花菁类染料ir780的抗菌新用途
阅读说明：本技术 花菁类染料ir780的抗菌新用途 (Novel antibacterial application of cyanine dye IR780 ) 是由 陈刚 范雪莲 宗荣玲 于 2020-11-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药领域,具体涉及花菁类染料IR780或其可接受的盐作为抗菌药物的新应用。具体表现为IR780对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌的敏感株及耐药株均具有明显的抑制作用,IR780能破坏菌体的细胞膜、增加其通透性导致DNA外渗,对菌体DNA及可溶性蛋白具有降解作用。本发明为目前花菁类染料IR780的应用提供了一种新的选择,具有新的临床应用前景。(The invention belongs to the field of biomedicine, and particularly relates to a novel application of a cyanine dye IR780 or an acceptable salt thereof as an antibacterial drug. The specific expression is that IR780 has obvious inhibition effect on sensitive strains and drug-resistant strains of gram-positive bacteria staphylococcus aureus, gram-negative bacteria escherichia coli, pseudomonas aeruginosa and acinetobacter baumannii, IR780 can destroy cell membranes of thalli and increase permeability of the thalli to cause DNA extravasation, and has degradation effect on thalli DNA and soluble protein. The invention provides a new choice for the application of the existing cyanine dye IR780 and has a new clinical application prospect.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及花菁类染料IR780的新用途，具体涉及IR780或其可接受的盐在抑制细菌感染中的应用。
背景技术
目前滥用抗生素导致细菌耐药已成为一个世界性的问题，因此，寻找新的高效抗菌 药物势在必行。
IR780是一种亲脂性阳离子型小分子花菁类染料，属于吲哚三碳菁类染料，在吸收波长为780nm处有最大吸收峰。IR780的分子式为C36H44ClIN2，分子量为667Da，其 结构式如下：
目前，IR780凭借其优良的特性获得了广泛的关注，一、其不需要与肿瘤靶向性配体偶联就可以蓄积到肿瘤部位；二、由于其具有强荧光性，被认为是良好的活体成像的 荧光探针；三、由于IR780在组织穿透性好的近红外区有较强的吸收特性，且具有较高 的光热转换效率，在激光照射条件下，常作为肿瘤的光热治疗剂；四、体内清除快，不 会被网状内皮系统吞噬，安全性较高。目前IR780主要作为荧光探针，用于体内外成像， 以及激光辅助的光学治疗，但是其直接抗菌作用在国内外尚未见相关报道。
发明内容
发明目的：为应对目前抗菌药物存在的问题，本发明发现广泛应用的花菁类染料IR780具有有效的抗菌作用，提供了IR780在生物医药领域的新用途。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了花菁类染料IR780或其可接受的盐在制备抑制和/或预防和/或治疗细菌感染的试剂或药物中的应用。
其中，所述细菌为革兰氏阳性菌或阴性菌。
其中，所述细菌包括但不仅限于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌的敏感株或耐药株中的一种或几种。
其中，所述细菌包括但不仅限于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 44300、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌T144、金黄色葡萄球菌耐药株BW15、金黄色葡萄球菌耐药株 BWMR26、金黄色葡萄球菌敏感株ATCC 29213、大肠杆菌敏感株ATCC 25922、大肠杆 菌敏感株CMCC(B)44102、铜绿假单胞菌敏感株ATCC 27853、鲍曼不动杆菌敏感株 ATCC 19606、鲍曼不动杆菌耐药株AB14、鲍曼不动杆菌耐药株AB16中的一种或几种。
其中，所述试剂或药物包括但不仅限于注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、脂质体、 纳米粒、微球或乳剂。
其中，作为优选，所述花菁类染料IR780的有效剂量为1-32μg/mL。
本发明内容还包括一种抗菌剂，所述抗菌剂包括花菁类染料IR780或其可接受的盐
本发明的产品包括抑制细菌生长产品，治疗和/或预防细菌所致疾病产品，防治细菌 引起腐败的产品。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：目前IR780主要作为荧光探针， 用于体内外成像，以及激光辅助的光学治疗，但是其直接抗菌作用在国内外尚未见相关 报道。本发明首次发现花菁类染料IR780的直接抗菌作用，其对革兰氏阳性菌及革兰氏 阴性菌的敏感株及耐药株均具有明显的抑制作用，属于IR780的新用途，有助于开发出 一系列抗菌产品，缓解细菌感染问题。
附图说明
图1、IR780对金黄色葡萄球菌耐药株MRSA 44300的抗菌活性；
A：IR780对金黄色葡萄球菌MRSA 44300的时间杀菌曲线；
B：IR780对金黄色葡萄球菌MRSA 44300外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对金黄色葡萄球菌MRSA 44300 DNA的降解作用；
D：IR780对金黄色葡萄球菌MRSA 44300蛋白的降解作用；
图2、IR780对金黄色葡萄球菌耐药株MRSA T144的抗菌活性；
A：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株MRSA T144的时间杀菌曲线；
B：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株MRSA T144外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株MRSA T144 DNA的降解作用；
D：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株MRSA T144蛋白的降解作用；
图3、IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BW15的抗菌活性；
A：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BW15的时间杀菌曲线；
B：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BW15外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BW15 DNA的降解作用；
D：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BW15蛋白的降解作用；
图4、IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BWMR26的抗菌活性；
A：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BWMR26的时间杀菌曲线；
B：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BWMR26外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BWMR26 DNA的降解作用；
D：IR780对金黄色葡萄球菌耐药株BWMR26蛋白的降解作用；
图5、IR780对金黄色葡萄球菌敏感株S.29213的抗菌活性；
A：IR780对金黄色葡萄球菌敏感株S.29213的时间杀菌曲线；
B：IR780对金黄色葡萄球菌敏感株S.29213外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对金黄色葡萄球菌敏感株S.29213 DNA的降解作用；
D：IR780对金黄色葡萄球菌敏感株S.29213蛋白的降解作用；
图6、IR780对大肠杆菌敏感株ATCC 25922的抗菌活性；
A：IR780对大肠杆菌敏感株ATCC 25922的时间杀菌曲线；
B：IR780对大肠杆菌敏感株ATCC 25922外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对大肠杆菌敏感株ATCC 25922 DNA的降解作用；
D：IR780对大肠杆菌敏感株ATCC 25922蛋白的降解作用；
图7、IR780对大肠杆菌敏感株CMCC(B)44102的抗菌活性；
A：IR780对大肠杆菌敏感株CMCC(B)44102的时间杀菌曲线；
B：IR780对大肠杆菌敏感株CMCC(B)44102外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对大肠杆菌敏感株CMCC(B)44102 DNA的降解作用；
D：IR780对大肠杆菌敏感株CMCC(B)44102蛋白的降解作用；
图8、IR780对铜绿假单胞菌敏感株ATCC 27853的抗菌活性；
A：IR780对铜绿假单胞菌敏感株ATCC 27853的时间杀菌曲线；
B：IR780对铜绿假单胞菌敏感株ATCC 27853外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对铜绿假单胞菌敏感株ATCC 27853DNA的降解作用；
D：IR780对铜绿假单胞菌敏感株ATCC 27853蛋白的降解作用；
图9、IR780对鲍曼不动杆菌敏感株ATCC 19606的抗菌活性；
A：IR780对鲍曼不动杆菌敏感株ATCC 19606的时间杀菌曲线；
B：IR780对鲍曼不动杆菌敏感株ATCC 19606外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对鲍曼不动杆菌敏感株ATCC 19606DNA的降解作用；
D：IR780对鲍曼不动杆菌敏感株ATCC 19606蛋白的降解作用；
图10、IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB14的抗菌活性；
A：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB14的时间杀菌曲线；
B：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB14外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB14 DNA的降解作用；
D：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB16蛋白的降解作用；
图11、IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB16的抗菌活性；
A：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB16的时间杀菌曲线；
B：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB16外渗DNA含量变化的影响；
C：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB16 DNA的降解作用；
D：IR780对鲍曼不动杆菌耐药株AB16蛋白的降解作用。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述 实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
材料与设备：
(1)IR780碘化物购自美国Sigma公司；
(2)细菌培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；
(3)细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；
(4)电泳相关材料购自江苏凯基生物技术股份有限公司；
(5)各菌种均为本实验室保存。
实施例1：IR780对细菌的MIC值测定
参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，对IR780进行标准菌株及临床分离菌株的MIC测定，MIC结果判断主要参照CLSI M100-S25(2015) 标准执行。使用MH培养基将药物倍比稀释为512、256、128、64、32、16、8、4、2、 1μg/mL，分别加入96孔U型板的前10孔，检测菌株以MH培养基稀释为105-106 CFU/mL，按100μL每孔加入含药孔中，第11空加入100μL培养基作为阴性对照，第 12孔加入100μL菌液最为阳性对照。置于37℃培养箱培养12-16h，读取结果，抑制细 菌生长的最小浓度即为MIC值。为保证实验结果的准确性，实验重复三次。
结果如表1所示，我们发现IR780对对包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的多株敏感菌与耐药菌在内的革兰氏阳性菌与阴性菌具有广谱的抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌甚至MRSA菌株具有较好的抑制作用，最小抑菌浓度 范围在1-4μg/mL。
表1
实施例2：IR780对细菌的时间杀菌曲线测定
分别将表1中的菌株生长至对数期的菌液(OD600＝0.8～1)按1:1000倍稀释，取1mL稀释菌液加入至摇菌管中。按照MIC的实验结果，不同浓度的IR780(0～32μg/mL)与 菌液孵育，37℃250rmp，对照组不加药液。在分别在0、3、6、9、12、24h取30μL 涂布平板。平板放置于37℃恒温培养12-16h后，计数单菌落绘制生长曲线图，观察细 菌的生长趋势。
结果如图1～11的A图所示，各control组细菌在0-12h内快速生长繁殖，12-24h细菌生长处于稳定期。加入不同浓度的IR780后，各个细菌的生长受到明显抑制，且存在 明显的活性-剂量关系，结合MIC结果，可以确定IR780是一种强烈的抗菌剂。
实施例3：IR780对细菌DNA外渗的影响
分别将表1中的菌株生长至对数期的菌液(OD600＝0.8～1)用MH肉汤按1:1000倍稀释，取1mL稀释菌液加入至摇菌管中。按照MIC的实验结果，选取1/4MIC、1/2MIC 及MIC的药物浓度与菌液孵育，37℃250rpm，对照组不加药液。孵育12h后，12000 rmp离心2min，收集上清，用微量分光光度计测定上清液中DNA的含量。
结果如图1～11的B图所示，为检测IR780对细菌细胞膜通透性的影响，进一步对加药后细胞内大分子物质(DNA)的外渗量进行了测定，孵育12h后，1/4MIC、1/2MIC 及MIC的药物处理组DNA含量均比对照组明显增加，且具有剂量依赖性。证明IR780 确实能改变所测试各种菌的细胞膜通透性。
实施例4：IR780对细菌DNA的降解作用
分别将表1中的菌株生长至对数期的菌液(OD600＝0.8～1)用MH肉汤按1:1000倍稀释，取1mL稀释菌液加入至摇菌管中。按照MIC的实验结果，选取1/4MIC、1/2MIC 及MIC的药物浓度与菌液孵育，37℃250rpm，对照组不加药液。孵育12h后，按照 试剂盒的操作说明提取细菌基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测随着药物浓度的增 加，对细菌DNA的降解情况。
结果如图1～11的C图所示，为了研究IR780抗菌是否会降解释放的生物质，我们进一步研究了IR780对释放的核酸的影响，结果显示，随着剂量的升高，IR780可以不 同程度的降解各种细菌释放的DNA。因此，IR780不仅可以有效杀伤细菌，而且还可以 成功的降解细菌释放的生物质。
实施例5：IR780对细菌可溶性蛋白含量的影响
分别将表1中的菌株生长至对数期的菌液(OD600＝0.8～1)用MH肉汤按1:1000倍稀释，取1mL稀释菌液加入至摇菌管中。按照MIC的实验结果，选取1/4MIC、1/2MIC 及MIC的药物浓度与菌液孵育，37℃250rpm，对照组不加药液。孵育12h后，12000 rmp离心2min，弃去上清，用PBS洗涤菌体沉淀，洗涤两次后加入PBS 200μL充分震 荡重悬。将悬浊液置于冰上防止局部高热，用细菌超声破碎仪裂解细菌，功率200W， 超声3s，间歇6s，作用3min，浑浊液变澄清透明，不粘连。利用SDS-PAGE检测细 菌蛋白的变化。
结果如图1～11的D图所示，各种细菌的control组可见清晰明亮的蛋白条带，而经IR780处理后，加药组菌体中可溶性蛋白总量随剂量升高而明显减少，部分在MIC剂量 时已无蛋白条带，表明IR780对测试的各种细菌中可溶性蛋白含量有明显影响，可能原 因是通过增加细胞膜通透性导致菌体可溶性蛋白外流或者对蛋白具有降解作用。