阅读说明：本技术 一种利用低价值海产品提取风味肽的方法 (Method for extracting flavor peptide by using low-value marine products ) 是由 何熹 于海涛 臧汝瑛 邓基建 吉云倩 黄慧影 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用低价值海产品提取风味肽的方法。包括如下步骤：(1)将低价值海产品经洗涤、筛选、破碎后,制得待发酵原料；(2)将待发酵原料按照质量比1：(3～5)的比例加水混合,调节pH值至6.0～7.0,制得发酵醪液,然后接种植物乳杆菌HX1,进行发酵,制得发酵原料；(3)将发酵原料经灭菌后,加入蛋白酶,经酶解,提纯,制得风味肽。本发明以低值海产品为原料,采用特定的植物乳杆菌HX1发酵后,再经蛋白酶酶解提取风味肽,通过实际生产,获得的风味肽可以显著去除海产品所特有的腥臭味,同时去除了风味肽中的苦味。(The invention relates to a method for extracting flavor peptide by using low-value marine products. The method comprises the following steps: (1) washing, screening and crushing low-value marine products to obtain raw materials to be fermented; (2) raw materials to be fermented are mixed according to a mass ratio of 1: (3-5) adding water to mix, adjusting the pH value to 6.0-7.0 to prepare fermented mash, inoculating lactobacillus plantarum HX1, and fermenting to prepare a fermentation raw material; (3) sterilizing the fermentation raw materials, adding protease, performing enzymolysis, and purifying to obtain flavor peptide. The invention takes low-value marine products as raw materials, and adopts specific lactobacillus plantarum HX1 for fermentation, and then flavor peptides are extracted by protease enzymolysis, and through actual production, the obtained flavor peptides can obviously remove the peculiar fishy smell of the marine products and simultaneously remove the bitter taste in the flavor peptides.)

一种利用低价值海产品提取风味肽的方法

技术领域

本发明涉及一种利用低价值海产品提取风味肽的方法，属于海产品发酵提取技术领域。

背景技术

食品感观肽是指添加在食品中能够调节食品品质、感观和口味的一类肽的总称，其中能改善食品的风味，提高食品适口性的肽称为风味肽。而目前风味肽的生产工艺，最常见的有生物合成和酶解两种，采用酶解的方法则是最常用的生产方法。其工艺主要是以大豆等植物蛋白，家禽家畜等动物蛋白为原料，经过脱油等预处理，通过添加不同种类的蛋白酶，将其大分子的蛋白质降解成小分子的肽类，然后再分级提纯，制成风味肽。

中国专利文献CN110169563A(申请号201910450032.4)公开了一种具有抗氧化功能的美拉德风味肽及其制备方法，属于食品添加剂领域。本发明以玉米蛋白肽、蛋氨酸、半胱氨酸和木糖为原料，基于美拉德反应技术，制备得到了一种兼具马铃薯风味增强和抗氧化功能的美拉德风味肽，通过调控氨基酸的比例，使得制备得到的美拉德肽的风味不同，且能够在增强食物风味特性的同时，部分替代化学合成抗氧化剂在食品中的使用，是一种安全、高效且多功能的食品添加剂，增加了传统意义上美拉德反应产物的附加功能，拓宽了其在食品添加剂领域的研究与应用的范围。但受限于原料成分中所含氨基酸的种类的差异，上述植物来源的风味肽与动物蛋白为原料特别是海产品为原料制备的风味肽在质量和味道上差异显著。

中国专利文献CN109699988A(申请号201910089665.7)公开了一种以虾的风味为主体的风味肽导向生成的天然虾露制备方法，改变了传统鱼露发酵的周期长、批次不稳定的问题，能够在较短时间内得到风味浓郁醇厚、虾味鲜美的虾露调味汁，并且能与其他如味精、鸡精等调味料协同作用，增强调味效果，增强呈味力，使食物更加美味。该技术在利用酶解生产风味肽的过程中，为了提高酶解效率，要对原料进行脱盐脱油等预处理，尤其是以鱼虾等动物蛋白为原料时，虽然该技术采用食用油进行提取，但效果并不理想，而要实现工业化生产时，往往需要采用石油醚等有机溶剂萃取或者加酸和碱的方法去除其脂肪。但这些方法会造成溶剂残留，破坏蛋白质活性等不良后果，从而对最终的风味肽品质造成不良影响。

此外，以海产品为原料制备的风味肽中含有非常浓烈的腥臭味，这在上述制备过程中更加突出，这会严重影响制备获得的风味肽的品质和市场接纳程度。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用低价值海产品提取风味肽的方法。

术语说明

本发明所称海产品为指海洋中可供食用或使用的富含动物蛋白的物质。

本发明技术方案如下：

一种利用低价值海产品提取风味肽的方法，包括如下步骤：

(1)将低价值海产品经洗涤、筛选、破碎后，制得待发酵原料；

(2)将步骤(1)中的待发酵原料按照质量比1：(3～5)的比例加水混合，调节pH值至6.0～7.0，制得发酵醪液，然后接种植物乳杆菌HX1，进行发酵，制得发酵原料；

所述植物乳杆菌HX1保藏编号为：CCTCC No.M 2017522；

(3)将步骤(2)制得的发酵原料经灭菌后，加入蛋白酶，经酶解，提纯，制得风味肽。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，低价值海产品为鱼、虾、贝富含蛋白质的组织或者鱼、虾、贝加工后剩余的富含蛋白质的下脚料。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，植物乳杆菌HX1的接种量为发酵醪液体积的8～15％；接种的植物乳杆菌HX1为菌液，菌液中的菌体浓度为1.0～9.0×10⁸CFU/mL。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，还包括在调节pH值后加入发酵调节剂的步骤，所述发酵调节剂添加的质量体积百分比为0.1～0.2％，单位g/L。

进一步优选的，所述发酵调节剂，组份如下，均为重量份：

菊粉45～55份、乳糖35～45份、乳链球菌素(nisin)10～30份。

更优选的，所述发酵调节剂，组份如下，均为重量份：

菊粉50份、乳糖40份、乳链球菌素(nisin)20份。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，发酵条件为：20～30℃厌氧条件下，发酵3～5d。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，调节pH值的pH调节剂为柠檬酸或者碳酸氢钠。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，灭菌条件为煮沸8～15min。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，蛋白酶为中性蛋白酶或风味蛋白酶，加入量为500～1000U/g。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，酶解条件为35～45℃酶解反应3～5h。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，还包括酶解后的灭酶活步骤，条件为100℃以上处理5～10min。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，提纯为超滤提纯，膜孔径小于10kDa。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，提纯后还包括喷雾干燥的步骤。

有益效果

1、本发明以低值海产品为原料，采用特定的植物乳杆菌HX1发酵后，再经蛋白酶酶解提取风味肽，通过实际生产，获得的风味肽可以显著去除海产品所特有的腥臭味，同时去除了风味肽中的苦味；

2、本发明通过在发酵前添加发酵调节剂，有利于植物乳杆菌HX1的生长，并且利用了植物乳杆菌HX1特有的脂肪酶活性加速原料中脂肪水解成甘油和脂肪酸，与传统的脂肪去除方法相比，反应条件温和，低碳环保；

3、通过采用柠檬酸或碳酸氢钠调节pH，有利于去除产品中的腥臭味，制得的产品符合食品生产以及卫生安全的相关规定，品质好，价值高，可为低价值海产品的综合利用开辟新的途径。

附图说明

图1是实施例1与对比例3两种植物乳杆菌对磷虾肉浆脂肪的降解效果曲线图；

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明本发明的内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护权利要求范围不限于所提供的案例。

材料与设备

黄鱼、扇贝边、磷虾均为普通市场销售的产品；

中性蛋白酶(5×10⁴U/g)购自石家庄市兴达酶制剂有限公司；

风味蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司

菊粉购自比利时Beneo Orafti S.A公司；

乳糖购自珠海市泛海生物技术有限公司；

乳链球菌素购自山东元泰生物工程有限公司；

植物乳杆菌HX1(Lactobacillus plantarum HX1)，已知菌株，来源于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M 2017522；专利文献CN110846331A和CN108077826A均有记载。

发酵罐：500L不锈钢厌氧中试发酵罐。

实施例1

一种利用低价值海产品提取风味肽的方法，包括如下步骤：

(1)以市场上销售的磷虾为对象，将其筛选、清洗、破碎，50目滤，按重量比1：4加水混合成待发酵原料，然后将400L待发酵原料泵入发酵罐；

(2)调酸：测定pH值，添加柠檬酸调酸调至pH7.0；

(3)添加发酵调节剂：将菊粉、乳糖、乳链球菌素按重量份50、35、20进行混合，配置成发酵调节剂，并按待发酵原料的0.1％(质量体积分数，单位g/L)加入到的发酵罐中，与待发酵原料混合均匀，；

(4)添加植物乳杆菌HX1：预先将植物乳杆菌HX1进行种子培养，培养至菌种浓度为2.0×10⁸CFU/mL，将该菌液按体积分数10％的比例加入到步骤(3)的发酵醪液中；

(5)控制温度为28℃，厌氧条件下，自然发酵5d，制得发酵原料；发酵过程中，控温并定期监测发酵液的pH值、脂肪含量；

(6)发酵结束后，重新调节发酵产物pH至7.0，使用高温蒸汽加热，煮沸10min，冷却至40℃；

(7)按照600U/g比例向发酵液中添加中性蛋白酶，在40℃条件下酶解反应4h，使用高温蒸汽加热，煮沸10min，灭酶活，冷却至常温；

(8)将溶液100目过滤，然后使用10kDa超滤膜进行超滤，收集小于10kDa滤液，测定其蛋白质和氨基酸含量；

(9)将(8)中的滤液喷雾干燥成粉状、包装，10℃低温保存。

实施例2

一种利用低价值海产品提取风味肽的方法，包括如下步骤：

(1)以市场上销售的磷虾为对象，将其筛选、清洗、破碎，50目滤，按重量比1：5加水混合成待发酵原料，然后将400L待发酵原料泵入发酵罐；

(2)调酸：测定pH值，添加柠檬酸调酸调至pH6.0；

(3)添加发酵调节剂：将菊粉、乳糖、乳链球菌素按重量份55、30、30进行混合，配置成发酵调节剂，并按待发酵原料的0.15％(质量体积分数，单位g/L)加入到的发酵罐中，与待发酵原料混合均匀，；

(4)添加植物乳杆菌HX1：预先将植物乳杆菌HX1进行种子培养，培养至菌种浓度为9.0×10⁸CFU/mL，将该菌液按体积分数8％的比例加入到步骤(3)的发酵醪液中；

(5)控制温度为30℃，厌氧条件下，自然发酵3d，制得发酵原料；发酵过程中，控温并定期监测发酵液的pH值、脂肪含量；

(6)发酵结束后，重新调节发酵产物pH至6.5，使用高温蒸汽加热，煮沸10min，冷却至35℃；

(7)按照600U/g比例向发酵液中添加风味蛋白酶，在45℃条件下酶解反应5h，使用高温蒸汽加热，煮沸10min，灭酶活，冷却至常温；

(8)将溶液100目过滤，然后使用10kDa超滤膜进行超滤，收集小于10kDa滤液，测定其蛋白质和氨基酸含量；

(9)将(8)中的滤液喷雾干燥成粉状、包装，10℃低温保存。

实施例3

一种利用低价值海产品提取风味肽的方法，包括如下步骤：

(1)以市场上销售的磷虾为对象，将其筛选、清洗、破碎，50目滤，按重量比1：3加水混合成待发酵原料，然后将400L待发酵原料泵入发酵罐；

(2)调酸：测定pH值，添加柠檬酸调酸调至pH6.5；

(3)添加发酵调节剂：将菊粉、乳糖、乳链球菌素按重量份45、40、20进行混合，配置成发酵调节剂，并按待发酵原料的0.2％(质量体积分数，单位g/L)加入到的发酵罐中，与待发酵原料混合均匀，；

(4)添加植物乳杆菌HX1：预先将植物乳杆菌HX1进行种子培养，培养至菌种浓度为1.0×10⁸CFU/mL，将该菌液按体积分数15％的比例加入到步骤(3)的发酵醪液中；

(5)控制温度为25℃，厌氧条件下，自然发酵5d，制得发酵原料；发酵过程中，控温并定期监测发酵液的pH值、脂肪含量；

(6)发酵结束后，重新调节发酵产物pH至6.5，使用高温蒸汽加热，煮沸10min，冷却至35℃；

(7)按照600U/g比例向发酵液中添加中性蛋白酶，在35℃条件下酶解反应5h，使用高温蒸汽加热，煮沸10min，灭酶活，冷却至常温；

(8)将溶液100目过滤，然后使用10kDa超滤膜进行超滤，收集小于10kDa滤液，测定其蛋白质和氨基酸含量；

(9)将(8)中的滤液喷雾干燥成粉状、包装，10℃低温保存。

实施例4

如实施例1所述的利用微生物发酵和酶解磷虾提取风味肽的方法，不同之处在于，步骤(3)中不添加发酵调节剂。

对比例1

如实施例1所述的利用微生物发酵和酶解磷虾提取风味肽的方法，不同之处在于，步骤(3)将菊粉、乳糖、乳链球菌素按重量份25、20、5进行混合，配置成发酵调节剂，并以质量体积分数0.1％(g/L)的比例加入到的葡萄浆中。

对比例2

如实施例1所述的利用微生物发酵和酶解磷虾提取风味肽的方法，不同之处在于，步骤(4)中将植物乳杆菌HX1替换为植物乳杆菌WCSF1。

对比例3

如实施例1所述的利用微生物发酵和酶解磷虾提取风味肽的方法，不同之处在于，步骤(4)中不添加植物乳杆菌HX1。

对比例4

如实施例1所述的利用微生物发酵和酶解磷虾提取风味肽的方法，不同之处在于，步骤(2)中采用醋酸调节pH。

实验例

风味肽相关指标的检测

pH值：按GB/T10468规定的方法测定；

脂肪测定：按GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的方法测定；

蛋白：按GB 5009.5-2016食品中蛋白质的方法测定；

氨基酸：按GB 5009.124-2016食品中氨基酸的的方法测定；

腥臭味评价，苦味评价：由10位感官评价员组成品尝小组，在进行感官评价前，对感官评价员进行适当的培训。参考《食品感官评价》(张永华著，华南理工大学出版社2006年出版)和《食品感官评价原理与实践》(王栋译等著，中国轻工业出版社2001年出版)，根据综合评分法的原理，采用5分制对酶解液的鲜味、腥臭味、苦味等进行评价。其中1分表示“略有”，2分表示“较弱”，3分表示“一般”，4分表示“偏重”，5分表示“很重”。

分别将相同的同批次原料按实施例1-4和对比例1-4的方法分别提取风味肽，其酶解溶液产物等检测结果如表1所示：

表1不同处理对最终风味肽产品质量的影响

分别对实施例1-4和对比例1-4的方法在制备过程中的发酵产物进行物生物含量检测，检测采用平板计数法，结果如表2所示：

表2不同处理48小时后发酵液中不同微生物含量(CFU/mL)

注：3种微生物的分离培养基为：植物乳酸杆菌，MRS培养基；枯草芽孢杆菌，LB培养基；海洋弧菌，Zobell2216E培养基。

结果分析

将实施例1和实施例4的方法进行对比发现，结果发现，采用实施例1方法的工程菌植物乳杆菌HX1在24h后其生长量就能达到1.0×10⁸CFU/mL，72h就能分解80％的脂肪(原料中的脂肪含量约为8.5g/L)；而实施例4要达到以上效果时间要加倍，因此采用实施例4的植物乳杆菌HX1的生长速度明显下降，造成脂肪的水解效率大大降低，发酵时间的延长，增加了生产周期和能耗。

将实施例1和对比例1进行对比发现，采取对比例1方法，即步骤(4)将菊粉、乳糖、乳链球菌素按重量份25、20、5进行混合，配置成发酵调节剂，经48h发酵后，发现发酵液中的出现了枯草芽孢杆菌、海洋弧菌等杂菌(表2)，从表1可以看到，由于这些杂菌的存在，不仅抑制了工程菌植物乳杆菌HX1的生长，而且会产生腥臭味等不良物质，对产品的质量造成不良影响，此外杂菌会利用发酵液中丰富蛋白质供其生长，从而导致对比例1最终酶解产物蛋白质和氨基酸含量的下降，影响了风味肽产品的最终得率。因此该重量份混合的发酵调节剂并不能完全抑制其他杂菌的生长。

将实施例1和对比例2的结果进行对比可以看出，在添加同样1％的植物乳杆菌的条件下，36h后植物乳杆菌HX1对脂肪的水解效果是对照植物乳杆菌WCSF1的4倍以上，如图1所示。从表1也可以看到，由于部分脂肪的存在，与实施例1相比对比例2中与风味肽得率密切相关的蛋白质和氨基酸的产量有所下降，鲜味感官水平降低，同时会造成腥臭味成分的增加。

将表1中实施例1和对比例3的各项数据对比可见，经过同样5d发酵后，实施例1中的脂肪含量明显低于对比例3，这说明植物乳杆菌HX1发挥了很好的分解脂肪的效果。同时，由于溶液中的脂肪含量下降，脂肪对蛋白酶的水解抑制作用减少，有利于提升其小分子蛋白的水解效率，从而使符合要求的蛋白质和氨基酸含量显著增加。此外由于脂肪的存在，其氧化后发生酸败，产品有腥臭味和苦味。

将表1中实施例1和对比例4的各项数据对比可见，对比例4中的由于醋酸比柠檬酸具有强烈的味道，用其调节pH值会对产品的风味尤其是鲜味造成很大的影响。此外醋酸具有一定的挥发性和腐蚀性，会增加使用成本，而柠檬酸稳定性好，腐蚀型低，最重要的是风味柔和，不会对最终产品风味造成不良影响，因此与醋酸相比更加适合用于调节风味肽产品发酵液的pH。