadal related virus of YTHDF2shRNA, and can be applied to the preparation of drugs for treating cardiovascular diseases; the invention develops a new method for preparing the medicament for preventing and treating the atherosclerosis related vascular diseases and provides a new direction for preventing and treating the atherosclerosis related vascular diseases.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是一种下调YTHDF2蛋白表达的物质及其在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
背景技术
心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是目前全球威胁人类健康最严重的疾病。心血管疾病可由多种因素引起，一些不良的生活习惯(吸烟、嗜酒、缺乏体育锻炼)，以及糖尿病、高血压、高胆固醇等一些慢性疾病。在多种心血管疾病中，动脉粥样硬化是其共同的病理生理学过程。
动脉粥样硬化是一种由脂质潴留在动脉壁形成以斑块为特征的慢性血管炎性疾病，许多研究发现血管内皮损伤是其形成的始动因素。血管内皮细胞(Endothelial cell,EC)是一层连续覆盖在血管腔内表面的扁平鳞状细胞，对血管内皮功能起着重要的调控作用。当存在糖尿病、血脂和血流动力学异常等刺激时，EC受损发生功能紊乱(Endothelialcell dysfunction,ECD)，包括局部渗透增强、俘获和修饰循环血中的脂蛋白颗粒、选择性募集单核细胞进入内膜下分化成巨噬细胞并将修饰的脂蛋白内化成为泡沫细胞，同时，诱导相邻的平滑肌细胞增殖和迁移覆盖在坏死核心表面形成斑块。随着斑块内炎症环境的加剧和纤维帽的降解，最终斑块破裂，引发严重的CVD事件。
N6-甲基腺苷(m6A)作为一种转录后表位剪切修饰，是真核生物的信使RNA(mRNA)中最丰富的修饰之一。甲基转移酶复合物(METTL3,METTL14,WTAP和KIAA1429)可以增加mRNA的m6A修饰，去甲基酶(FTO和ALKBH5)可以降低mRNA的m6A修饰，同时，这些发生m6A修饰的mRNA可被识别蛋白(YTHDF1-3,YTHDC1-2，和HNRNP家族蛋白)识别和结合。m6A甲基化的不同转录后结果依赖于其识别蛋白。YTHDF2(YTH domain family 2)是最有效的m6A阅读器，通过识别含有m6A的mRNA并将其分配到加工体，削弱了mRNA的稳定性。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)指的是，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰(RNAi)途径内操作。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。
目前，已有文献报道YTHDF2在肿瘤、造血干细胞(HSCs)内环境稳定和造血再生的调节中发挥作用，然而，YTHDF2在心血管疾病中的作用及其机制目前尚未有任何相关的研究和报道。
发明内容
针对上述问题，本申请提供一种下调YTHDF2蛋白表达的物质及其在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
首先，本申请提供了一种下调YTHDF2蛋白表达的物质，包括基于YTHDF2的小干扰RNA和YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒。
进一步而言，上述基于YTHDF2的小干扰RNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(5'-GUUCUGUUCUUGUACAUUAUA-3')，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(3'-CAAGACAAGAACAUGUAAUAU-5')。上述小干扰RNA是根据YTHDF2基因中一段21nt的靶序列GTTCTGTTCTTGTACATTATA(2494-2514)制备。YTHDF2的mRNA(Human)序列已由NCBI-Gene网站公开，其序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步而言，上述YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
其次，本申请还提供了下调YTHDF2蛋白表达的物质在制备治疗心血管疾病药物中的应用，特别是治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
与现有技术相比，本申请提供的下调YTHDF2蛋白表达的物质具有以下有益效果：
(1)该下调YTHDF2蛋白表达的物质(包括小干扰RNA及YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒)以YTHDF2作为抑制炎症的靶标，具有调控炎症信号通路的功能；且易合成，成本低，对YTHDF2特异性好，可以特异性的抑制YTHDF2的表达，从而调控炎症信号通路，达到抑制炎症的效果。
(2)依据该下调YTHDF2蛋白表达的物质制备的药物能够有效抑制心血管病，对于开发新的抗动脉粥样硬化药物具有重要指导作用，具有巨大的社会效益和经济价值。
附图说明
图1为YTHDF2在正常人(non-CAD)和动脉粥样硬化病人(CAD)的主动脉组织中的蛋白表达水平示意图；检测方法为提取正常人和动脉粥样硬化病人主动脉组织中的蛋白后，用Western Blot检测YTHDF2的表达；
其中图1A为Western Blot检测结果示意图，图1B为统计学结果示意图，**P<0.01。
图2为正常(NC)和高脂饮食(HFD)Apoe-/-小鼠主动脉中的YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的mRNA表达水平示意图：实验方法为提取给予正常和高脂饮食的Apoe-/-小鼠主动脉组织中的mRNA后，用qRT-PCR检测YTHDF2相关mRNA的表达，***P<0.001。
图3为YTHDF2在给予正常(NC)和高脂饮食(HFD)Apoe-/-小鼠主动脉中的蛋白表达水平：提取给予正常和高脂饮食的Apoe-/-小鼠主动脉组织中的蛋白后，用Western Blot检测YTHDF2的表达；
其中图3A为Western Blot检测结果示意图，图3B为统计学结果示意图，*P<0.05。
图4为HUVECs给予ox-LDL(100μg/mL)刺激后的YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的mRNA表达水平示意图；检测方法为提取给予对照和ox-LDL刺激后HUVECs mRNA，用qRT-PCR检测YTHDF2相关mRNA的表达。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图5为YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3在HUVECs给予ox-LDL(100μg/mL)刺激后的蛋白表达水平检测结果示意图：检测方法为提取给予对照和ox-LDL刺激后HUVECs蛋白，用Western Blot检测YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的表达；
其中图5A为Western Blot检测结果示意图，图5B为统计学结果示意图，*P<0.05，***P<0.001。
图6为YTHDF2在给予正常和高脂饮食Apoe-/-小鼠主动脉组织切片中的表达水平免疫荧光检测照片：
检测方法为提取给予正常(NC)和高脂饮食(HFD)的Apoe-/-小鼠主动脉组织后进行OCT包埋，冰冻切片后，用免疫荧光检测YTHDF2的表达图片；其中，A(红色)为CD31，C(绿色)为YTHDF2，B(蓝色)为细胞核(DAPI)，箭头所示为YTHDF2和CD31共定位黄色区域。
图7为小干扰RNA检测效率示意图；检测方法为HUVECs转染YTHDF2小干扰RNA后，通过Western Blot检测YTHDF2的干扰效率。
图8为ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平检测结果示意图；
检测方法为HUVECs转染siYTHDF2，给与ox-LDL(100μg/mL)刺激24小时，qRT-PCR检测ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平。***P<0.001。
图9为Western Blot检测ICAM-1蛋白表达水平结果示意图；
检测方法为HUVECs转染siYTHDF2，给与ox-LDL(100μg/mL)刺激24小时，WesternBlot检测ICAM-1蛋白表达水平；
其中图9A为Western Blot检测结果示意图，图9B为统计学结果示意图，*P<0.05，**P<0.01。
图10为Western Blot检测VCAM-1蛋白表达水平结果示意图；
检测方法为HUVECs转染siYTHDF2，给与ox-LDL(100μg/mL)刺激24小时，WesternBlot检测VCAM-1蛋白表达水平；
其中图10A为Western Blot检测结果示意图，图10B为统计学结果示意图，**P<0.01，***P<0.001。
图11为红色荧光染料Dil染色后荧光检测图片；
检测方法为HUVECs转染siYTHDF2，给与ox-LDL(100μg/mL)刺激24小时，与用活细胞细胞膜红色荧光染料Dil(2.5mg/mL)标记的人外周血单核细胞THP1共培养1小时，通过倒置荧光显微镜观察单核细胞与内皮细胞黏附情况。图12为小鼠血管组织ICAM-1、VCAM-1的mRNA检测结果示意图；
检测方法选取8周龄雄性Apoe-/-小鼠，尾静脉注射表达空载及YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒(AAVendo)，2周后再给予正常饲料(对照组)或高脂饮食喂养(AS动物模型组)，16周后，通过qRT-PCR实验检测小鼠血管组织中炎症因子的表达水平；***P<0.001。
图13为小鼠主动脉血管HE染色检测结果图片；
检测为选取8周龄雄性Apoe-/-小鼠，尾静脉注射表达空载及YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒(AAVendo)，2周后再给予正常饲料(对照组)或高脂饮食喂养(AS动物模型组)，16周后收取其主动脉血管，HE染色检测斑块面积大小。
具体实施方式
以下实施例涉及的细胞、试剂来源：
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)：由南京市妇幼保健院提供。
人急性单核细胞细胞系(THP1)：购于上海生科院细胞所，来源为American TypeTissue Culture Collection(ATCC)。
Apoe-/-小鼠：购于维通利华实验动物技术有限公司。
正常人和CAD病人的血管组织由南京市鼓楼医院提供。
YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒(AAVendo)合成于苏州吉脉基因药物生物科技有限公司。
以下实施例所涉及的细胞实验均经过南京医科大学伦理委员会的批准。
实施例1 YTHDF2蛋白表达与动脉粥样相关性检测
为了探索在正常人主动脉组织中和动脉粥样硬化病人的主动脉中YTHDF2是否参与了主动脉的病变，首先利用Western Blot检测YTHDF2蛋白表达水平。
Western-Blot检测方法如下：
(1)SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶)电泳：配制12％的分离胶和3％的浓缩胶。取15μL样品液和3μL 6×加样缓冲液，混匀。煮沸5分钟使蛋白变性后上样，每孔上样量约为30μg。110V恒压电泳约90分钟，至溴酚蓝完全消失。
SDS-PAGE的配制如下：
(2)转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液(3.6g/L Tris，300mL/L甲醇，17.3g/L甘氨酸)中平衡10～20分钟。用湿转的方法将蛋白条带转移至PVDF膜上(SDS-凝胶位于负极，PVDF膜位于正极)，0.3A恒流电泳80分钟。
(3)封闭：转膜结束后，取下PVDF膜，PBS浸泡5分钟后将膜浸于含5％脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1小时。
(4)一抗孵育：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入抗体，4℃摇动下过夜。
(5)二抗结合：TBS-T(TBS中加入Tween-20，浓度为0.05％)快速洗膜一遍后，TBS-T洗膜10分钟×3遍。加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊第二抗体(购自Sigma-Aldrich公司，1％MPBS 1:2000稀释)，室温下孵育1小时。TBS-T快速洗膜一遍，再洗膜10分钟×3遍。
(6)ECL显色：临用前将ECL显色液A与B混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，观察结果。
上述检测方法为本领域常规方法，也可以参见文献“Xie L,et al.AntioxidRedox Signal.2016,20；24(6):329-343；Xi H,et al.Circ Res.2016；118(10):1525-39.”)中所公开的步骤。
本实施例检测结果如图1所示，可见，与正常人主动脉组织相比，动脉粥样硬化病人(CAD)的主动脉组织中YTHDF2的蛋白表达水平明显升高(图1A)，在图1B的统计学结果中，**P<0.01。
为了进一步明确YTHDF2蛋白在动脉粥样硬化中的作用，再利用Apoe-/-小鼠分别给予(SPF级)正常饮食(对照组，NC)及高胆固醇饮食(D12108C，实验组，HFD)(喂食方法参见文献“Cheng WL,et al.Br J Pharmacol.2015；172(23):5676-89”)，构建小鼠的动脉粥样硬化模型，16周后提取小鼠主动脉血管组织，利用qRT-PCR检测YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的mRNA表达水平(实验方法参见文献”Liu Z,et al.Br JPharmacol.2013Aug；169(8):1795-809”)及Western Blot检测YTHDF2蛋白表达水平，检测结果如图2和图3所示。可见，与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠主动脉组织中YTHDF2的mRNA(图2)和蛋白(图3)表达水平都明显升高。
在细胞上水平，培养HUVECs细胞(实验方法参见文献“Xie L,et al.Br JPharmacol.2012；165(3):754-64.”)，实验组加入ox-LDL(氧化低密度脂蛋白，100μg/mL)刺激24小时引起内皮细胞损伤，构建内皮细胞损伤模型，同时以加入等量PBS组作为对照组(control)，利用qRT-PCR检测细胞中YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的mRNA表达水平及Western Blot检测YTHDF2蛋白表达水平。
qRT-PCR检测步骤如下：
(1)样本(步骤1获得的内皮细胞)加入1mL Trizol，充分吹打裂解后吸取至去RNA酶(RNAase Free)的离心管中，裂解5分钟。
(2)每个EP管内加入200μL的氯仿，剧烈振荡，斡旋数秒后，置于冰上裂解10分钟。
(3)离心，4℃，12000rpm，15分钟，小心吸取上层清液(500μL)转移至新的EP管中。
(4)加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10分钟。
(5)离心，4℃，12000rpm，15分钟，弃上清，加75％乙醇洗涤。
(6)离心，4℃，12000rpm，5分钟，弃上清，风干，加入适量的DEPC水(20～50μL)，检测RNA浓度。
(7)RNA的逆转录反应体系程序如下：
(8)引物设计：使用Primer Premier 5软件辅助设计引物，所有引物均由英潍捷基生物科技有限公司合成。
检测结果如图4和图5所示。可见，相比于对照组(control)，实验组(ox-LDL)能显著增加YTHDF2 mRNA(图4)和蛋白表达水平(图5)。
进一步，本实施例继续通过免疫荧光检测小鼠血管组织中CD31和YTHDF2蛋白表达水平(实验方法参见文献“Wang W,et al.Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.2019Jul1；1865(7):1793-1801”)。主动脉血管免疫荧光染色步骤如下：
(1)将冰冻切片(小鼠主动脉组织冰冻包埋切片)室温晾干20分钟。
(2)固定：二甲苯15分钟。
(3)PBS缓冲液洗片，每次8分钟，共3次。
(4)封闭：在组织上滴加含10％山羊血清的PBS中，室温放置1小时，甩去液体。
(5)在组织上滴加一抗，4℃冰箱过夜。
(6)PBS缓冲液洗片，每次10分钟，共3次。
(7)滴加荧光素标记的二抗，37℃烘箱孵育30分钟。
(8)PBS缓冲液洗片，每次10分钟，共3次。
(9)滴加DAPI染色液，室温放置5分钟。
(10)封片。
检测结果如图6所示。可见，与正常饮食组(NC)相比，高脂饮食组(HFD)的小鼠血管组织中YTHDF2蛋白表达量升高。
以上实验结果提示：在动脉粥样硬化的细胞和动物模型中，YTHDF2蛋白表达水平都明显升高。
实施例2 si-YTHDF2干扰实验
为了进一步明确YTHDF2蛋白在动脉粥样硬化中的作用，本实施例向HUVECs中加入下调YTHDF2蛋白表达的物质，以验证下调YTHDF2蛋白与抑制动脉粥样硬化的相关性。
本实施例中使用下调YTHDF2蛋白表达的物质为YTHDF2的小干扰RNA(si-YTHDF2)，该小干扰RNA的正义链和反义链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
YTHDF2小干扰转染HUVECs具体步骤如下：将内皮细胞HUVECs种到6孔板上，过夜，待密度达到80％时，利用LipofectamineTMRNAiMAX(Invitrogen公司)转染试剂按照标准步骤将对照组和敲低YTHDF2的siRNA分别转染到HUVECs中，6小时后换成新鲜的含5％血清的ECM培养基，转染24小时后获得转染YTHDF2小干扰的内皮细胞，提取蛋白验证干扰效率。
上述转染方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“Xie L,et al.AntioxidRedox Signal.2016,20；24(6):329-343”公开的步骤。
HUVECs转染YTHDF2小干扰RNA后，通过Western Blot检测YTHDF2的干扰效率，同时设置Con、si-YTHDF2-2和si-YTHDF2-3作为对照组。si-YTHDF2-2正义链核苷酸序列如SEQID NO.5所示(5'-CGUCAAGGUCGUGGGAAAUAA-3')，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(3'-GCAGUUCCAGCACCCUUUAUU-5)；si-YTHDF2-3正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示(5'-CCGUUCCAUUAAGUAUAAUAU-3')，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示(3'-GGCAAGGUAAUUCAUAUUAUA-5')。该小干扰RNA的干扰效率如图7所示，GAPDH为内参，可见，si-YTHDF2组显示了明显的干扰效果。
HUVECs转染YTHDF2小干扰RNA后，分别检测ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表达水平，检测结果如图8-10所示。实验发现ox-LDL刺激后HUVECs中ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表达水平升高，YTHDF2蛋白被小干扰RNA敲低之后再给予ox-LDL，ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表达水平降低(图8-10)。
白细胞与内皮细胞黏附实验，具体步骤如下：
(1)将Dil(2.5μg/mL)加入准备好的人外周血单核细胞(THP1)中，在37℃孵育10分钟(避光)。
(2)将标记好的的THP1细胞等体积加入到已经处理好的HUVEC(内皮细胞)中，在37℃共孵育1小时(避光)。
(3)用预热的PBS洗3遍，洗去非特异性结合的THP1(避光)。
(4)在正置荧光显微镜下观察单核细胞与内皮细胞的黏附情况(避光)。
检测结果如图11所示，在ox-LDL作用下，转染YTHDF2小干扰RNA(siYTHDF2)后，单核细胞与内皮细胞的粘附相比于对照组(con)明显降低。
以上实验结果可以进一步证明：通过敲低YTHDF2蛋白能够有效抑制动脉粥样硬化的发生。
实施例3小鼠实验
本实施例通过向小鼠尾静脉注射下调YTHDF2蛋白表达的物质，以验证生物体内环境中下调YTHDF2蛋白与抑制动脉粥样硬化的相关性。
本实施例中使用下调YTHDF2蛋白表达的物质为YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒(AAVendo)，简称腺病毒shYTHDF2-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
选取8周龄雄性Apoe-/-小鼠，尾静脉注射表达空载及YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒(AAVendo)，2周后再给予正常饲料(对照组，NC)或高脂饮食喂养(AS动物模型组，HFD)，16周后，通过qRT-PCR实验检测小鼠血管组织中炎症因子的表达水平。
检测结果如图12所示，可见，给予YTHDF2 shRNA的内皮特异性腺相关病毒(AAVendo)能够抑制炎症因子的表达。
同时收取小鼠主动脉血管，HE染色检测主动脉血管斑块面积，步骤如下：
(1)将小鼠主动脉血管的石蜡切片放入65℃烘箱烘烤30分钟。
(2)脱蜡：二甲苯5分钟，共3次。100％乙醇1分钟。95％乙醇1分钟。70％乙醇1分钟。
(3)蒸馏水浸洗，至玻片上不挂水珠，甩尽切片上水分，苏木素染色5分钟。
(4)自来水浸洗，除去切片上的浮色。
(5)1％盐酸乙醇1-3秒。自来水洗涤数次。
(6)Scott液1分钟，自来水洗数次。甩尽水分，伊红染色，血管10秒。
(7)蒸馏水洗涤数下，洗去切片上浮色。70％乙醇迅速浸洗一下。95％乙醇迅速浸洗一下。100％乙醇浸洗30秒，共3次。
(8)二甲苯2分钟，共3次。二甲苯未干时用中性树胶封片。
检测结果如图13所示，发现内皮特异性敲低YTHDF2可有效缩小斑块面积。
以上的实验结果充分证明，YTHDF2参与动脉粥样硬化的进程。YTHDF2蛋白可以作为临床上治疗动脉粥样硬化的一个新的重要靶标，在动脉粥样硬化的防治中具有潜在的临床应用价值。通过转染下调YTHDF2蛋白表达的物质(YTHDF2的小干扰RNA或腺病毒)，可下调YTHDF2的蛋白表达，有效抑制动脉粥样硬化的发展。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 下调YTHDF2蛋白表达的物质及其应用
<141> 2021-01-13
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
guucuguucu uguacauuau a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagacaaga acauguaaua u 21
<210> 3
<211> 4078
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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aagacatagg acttaactgg aaaatggaaa aaaaaaagga aaaaaagaaa aagaaaaaac 2280
ctaaacaaaa attccctcta ggtagtttag gtaaaaaaat gtccctttta ttttggcttt 2340
ggttgtgatt cagagcataa tgctttggtt tttttttttg tttttttttt tttttttgtc 2400
tttttactct atttttcgga tttttaagtc cgtaagtgca tacaattttc tcttaatttt 2460
taaacccttt cctcccccat tttgacattt gcacttggag aacacttgag ttgcgcagat 2520
tttgggtgtc caccccagaa agtgggaatt tgatttttcc cttccgaact ggaagaaaat 2580
ttttatgaag aatttttgtc taggaaagtt taataacagt gttacccaag gttgtgtctg 2640
taagggtggc tcattttctc tgaccctttg ttactcaaag taaagtacta ggagtcctaa 2700
gaaatgttct gttcttgtgt attatactga ttaagtcagg attaatttga tttcaaagct 2760
aagaacagtg ataaaaactt gttttcagaa atgcattttg gaagagaaaa cattgtaaaa 2820
catgtagtga atgtttcttc agtttcttgt tcagccaatg aggaaagggc attgcctttc 2880
tttttcccat taatcacttc tcaataaacg tgagagcctg tcgagcatca ctccagtacc 2940
acttagtatt atttgagtct ctgtgtttgg ggagagattt tggagtctaa ggagttttga 3000
gaggtgacct agtgactcac tttagacagt ttgtgttaat ggccctgcat ggtgttgcat 3060
gcctgtaatc cttgcattta ggagacggga gcaggatgga tgaggtcaga ggttatcctc 3120
aggccagttg ggctacatga gaccctgtca acaaaaaggt tgtattggaa ggacattgct 3180
ttgtacccaa ggactagaaa cctgctgtga cgatattcat aatgcctgtt tctggttctt 3240
tatatagaga aaacacagca ctgctaaacc attcagcagt atttgtgtgt atggtgccag 3300
gtactgtgct aattccatag gaacctcacc ctgtaaaaag aggtggcacc cactatccca 3360
gtatgtaagt gtctgatcca gtatatggct gatttagaca gtatgcccca gagatgtagg 3420
tcccaaaaat gaaattctag tggaactcac agaggaattt gtttctttcc ctaaggctta 3480
attaaaaggc ttttctgctt tagagagtct ttactcttaa gatgtcctaa ttctagaggg 3540
ttaaatgttc aaaaactcta tactaagaga ttctggaaat aaagcttaat actgtggaca 3600
gtgttacact ggaatgcagg gccgtgctca cacagccaga ctgctaagaa aggcagctca 3660
gggatgctgg gatatcgctc agtcagccgg tgtgccctgc gccatcaagg aaaagcagtg 3720
ttggtttcta gcattgtagc cagcaaaggc acggcaaagg cttgtgcata tttgtttctg 3780
ccaagttttt ttttttttaa aggtttattt atgcatatga gcacgctctc ttcatgcaca 3840
ccagaagaga gcatcagatc ccattacaga tagctagctg tgagccacct tgtggtttcg 3900
gggaattgaa ctcagaatct ctggaagagc agtcagtgct cctgaccgct gagccactct 3960
ccagccacct ctgccaaact ttttattata aaatatatct tcaatattgg agttctcagt 4020
gtttttgtta gttggaatat acaaattttt tacatttaat taaaaaaaat gtatgtgc 4078
<210> 4
<211> 2719
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagcgtcgc cgagtcggag ccggagcctg agccgcgcgc tgtgtctccg ctgcgtccgc 60
cgaggccccc gagtgtcagg gacaaaagcc tccgcctgct cccgcagacg gggctcatct 120
gccgccgccg ccgcgctgag gagagttcgc cgccgtcgcc gcccgtgagg atctgagagc 180
catgtcggcc agcagcctct tggagcagta caaaatggat ctgtacatca aaaggatgga 240
ttaaacgatg atgattttga accttacttg agtccacagg caaggcccaa taatgcatat 300
actgccatgt cagattccta cttacccagt tactacagtc cctccattgg cttctcctat 360
tctttgggtg aagctgcttg gtctacgggg ggtgacacag ccatgcccta cttaacttct 420
tatggacagc tgagcaacgg agagccccac ttcctaccag atgcaatgtt tgggcaacca 480
ggagccctag gtagcactcc atttcttggt cagcatggtt ttaatttctt tcccagtggg 540
attgacttct cagcatgggg aaataacagt tctcagggac agtctactca gagctctgga 600
tatagtagca attatgctta tgcacctagc tccttaggtg gagccatgat tgatggacag 660
tcagcttttg ccaatgagac cctcaataag gctcctggca tgaatactat agaccaaggg 720
atggcagcac tgaagttggg tagcacagaa gttgcaagca atgttccaaa agttgtaggt 780
tctgctgttg gtagcgggtc cattactagt aacatcgtgg cttccaatag tttgcctcca 840
gccaccattg ctcctccaaa accagcatct tgggctgata ttgctagcaa gcctgcaaaa 900
cagcaaccta aactgaagac caagaatggc attgcagggt caagtcttcc gccacccccg 960
ataaagcata acatggatat tggaacttgg gataacaagg gtcccgttgc aaaagccccc 1020
tcacaggctt tggttcagaa tataggtcag ccaacccagg ggtctcctca gcctgtaggt 1080
cagcaggcta acaatagccc accagtggct caggcatcag tagggcaaca gacacagcca 1140
ttgcctccac ctccaccaca gcctgcccag ctttcagtcc agcaacaggc agctcagcca 1200
acccgctggg tagcacctcg gaaccgtggc agtgggttcg gtcataatgg ggtggatggt 1260
aatggagtag gacagtctca ggctggttct ggatctactc cttcagaacc ccacccagtg 1320
ttggagaagc ttcggtccat taataactat aaccccaaag attttgactg gaatctgaaa 1380
catggccggg ttttcatcat taagagctac tctgaggacg atattcaccg ttccattaag 1440
tataatattt ggtgcagcac agagcatggt aacaagagac tggatgctgc ttatcgttcc 1500
atgaacggga aaggccccgt ttacttactt ttcagtgtca acggcagtgg acacttctgt 1560
ggcgtggcag aaatgaaatc tgctgtggac tacaacacat gtgcaggtgt gtggtcccag 1620
gacaaatgga agggtcgttt tgatgtcagg tggatttttg tgaaggacgt tcccaatagc 1680
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actcaaagta aagtactagg agtcctaaga aatgttctgt tcttgtacat tatactgatt 2520
aagtcaggat taatttgatt tcaaagctga gaacagtggt aaaaactcgt ttacagaaat 2580
gcattttgga agagaaaaat actgtaaaac gtgtcgtgaa tgtttcttca gtttcttgtt 2640
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gagatcctgt tgagcatca 2719
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgucaagguc gugggaaaua a 21
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<212> RNA
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gcaguuccag cacccuuuau u 21
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ccguuccauu aaguauaaua u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcaagguaa uucauauuau a 21