具体实施方式

本发明提供了一种用于检测DNA的免疫层析试纸条，包括底板和顺次连接在底板上的样品垫、结合垫、测试垫和吸收垫；

所述结合垫上喷涂有检测探针与金纳米棒的偶联物；所述检测探针为5’端巯基修饰的单链DNA；所述检测探针与待检测DNA的核苷酸序列互补配对；

所述检测垫上设置有检测线和质控线；所述检测线上喷涂有捕获探针与链霉亲和素的偶联物；所述捕获探针的3’端经生物素标记；

所述质控线上喷涂有质控探针与链霉亲和素的偶联物；所述质控探针的3’端经生物素修饰；所述质控探针与待检测DNA的核苷酸序列互补配对。

在本发明中，所述待检测DNA的长度优选为20～30bp；在本发明中，所述质控探针的5′端优选的还修饰有(CH₂)₆【6个亚甲基】。

在本发明中，所述金纳米棒的长度优选为20～200nm，进一步优选为25～80nm，更进一步优选为50～60nm。

在本发明中，所述检测探针与金纳米棒的偶联物的制备方法优选的包括：在金纳米棒中依次加入dATP、十二烷基硫酸钠水溶液、氯化钠水溶液和检测探针，进行偶联反应，离心，收集沉淀，洗涤，重悬，得到含有检测探针与金纳米棒的偶联物的溶液。

在本发明中，所述金纳米棒、dATP、十二烷基硫酸钠水溶液、氯化钠水溶液和检测探针的体积比优选为：500：5：7.5：25：85；所述dATP的浓度优选为1mM；所述十二烷基硫酸钠水溶液的质量浓度优选为1％；所述氯化钠水溶液的浓度优选为2M；所述检测探针的浓度优选为3μg/mL。在本发明中，在所述金纳米棒中每加入一种物质，优选的进行震荡混合；每次混合的时间优选优选为10～30min，进一步优选为20min，温度优选为25℃。在本发明中，所述氯化钠水溶液优选的分5次加入，每次加入后震荡混匀后再加下一次。本发明对dATP、十二烷基硫酸钠水溶液、氯化钠水溶液和检测探针的加入速率没有特殊要求。在本发明中，所述偶联反应的程序优选为60℃水浴中孵育3h。在本发明中，所述离心的转速优选为8000rpm，时间优选为8min；所述洗涤沉淀采用的试剂优选为磷酸缓冲盐溶液(PBS)；所述洗涤的次数优选为3次。在本发明中，所述重悬采用的试剂优选的包括洗脱缓冲液；所述洗脱缓冲液包括以下质量份的组分：Na₃PO₄·12H₂O 304mg、牛血清蛋白(BSA)2.0g、蔗糖4.0g、吐温-200.1g和水40g；所述洗脱缓冲液的制备方法优选的包括：在水中依次加入Na₃PO₄·12H₂O、牛血清蛋白、蔗糖4.0g和吐温-200.1g，混合均匀，得到洗脱缓冲液。

在本发明中，所述检测探针与金纳米棒的偶联物的保存温度优选为4℃。

在本发明中，所述金纳米棒的制备方法优选的包括以下步骤：

1)在十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入HAuCl₄水溶液，在搅拌过程中加入NaBH₄溶液，继续搅拌2min，得到金纳米种子溶液；

2)将十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl₄水溶液、AgNO₃水溶液、还原剂和所述金纳米种子溶液混合，进行还原反应，得到金纳米棒。

本发明首先在十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入HAuCl₄水溶液，在搅拌过程中加入NaBH₄溶液，继续搅拌2min，得到金纳米种子溶液。

在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl₄水溶液和NaBH₄溶液的比例优选为(3～8)mL：(3～8)mL:(500～600)μL，进一步优选为5mL：5mL：600μL；所述十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度优选为180～220nM，进一步优选为200nM；所述HAuCl₄水溶液的浓度优选为0.3～0.8nM，进一步优选为0.5nM；所NaBH₄溶液的浓度优选为8～12nM，进一步优选为10nM。在本发明中，所述搅拌的转速优选为1000rpm。

得到金纳米种子溶液后，本发明将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液、HAuCl₄水溶液、AgNO₃水溶液、还原剂和所述金纳米种子溶液混合，进行还原反应，得到金纳米棒。在本发明中，所述混合的顺序优选为将十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl₄水溶液、AgNO₃水溶液、还原剂和所述金纳米种子溶液依次混合。在本发明中，所述还原剂优选的选自维生素C或对苯二酚；所述还原剂的作用是还原HAuCl₄。在本发明中，所述CTAB水溶液、HAuCl₄水溶液、AgNO₃水溶液、还原剂和金纳米种子溶液的比例优选为：5mL：5mL：(30～80)μL：(55～250)μL：(8.2～80)μL；所述CTAB水溶液的浓度优选为0.1～0.2M；所述HAuCl₄水溶液中Au³⁺的浓度优选为10mM；所述AgNO₃水溶液中Ag⁺的浓度优选为10mM；当所述还原剂为维生素C时，所述维生素C的浓度优选为78.8mM；当所述还原剂为对苯二酚时，所述对苯二酚的浓度优选为0.1M。在本发明中，所述还原反应的程序优选的包括：0～2min，搅拌混合；所述搅拌的转速优选为200～500rpm，进一步优选为300rpm；所述搅拌混合后静置保存；所述保存的温度优选为28℃。

在本发明中，所述捕获探针与链霉亲和素的偶联物的制备方法优选的包括：所述捕获探针与链霉亲和素的偶联物的制备方法包括：将捕获探针和链霉亲和素水溶液混合，进行偶联，得到偶联反应液，将所述偶联反应液和浓度为500mg/L的PBS混合，置于截留分子量为30000的样品浓缩管中，6000rpm 20min离心以除去未反应的捕获探针，收集上清液，得到含有捕获探针与链霉亲和素的偶联物的捕获探针溶液；所述捕获探针和链霉亲和素水溶液的比例优选为50nmol：80μL，即所述捕获探针和链霉亲和素的摩尔比优选为4：1。在本发明中，所述偶联的温度优选为1h，温度优选为25℃。在本发明中，所述离心的温度优选为4℃，转速优选为6000rpm，时间优选为20min；所述离心的作用是去除未结合的捕获探针。本发明具体实施过程中，从将所述偶联反应液和浓度为500mg/L的PBS混合到收集上清液的步骤重复三次进行，即收集上清液后再加入PBS重复离心，以除去没有偶联的探针。

在本发明中，所述质控探针与链霉亲和素的偶联物的制备方法优选的包括：将质控探针和浓度为2.5mg/mL的链霉亲和素水溶液混合，进行偶联，得到偶联反应液，将所述偶联反应液和浓度为500mg/L的PBS混合，置于截留分子量为30000的样品浓缩管中，6000rpm20min离心以除去未反应的捕获探针，收集上清液，得到含有质控探针与链霉亲和素的偶联物的质控探针溶液；所述质控探针和链霉亲和素水溶液中链霉亲和素的摩尔比优选为4：1。在本发明中，所述偶联的温度优选为1h，温度优选为25℃。在本发明中，所述离心的温度优选为4℃，转速优选为6000rpm，时间优选为20min；所述离心的作用是去除未结合的捕获探针。本发明具体实施过程中，从将所述偶联反应液和浓度为500mg/L的PBS混合到收集上清液的步骤重复三次进行，即收集上清液后再加入PBS重复离心，以除去没有偶联的探针。

本发明还提供了上述方案所述免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

S1.将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，依次固定结合垫、样品垫和吸收垫；

S2.在所述结合垫上吸附检测探针与金纳米棒的偶联物，在硝酸纤维素膜的检测线喷涂捕获探针与链霉亲和素的偶联物，在质控线喷涂质控探针与链霉亲和素的偶联物，得到免疫层析试纸条；所述捕获探针与链霉亲和素的偶联物的喷涂量为0.5～1μL；所述质控探针与链霉亲和素的偶联物的喷涂量为0.5～1μL；所述检测探针与金纳米棒的偶联物的吸附量为8～12cm²，优选为10cm²。

在本发明中，所述免疫层析试纸条的使用方法优选的包括：样品垫浸入含有待检测DNA的缓冲液中，液体向吸收垫迁移，在10min内对测试和控制区进行目视评估。在本发明中，所述缓冲液中优选为1/4浓度的SSC(柠檬酸钠缓冲液)；所述SSC来源于常规市售。本发明对浸入的时间没有特殊限制。在本发明中，当质控区和检测区均出现条带，为阳性；当质控区出现条带而检测区无条带为阴性；质控区无条带则试纸条检测无效。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1金纳米棒制备

1、金纳米种子的制备

在剧烈搅拌下(1000rpm)，将新鲜配制的NaBH₄溶液(10ml，0.5mM)加入含0.1M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的HAuCl₄溶液(10ml，0.5mM)中。(CTAB、NaBH4、HAuCl4摩尔比为200:1:1)搅拌2min后，28℃保存2h，得到金纳米种子溶液。

2、金纳米棒的生长

将适量的CTAB水溶液、HAuCl₄水溶液、AgNO₃水溶液、还原剂、金纳米种子溶液依次加入圆底烧瓶中，用量见表1。具体方法包括：CTAB水溶液、HAuCl₄水溶液和AgNO₃水溶液依次加入到圆底烧瓶中。在溶液中加入还原剂，200～500rpm条件下轻轻搅拌，溶液由亮黄色变为无色。最后，加入、金纳米种子溶液，200～500rpm条件下轻轻搅拌2min，28℃静置12h，得到包含金纳米棒的溶液。

表1还原反应的反应体系

三种不同长度的金纳米棒的透射电镜图分别参见图1～图3。图1为平均长度为25nm的金纳米棒；图2为平均长度为60nm的金纳米棒；图3为平均长度为80nm的金纳米棒。

实施例2检测宫颈癌癌症标记物HPV16

目标HPV16序列：5-ggc att tgt tgg ggt aac caa ctattt gtt-3，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

HPV16检测探针序列：SH-C6-5-aac aaa tag ttg-3，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

HPV16捕获探针序列：5-cca aca aat gcc-3-Biotin，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

HPV16质控探针序列：Biotin-5-caa cta ttt gtt-3，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

1、制备HPV 16检测探针与金纳米棒的偶联物

分别取上述方法制备的长为25nm、60nm和80nm的金纳米棒500μL，加入15μL 1mMdATP后在25℃条件下震荡30min，再加入7.5μL质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液25℃条件下震荡10min，再分5批加入25μL 2M氯化钠水溶液，然后再加入85μL HPV 16检测探针。最后在60℃水浴中孵育3h。8000rpm离心8min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，重悬于洗脱缓冲液(具体配置方法为：在40mL水中依次加入Na₃PO₄·12H₂O 304mg，牛血清蛋白(BSA)2.0g，蔗糖4.0g，吐温-200.1g。混匀后即可)中，得到3种HPV 16检测探针与金纳米棒的偶联物，分别是第一偶联物(由尺寸为25(±10)×8(±3)的金纳米棒制备得到)、第二偶联物(由尺寸为60(±15)×28(±5)的金纳米棒制备得到)和第三偶联物(由尺寸为80(±20)×10(±1)的金纳米棒制备得到)。HPV 16检测探针与金纳米棒的偶联物溶液保存在4℃以备后续使用。

2、制备捕获探针溶液

将50nmol HPV16捕获探针与80uL 2.5mg/mL链霉亲和素混合，混合摩尔比约为4：1，25℃孵育1h；在混合液中加入浓度为500mg/L PBS500，μL，4℃，用截留分子量为30000的样品浓缩管6000rpm离心20min，去除未结合的捕获探针，以上步骤重复3次；浓缩管上层溶液为捕获探针溶液剩余的溶液即为捕获探针溶液。

3、制备质控探针溶液

将50nmol HPV16捕获探针与80uL 2.5mg/mL链霉亲和素混合，混合摩尔比约为100:1，25℃孵育1h；在混合液中加入500mg/LPBS，4℃，用截留分子量为30000的样品浓缩管6000rpm离心20min，去除未结合的捕获探针，以上步骤重复3次；浓缩管上层溶液为质控探针溶液。

4、试纸条制备方法

1)将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，依次固定结合垫、样品垫和吸收垫；

2)在结合垫上吸附HPV 16检测探针与金纳米棒的偶联物(10μL/cm²)，在硝酸纤维素膜的检测线和质控线分别喷涂1μL捕获探针溶液和1μL质控探针溶液，得到三种检测核酸的金纳米棒侧流层析试纸条。

实施例3

在实施例2制备的三种金纳米棒侧流层析试纸条的样品垫滴加3μL HPV16检测探针与金纳米棒的偶联物，样品垫浸入1含有目标HPV16 DNA(0.2nM)100μL的缓冲液(1/4浓度的SSC，SSC来自于市售，用去离子水稀释至原浓度的1/4)液体向吸收垫迁移。可在10min内对测试和控制区进行目视评估。检测结果参见图4，用三种不同长度的金纳米棒(25nm、60nm、80nm)分别作为标签检测DNA，当DNA浓度为0.2nM时，60nm金纳米棒测试线最浓。因此60nm金纳米棒可作为最佳标签。

实施例4

在已制备试纸条的结合垫滴加3μL HPV16检测探针与金纳米棒的偶联物，样品垫浸入1含有不同浓度目标HPV16 DNA 100μL缓冲液(1/4SSC)中，液体向吸收垫迁移。可在10min内对测试和控制区进行目视评估。质控区和测试区均出现条带为阳性；质控区出现条带而测试区无条带为阴性；质控区无条带则试纸条检测无效。结果参见图5。图5中，1～8代表目标DNA浓度分别为0，10pM，20pM，50pM，100pM，200pM，500pM和1nM。当目标物浓度为零时测试区无明显条带，浓度越高，条带颜色越深，且所有试纸条质控区有条带，说明所制备的试纸条能够正常良好工作，并且肉眼检测极限为10pM。因此所制备试纸条能够快速准确灵敏检测DNA。

对比例1

1、金纳米粒子的制备

将100mL 0.01％氯金酸(HAuCl₄)溶液加热至沸腾，在高速搅拌(1000rpm)的同时加入2mL质量百分含量为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌煮沸15min，降至25℃。

2、检测探针与金纳米粒子的偶联物的制备

取金纳米粒子500μL，加入15μL 1mM dATP后在25℃震荡30min，再加入7.5μL质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液于25℃震荡10min，再缓慢依次加入25μL 2M氯化钠溶液然和85μL HPV 16检测探针探针。最后在60℃水浴中孵育3h。8000rpm离心8min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，重悬于洗脱缓冲液(具体配置方法为：在40mL水中依次加入Na₃PO₄·12H₂O 304mg，牛血清蛋白(BSA)2.0g，蔗糖4.0g，吐温-200.1g。混匀后即可)中。检测探针与金纳米粒子的偶联物溶液保存在4℃以备后续使用。

3、捕获探针溶液制备

将50nM HPV 16捕获探针与2.5mg/mL链霉亲和素混合，25℃孵育1h；在混合液中加入500mg/LPBS，4℃，6000rpm离心20min，去除未结合的捕获探针，以上步骤重复3次；浓缩管上层溶液即为质控探针溶液。

4、质控探针溶液制备

将50nM HPV16质控探针与2.5mg/mL链霉亲和素混合，25℃孵育1h；在混合液中加入500mg/LPBS，4℃，6000rpm离心20min，去除未结合的捕获探针，以上步骤重复3次；浓缩管上层溶液即为质控探针溶液。

5、试纸条制备方法

1)将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，依次固定结合垫、样品垫和吸收垫；

2)在结合垫上吸附检测探针与金纳米粒子的偶联物溶液(10μL/cm²)，在硝酸纤维素膜的检测线和质控线分别喷涂1μL捕获探针溶液和1μL质控探针溶液，得到检测核酸的金纳米粒子侧流层析试纸条。

实施例5

将实施例2制备的金纳米棒侧流层析试纸条和对比例1制备的金纳米粒子侧流层析试纸条的样品垫分别浸入1含有目标HPV16 DNA(10pM)100μL的缓冲液(1/4SSC)中，(购买的SSC缓冲液，用去离子水稀释至原浓度的1/4)液体向吸收垫迁移。可在10min内对测试和控制区进行目视评估。(质控区和测试区均出现条带为阳性；质控区出现条带而测试区无条带为阴性；质控区无条带则试纸条检测无效)检测结果参见图6。由图6可以看出，同一条件对比金纳米粒子与金纳米棒试纸条检测DNA，肉眼观察金纳米棒最低可以检测到10pM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽科技学院

<120> 一种用于检测DNA的免疫层析试纸条及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcatttgtt ggggtaacca actatttgtt 30

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacaaatagt tg 12

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaacaaatg cc 12

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caactatttg tt 12