具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

药食两用石头饼包括以下重量的原料：小麦粉500g、药食两用药粉50g、干酵母5g和水120g；其中，药食两用药粉包括黄芪10g、山萸肉10g、山药10g、黄精10g和玉竹10g。

上述药食两用石头饼的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)按上述重量称取各原料；

(2)将小麦粉、药食两用药粉和干酵母混合均匀，然后加水，揉搓成光滑均匀的面团，25℃静置发酵3h，得到醒发面团；

(3)将醒发面团切为均匀的小块，揉滚至圆形，擀压成厚度为1.5mm、直径为5cm圆形饼皮；

(4)将大小均匀的石子洗净，均匀涂抹棕榈油，平铺在烘焙设备中，200℃预热18min，得到预热石子；

(5)将预热石子平均分成两份，先将圆形饼皮均匀地平铺在第一份预热石子上，然后覆盖上第二份预热石子，并轻压，最后放入烘焙设备中，200℃烘焙15min，得到石头饼半成品；

(6)将石头饼半成品冷却至室温，分装，密封储藏，即得药食两用石头饼。

实施例2

药食两用石头饼包括以下重量的原料：小麦粉500g、药食两用药粉50g、干酵母5g和水120g；其中，药食两用药粉包括黄芪10g、山萸肉10g、山药10g、黄精10g和玉竹10g。

上述药食两用石头饼的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)按上述重量称取各原料；

(2)将小麦粉、药食两用药粉和干酵母混合均匀，然后加水，揉搓成光滑均匀的面团，25℃静置发酵2h，得到醒发面团；

(3)将醒发面团切为均匀的小块，揉滚至圆形，擀压成厚度为1mm、直径为5cm圆形饼皮；

(4)将大小均匀的石子洗净，均匀涂抹棕榈油，平铺在烘焙设备中，200℃预热15min，得到预热石子；

(5)将预热石子平均分成两份，先将圆形饼皮均匀地平铺在第一份预热石子上，然后覆盖上第二份预热石子，并轻压，最后放入烘焙设备中，200℃烘焙10min，得到石头饼半成品；

(6)将石头饼半成品冷却至室温，分装，密封储藏，即得药食两用石头饼。

实施例3

药食两用石头饼包括以下重量的原料：小麦粉500g、药食两用药粉50g、干酵母5g和水120g；其中，药食两用药粉包括黄芪10g、山萸肉10g、山药10g、黄精10g和玉竹10g。

上述药食两用石头饼的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)按上述重量称取各原料；

(2)将小麦粉、药食两用药粉和干酵母混合均匀，然后加水，揉搓成光滑均匀的面团，25℃静置发酵4h，得到醒发面团；

(3)将醒发面团切为均匀的小块，揉滚至圆形，擀压成厚度为2mm、直径为5cm圆形饼皮；

(4)将大小均匀的石子洗净，均匀涂抹棕榈油，平铺在烘焙设备中，200℃预热20min，得到预热石子；

(5)将预热石子平均分成两份，先将圆形饼皮均匀地平铺在第一份预热石子上，然后覆盖上第二份预热石子，并轻压，最后放入烘焙设备中，200℃烘焙20min，得到石头饼半成品；

(6)将石头饼半成品冷却至室温，分装，密封储藏，即得药食两用石头饼。

性能测试

一、石头饼制备工艺优化试验

1材料与方法

1.1材料与设备

市售的小麦粉、药食两用药粉(黄芪、山萸肉、山药、黄精和玉竹各等分，粉碎为细粉)、干酵母、棕榈油、纯净水和格兰仕烤箱(KWS1542LQ-S3E)。

1.2石头饼配方及制备工艺

参照实施例1。

1.3石头饼感官评价方法

感官评分小组由10名具有食品专业背景的学生组成，每个学生随机抽取5块石头饼，从石头饼外观组织形态、颜色、气味和咀嚼口感等方面对每块石头饼进行打分，取5次评价平均值作为单人的评价值。通过10名学生的平均评价分值高低评价石头饼的优劣。感官评定标准如表1所示。

表1感石头饼官评定标准

1.4因素及指标考察

用分析天平准确称取面粉500g和水120g，考察不同药食两用药粉添加量的质量分数(5％、10％、20％、40％)、面饼厚度(1-2mm、2-3mm、3-4mm)、酵母添加量(0.5％、1％、2％、4％)、棕榈油添加量(0％、5％、10％)以及烘焙时间(5min、10min、15min、30min)对石头饼感官品质的影响。在单因素考察的基础上，选择对石头饼感官影响较大的因素，设置不同的水平，采用随机正交试验法，对石头饼制备工艺关键因素组合进行优化。

1.5石头饼制备工艺验证

在优化的石头饼制备工艺基础上，生产三批石头饼，对其优化后的工艺进行验证。

1.6数据处理及统计

采用DPS18.10、Excel等统计软件对实验数据进行处理和统计。

2结果与分析

2.1单因素试验感官评价结果

2.1.1药食两用药粉与小麦粉配比考察

参考1.2项石头饼制备工艺，固定小麦粉500g、干酵母5g(1％)、棕榈油添加量25g(5％)，饼皮厚度1.5mm，烘焙时间15min，分别在药食两用药粉不同添加量配比(25g、50g、100g、200g，分别为小麦粉的5％、10％、20％、40％)下制作石头饼。

在此基础上，参考1.3项方法，对石头饼感官指标进行评价，结果如图1所示。

图1为药食两用药粉配比对石头饼感官评价的影响。由图1可知，当药食两用药粉配比在5％-10％时，石头感官评价结果接近，约为85分。然而，当药食两用药粉配比在10％-40％时，随着配比升高，石头饼的感官指标得分逐渐降低；且当配比超过20％时，石头饼的感官评分下降趋势明显，在组织形态、颜色、气味和咀嚼感等感官评价上均有不足，如组织形态破碎，质地均一性差，颜色均一性差，黑色异物增多，药味过浓及咀嚼颗粒感明显等而影响食用。综合上述结果，暂定药食两用药粉的添加量为50g(与小麦粉配比10％)。

2.1.2饼皮厚度考察

参考1.2项石头饼制备工艺，固定小麦粉500g、药食两用药粉添加量50g(10％)、干酵母5g(1％)、棕榈油添加量25g(5％)，烘焙时间15min，分别制作饼皮不同厚度(1-2mm、2-3mm、3-4mm)的石头饼。

在此基础上，参考1.3项方法，对石头饼感官指标进行评价，结果如图2所示。

图2为饼皮厚度对石头饼感官评价的影响。由表2可知，随着饼皮厚度增加，石头饼感官评价得分呈缓慢下降趋势，不同饼皮厚度(1-2mm、2-3mm、3-4mm)制作的石头饼感官评分分别为85分、80分和72分。进一步地分析表明，随着饼皮厚度增加，石头饼组织形态感官评分变化不大，而颜色、气味和咀嚼感方面的感官评分呈下降趋势，如颜色发白、色泽不均匀，烘焙香气下降，咀嚼酥脆度不佳等。综合上述结果，暂定石头饼饼皮厚度为1-2mm(优选为1.5mm)。

2.1.3酵母添加量考察

参考1.2项石头饼制备工艺，固定小麦粉500g、药食两用药粉添加量50g(10％)、棕榈油添加量25g(5％)，饼皮厚度1.5mm，烘焙时间15min，分别制作干酵母不同添加量(2.5g、5g、10g、20g，分别为小麦粉的0.5％、1％、2％、4％)的石头饼。

在此基础上，参考1.3项方法，对石头饼感官指标及面团彭大倍数进行评价，结果如图3所示。

图3为酵母添加量对石头饼感官评价(图3A)及面团彭大倍数(图3B)的影响。由图3A结果可知，随着酵母添加量的增加，石头饼的组织形态、颜色、气味及咀嚼感感官评价得分变化不大，除添加量2.5g(0.5％)时总体评价分值为80分，其余酵母添加量分值为83分左右。本发明进一步对发酵2h时的面团膨胀倍数进行了考察(图3B)，结果表明，随着酵母添加量的增加，醒发面团体积呈现逐渐增加趋势。然而当酵母添加量超过5g(1％)时，醒发面团体积区域平缓。综合上述结果，暂定石头饼酵母添加量为5g(1％)。

2.1.4棕榈油添加量考察

参考1.2项石头饼制备工艺，固定小麦粉500g、药食两用药粉添加量50g(10％)、酵母添加量5g(1％)，饼皮厚度1.5mm，烘焙时间15min，分别制作棕榈油不同添加量(0g、25g、50g，分别为小麦粉的0％、5％、10％)的石头饼。

在此基础上，参考1.3项方法，对石头饼感官指标进行评价，结果如图4所示。

图4为棕榈油添加量对石头饼感官评价的影响。由表4结果可知，随着棕榈油添加量的增加，石头饼的组织形态、颜色、气味及咀嚼感等感官评价得分变化不大，不添加棕榈油时总感官评价分值为84分，棕榈油添加量为25g、50g时，石头饼感官评价得分约为87分。棕榈油的添加能少许增加石头饼的感官品质，然而，随着存放时间的延长，亦会出现走油、变质等现象，且和棕榈油呈正相关趋势。因此，石头饼烘焙前不加棕榈油的感官评价与加入棕榈油相当。综合考虑贮藏、走油等实际情况，暂定烘焙前不加棕榈油为宜。

2.1.5烘焙条件考察

参考1.2项石头饼制备工艺，固定小麦粉500g、药食两用药粉添加量50g(10％)、酵母添加量5g(1％)、棕榈油添加量0g，饼皮厚度1.5mm，分别制作不同烘焙时间(5min、10min、15min、30min)下的石头饼。

在此基础上，参考1.3项方法，对石头饼感官指标进行评价，结果如图5所示。

图5为烘焙时间对石头饼感官评价的影响。由图5可知，随着烘焙时间的增加，石头饼总体感官评价得分呈现先增加后降低趋势。当烘焙时间在5-10min时，随着烘焙时间增加，石头饼总体感官评价分值呈升高趋势；烘焙时间在10-15min时，石头饼总体感官评分区域平缓(约为85分)；烘焙时间在15-30min时，石头饼总体感官评分呈下降趋势，其组织形态、颜色、气味、咀嚼度等感官评价分值均有所下降。综合上述结果，暂定石头饼烘焙时间为15min。

2.2正交试验感官评价结果

2.2.1石头饼制备工艺正交因素、水平设置

在2.1项单因素考察结果基础上，固定小麦粉500g、干酵母添加量5g，烘焙前不加棕榈油，采用随机正交试验L93(4)正交表对石头饼加工过程中药食两用药粉配比、饼皮厚度、烘焙时间等关键因素组合进行优化，各因素、水平设置见表2。

表2石头饼制备工艺正交因素、水平表

2.2.2石头饼制备工艺正交结果及直观分析

根据上述正交试验方法制作各因素不同组合下的石头饼，并参考1.3项方法，对石头饼感官指标进行评价，并进行极差分析。结果如图6所示。

图6为石头饼制备工艺正交试验感官评价考察结果(图6A)及极差分析结果(图6B)。由图6A结果可知，石头饼总体感官评价分值随各因素水平配伍的变化而不同，且以A₂B₁D₃和A₁B₂D₂因素、水平组合下的石头饼总体感官评价分值较高。由图6B极差分析结果可知，各因素对石头饼总体感官评价优劣影响顺序为A>D>B，各因素不同水平优劣顺序为A₁≥A₂>A₃、D₃>D₂>D₁、B₁≥B₂>B₃，其理论最佳组合为A_1/2B_1/2D₃，即药食两用药粉添加量为5％或10％、饼皮厚度为1-2mm或2-3mm、烘焙时间为15min，与图6A直观分析结果基本一致。

2.2.3石头饼制备工艺正交方差分析

对石头饼制备工艺正交方差进行分析，结果如表3所示。

表3石头饼制备工艺正交试验感官评价方差分析

注：“*”代表P＜0.05。

由表3可知，影响因素的主次顺序为A>D>B，且因素A(药粉配比)具有统计学显著性，为主要提取影响因素。由于A₁、A₂感官评分接近，实际生活中A₂药量更大，能发挥出更好的保健、治疗作用；类似地，B₁、B₂水平接近，而B₁饼体更薄、质量更轻，更符合现代少食多餐的养生指导原则。

综上所述，确定石头饼制备工艺参数因素A水平为A₂，因素B水平为B₁，因素D水平为D₃，即，石头饼关键参数因素组合优化为药食两用药粉配比为10％、饼皮厚度为1-2mm(优选为1.5mm)，烘焙时间为15min。

2.3石头饼制备工艺验证试验

按照2.2项正交优化的石头饼制备工艺，制备三批石头饼，并参考1.3项方法，对石头饼感官指标进行评价。结果如图7所示。

图7为正交优化的石头饼感官指标评价结果。由图7结果可知，优化后的石头饼制备工艺稳定，组织形态完整、质地均匀，色泽均一、黑色杂质异物少，烘焙香气与药味协调，且口感清脆适中，该工艺稳定性好。

3讨论

本发明在单因素考察结果基础上，对石头饼加工过程中的药食两用药粉与小麦粉的配比、饼皮厚度和焙烤时间等参数因素进行了优化。

由结果可知，药粉配比对石头饼的感官评价影响较大，且药粉配比越大，石头饼总体感官评价分值越低；然而，本发明所选药食两用药粉与小麦粉配比为5％和10％时，二者制作得到的石头饼感官评价分值接近，实际生活中A₂药量更大，能发挥出更好的养生保健或治疗作用。此外，有单因素及正交结果可知，在一定范围内，随着焙烤时间的延长，石头饼整体感官评价得分增加，且石头饼饼皮厚度与其密切相关；由正交试验结果可知，当石头饼饼皮厚度为1-2mm和2-3mm时，二者总体感官评价得分相近，然而，饼皮厚度1～2mm(优选为1.5mm)时，饼体更薄、质量更轻，更复合少食多餐的现代养生指导原则。

此外，酵母添加量考察结果表明，其对石头饼总体感官评价结果影响不大，然而酵母过少时，醒发面团时间过长，酵母过多则易产生较多酸性物质或过度发酵对中药中效用成分进行减损，因此本发明确定酵母添加量为小麦粉的1％。棕榈油添加量考察结果表明，随着烘焙前棕榈油添加量的增加，石头饼的组织形态、颜色、气味及咀嚼感等感官评价得分变化不大，然而随着棕榈油的增多，使得石头饼存放时间延长，易于出现走油、变质等现象；本发明采用了烘焙前不加棕榈油，烘焙时，石子涂抹棕榈油方法进行加工，该工艺下石头饼总体感官评分与烘焙前加入棕榈油接近，这既降低了棕榈油的使用量，又保证了石头饼的感官品质。

综上，本发明采用经过化裁的临床保健、养生经验方中主要药味(亦是药食两用药味)，结合现代石头饼加工技术，研制新型的保健功能药食两用石头饼，该工艺稳定、可行，具有较好的市场前景。

二、石头饼抗炎作用试验

1材料与方法

1.1仪器与试药

AB135-5型分析天平(天津汇科仪器设备有限公司)，FA2104分析天平(上海精科天平)，LC-4012离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，SB-800DTD超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，MX-5涡旋振荡器(上海巴玖实业有限公司)，Multiskan Fc酶标仪(赛默飞世尔威尔创恒科技有限公司)，BPN-80CH CO2培养箱(深圳威尔创恒科技有限公司)，PDX-3倒置显微镜(上海光学仪器厂)。

实施例1制得的药食两用石头饼；内毒素脂多糖(LPS)、地塞米松(DEX)、溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，购于Sigma-Aldrich中国有限公司。小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7细胞系来源于美国模式培养物保藏所(ATCC number：TIB-71)；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)及TNF-α炎症因子检测试剂盒，购于优宁维上海科技有限公司；其余细胞培养相关试剂购于优宁维上海科技有限公司。

1.2药液的制备

取实施例1制得的药食两用石头饼适量，10倍量50％乙醇超声提取2次，每次15min，合并2次提取液，低温浓缩至干。

准确称取上述药食两用石头饼，用50％乙醇溶解至最大浓度，并以50％乙醇稀释至工作浓度。

准确称取地塞米松粉末，用PBS缓冲液溶解至50mM，并以PBS稀释至工作浓度(细胞培养液中浓度为20μM)。

准确称取LPS粉末，用PBS缓冲液溶解至1mg/mL的母液，并用PBS稀释至工作浓度(细胞培养液中浓度为20ng/L)。

准确称取MTT粉末，用PBS缓冲液溶解至5mg/mL。

1.3药食两用石头抗炎活性评价

1.3.1细胞毒性评价

取生长良好的对数期RAW264.7细胞，以5×10⁴个/孔细胞浓度接种于96孔培养板，细胞贴壁后，弃去上清培养液，除空白组外(加入不含石头饼提取物的低牛血清培养基)，其余组加入等体积含不同浓度石头饼提取物的低牛血清培养基(各组细胞培养液中乙醇浓度均为0.5％)。将上述细胞培养板置细胞培养箱继续培养细胞24h后，弃去细胞培养上清液。每孔加入MTT溶液100μL，置培养箱中继续孵育4h后，弃去细胞上清液，每孔加入DMSO试剂150μL，斡旋仪震荡使结晶充分溶解，并于495nm检测各组吸光度值。以药物与空白对照组吸光度比值的百分率表示药食两用石头饼提取物的细胞毒活性。

1.3.2抗炎活性评价

参考上述细胞培养方案，将传代RAW264.7细胞以4×10⁵个/孔的细胞浓度接种于24孔细胞培养板，设置空白、模型、阳性及不同浓度梯度药食两用石头饼提取物组(每个药物浓度为4个复孔)，细胞贴壁后弃去上清培养液，加入等体积含无细胞毒性浓度药食两用石头饼提取物的低牛血清培养基，置培养箱孵育4h。基于RAW264.7细胞炎症模型优化中LPS孵育浓度与时间，除空白组外，其余组各孔加入适宜浓度LPS溶液，置培养箱孵育适宜时间后，收集各组细胞培养液，3500rpm离心5min，分取上清液，采用Elisa法测定各组细胞上清中TNF-α、IL-6等炎症因子水平，评价药食两用石头饼提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子分泌抑制作用。

1.4数据处理及统计

采用DPS18.10、Excel等统计软件对实验数据进行处理和统计。

2结果与分析

2.1细胞毒性评价结果

采用MTT法对上述药食两用石头饼提取物的细胞毒性进行评价，结果如图8所示。

图8为药食两用石头饼提取物对RAW264.7细胞毒性作用(与浓度为0的空白组相比，*P<0.05，**P<0.01)。由图8可知，药食两用石头饼提取物在浓度为25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、2000mg/mL及以下时，对RAW264.7细胞无明显毒性。

2.2抗炎活性评价结果

在上述细胞毒性测定基础上，加入相应无细胞毒性浓度的药食两用石头饼提取物进行共孵育，以各组细胞上清TNF-α、IL-6等炎性细胞因子分泌水平为指标，对药食两用石头饼提取物进行抗炎活性评价。结果如图9所示。

图9为药食两用石头饼提取物对RAW264.7细胞TNF-α(图9A)、IL-6(图9B)炎症因子分泌抑制作用(与LPS诱导下浓度为0的模型组相比，*P<0.05，**P<0.01)。由图9结果可知，药食两用石头饼提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子TNF-α、IL-6分泌表现出一定程度的抑制作用；随着浓度的增加，药食两用石头饼提取物对RAW264.7细胞TNF-α、IL-6分泌抑制作用呈现逐渐增强趋势，且在200mg/mL浓度下，其对TNF-α、IL-6分泌具有显著性抑制作用，抑制率分别为16％、9％。

3讨论

经过工艺优化后药食两用石头饼，既具有较好的口感风味，亦具有相应的养生保健效果。本发明选取源于临床保健、养生经验方“玉黄汤”中主要药味(亦是药食两用药味)，创造性地结合传统石头饼加工技术，制成口感独特、能够提高人体免疫力的石头饼，具有较好市场。

三、药食两用石头饼的质量标准研究

1仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2998检测器，Empower色谱工作站(美国沃特世公司)；SB-5200DTDN超声波清洗器(宁波新艺生物科技股份有限公司)；AB135-S电子天平(十万分之一，瑞士METTLER公司)；HANGPING FA2104型(万分之一天平，上海精科)；98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；GZX-9076MBE型电热恒温鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；实施例1-3制得的药食两用石头饼；黄芪甲苷对照品(批号为110781-201717)；山茱萸对照药材(批号为121495-201303)；马钱苷对照品(含量测定用，批号为111640-201808，购自中国食品药品检定研究院)；流动相所用乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其它试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1薄层色谱鉴别

2.1.1黄芪的薄层鉴别

分别取实施例1-3制得的药食两用石头饼粉末3g，加甲醇20mL，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100-120目，5g，内径为10-15mm)上，用40％甲醇100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5mL使溶解，作为供试品溶液。

取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为黄芪甲苷对照品溶液。

照薄层色谱法(《中国药典》第四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果如图10所示。

图10为黄芪的薄层色谱图，其中，从左到右依次为实施例1供试品溶液、实施例2供试品溶液、实施例3供试品溶液、黄芪甲苷对照品溶液和缺黄芪阴性对照溶液。由图10可知，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点。

2.1.2山茱萸薄层鉴别

分别取实施例1-3制得的药食两用石头饼粉末5g，加二氯甲烷30mL，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液。

取对照药材5g，同法制成山茱萸对照品溶液。

照薄层色谱法(《中国药典》第四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(9：1：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果如图11所示。

图11为山茱萸的薄层色谱图，其中，从左到右依次为实施例1供试品溶液、实施例2供试品溶液、实施例3供试品溶液、山茱萸对照品溶液和缺山茱萸阴性对照溶液。由图11可知，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.2马钱苷的含量测定

2.2.1对照品溶液的制备

取马钱苷对照品适量，精密称定，加80％甲醇制成每1mL各含50μg的马钱苷对照品溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备

取实施例1制得的药食两用石头饼约5g，研细，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加80％甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加80％甲醇使溶解，转移至5mL量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备

取实施例1制得的药食两用石头中所含的中药混合粉末(除山茱萸外)约5g，同“2.2.2项”下方法制备成阴性对照溶液。

2.3色谱条件与系统适应性实验

2.3.1检测波长的选择

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2998检测器，Empower色谱工作站；固定相：Diamonsil C18柱(250×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.3％磷酸水溶液为流动相B，按下表4中的规定进行梯度洗脱；流速为1.00mL/min；柱温为30℃；检测波长为240nm，结果如图12所示。

取马钱苷对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，进样，结果如图13-15所示。

表4梯度洗脱条件

图12为马钱苷对照品的光谱图，图13为马钱苷对照品HPLC色谱图，图14为供试品溶液HPLC色谱图，图15为阴性对照溶液HPLC色谱图。由图12-15可知，阴性对照品无干扰，该方法专属性良好。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察

精密称取马钱苷对照品2.36mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再分别精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0mL至2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得不同浓度的对照品溶液，分别吸取上述对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积，结果如表5所示。

以峰面积积分值为纵坐标，进样量ng为横坐标，作图，结果如图16所示。

表5标准曲线的制备

图16为标准曲线图。由图16得到一个直线回归方程：y＝1548.1x-28780，R²＝0.9999，r＝0.9999，故马钱苷进样量在236-2360ng范围内与峰面积呈良好线性。

2.4.2精密度试验

精密吸取实施例1供试品溶液10μL，连续进样6次，测定马钱苷峰面积值，结果如表6所示。

表6精密度试验结果

由表6可知，RSD结果为1.35％，表明该方法精密度良好。

2.4.3稳定性试验

精密吸取实施例1供试品溶液，在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分别进样10μL，测得样品中马钱苷峰面积积分值。结果如表7所示。

表7稳定性试验结果

由表7可知，RSD结果为1.40％，表明该方法稳定性良好。

2.4.4重复性试验

按含量测定方法，选取实施例1制得的药食两用石头饼6份，精密吸取10μL，进样，测定峰面积积分值并计算含量。结果如表8所示。

表8稳重复性试验结果

由表8可知，RSD结果为2.78％，表明该方法重复性良好。

2.4.5加样回收率试验

采用加样回收法试验，精密称取已知含量的实施例1制得的药食两用石头饼6份，分别精密加入马钱苷对照品适量，按“2.2.2”项下方法处理。结果如表9所示。

表9加样回收率结果

由表9可知，RSD结果为1.86％。

2.5样品含量测定

分别取实施例1-3制得的药食两用石头饼，分别按照“2.2.2”供试品项下制备方法制备成供试品溶液，精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10μL，进样，依法测定马钱苷的含量。结果如表10所示。

表10样品含量结果

由表10可知，马钱苷的平均含量为0.14mg/g。

3讨论与结论

3.1定性鉴别

借鉴2015年版《中国药典》中TLC法并参照有关文献，本发明对药食两用石头饼中黄芪和山茱萸两味药材分别进行了TLC鉴别。经过反复实验考察，结果表明，该两味药材的主斑点的色谱分离良好，能检测到对应的色谱斑点且清晰圆整，阴性对照无干扰，故采用此方法对石头饼中黄芪和山茱萸进行定性鉴别是可行的。

3.2含量测定

马钱苷为山茱萸的主要成分，本实验建立的HPLC法能准确测定药食两用石头饼中马钱苷的含量，具有耗时短、操作简便、准确、重现性好等优点。所得谱图分离效果佳，稳定性好，且峰形对称，无拖尾现象。

本试验方法操作简便可行，其精密度、稳定性、加样回收率和含量测定等都符合要求，能够对药食两用石头饼中黄芪和山茱萸进行定性定量分析，并对药食两用石头饼进行了有效的质量控制，也为含山茱萸药材的中药质量控制标准提供了参考。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。