具体实施方式

如无特殊要求，本发明所用组分均为本领域技术人员常规购买所得。

本发明提供了一种甘蔗细菌性病害抗性的鉴定方法，包括以下步骤：

将甘蔗细菌性病害的病原菌液接种到离体的甘蔗叶片后，对接种所得甘蔗叶片进行培养和抗性鉴定，根据经所述培养后甘蔗叶片上条纹病斑的长度，判断甘蔗对细菌的抗性和发病等级；

发病等级和抗性水平划分标准如下：

病斑长度≤5.0cm，发病等级为1级，高抗；

5.0cm<病斑长度≤10.0cm，发病等级为2级，抗病；

10.0cm<病斑长度<15.0cm，发病等级为3级，感病；

病斑长度≥15.0cm，发病等级为4级，高感。

本发明将甘蔗细菌性病害的病原菌液接种到离体的甘蔗叶片后，对接种所得甘蔗叶片进行培养和抗性鉴定，根据经所述培养后甘蔗叶片上条纹病斑长度，判断甘蔗对细菌的抗性和发病等级。在本发明中，所述甘蔗叶片优选为新鲜甘蔗叶片；本发明对所述甘蔗叶片的生长期没有任何限定，优选为伸长期或成熟期，更优选为伸长期；所述病原菌液的浓度优选为1×10⁸cfu/mL；所述条纹病病斑的发病初期的颜色优选为白色或乳黄色，发病后期的颜色优选为红色；所述病斑优选与甘蔗叶片的叶脉平行；在本发明具体实施例所述细菌的种类没有特殊要求，优选为甘蔗白条病菌，更优选为甘蔗白条病致病菌菌株LB-1(简称菌株LB-1)，所述甘蔗白条病致病菌菌株LB-1已经公开于《广西甘蔗白条病病原菌的分离鉴定》(魏春燕，韦金菊，张小秋，张保青，宋修鹏，李德伟，覃振强，李杨瑞.植物检疫，2019，33(01)：19-23)。

本发明所述接种的方式优选为将甘蔗叶片基部置于所述病原菌液中，用无菌水喷湿未浸没在所述病原菌液的叶片尖端并保鲜膜封口；所述接种的时间优选为24h；所述接种的温度优选为28℃。本发明在所述接种结束后优选倒掉细菌菌液。

本发明所述接种后，优选将接种所得甘蔗叶片充分淋湿、保鲜膜封口后进行培养。本发明所述淋湿优选采用无菌水淋湿；所述充分淋湿的标准为叶面的水有水覆盖，但不会形成水滴流下来；所述培养的温度优选为28℃；所述培养的时间优选为10d。

本发明所述甘蔗叶片的长度优选为20cm；所述甘蔗叶片优选为健康无病虫害且经过消毒的甘蔗叶片剪切所得；所述剪切的切口要求整齐。

在本发明中，所述消毒的方式优选为依次利用酒精消毒和次氯酸钠水溶液消毒；所述酒精的体积百分含量为75％；所述酒精消毒的时间优选为3min。

本发明所述酒精消毒后，优选还包括对经酒精消毒所得叶片进行清洗；所述清洗优选采用无菌蒸馏水清洗；所述清洗的次数优选为3次。

在本发明中，所述次氯酸钠水溶液中有效氯的质量百分含量为0.1％；所述消毒的时间优选为10min。

本发明所述次氯酸钠水溶液消毒后，优选还包括对经次氯酸钠水溶液消毒所得叶片进行清洗和晾干；所述清洗优选采用无菌蒸馏水清洗；所述清洗的次数优选为3次；本发明对所述晾干的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可；优选的，所述晾干的温度为20～28℃，最优选为25℃；所述晾干的标准为叶片表明无水滴。

本发明所述病原菌液的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)将甘蔗细菌性病害的病原菌置于XAL液体培养基中活化培养，得活化菌液；

(2)将活化菌液置于XAS固体培养基中培养，得甘蔗细菌性病害的病原菌单菌落；

(3)挑取病原菌单菌落，接种到XAS固体培养基中培养，得纯化细菌；

(4)将纯化细菌的单菌落置于XAL液体培养基中培养，用XAL液体培养基将其稀释，得所述病原菌液。

本发明所述甘蔗细菌性病害的病原菌和XAL液体培养基的体积比优选为(100～1000)μL∶(1～10)mL，更优选为100μL∶1mL；所述培养的温度优选为28℃；所述培养的转速优选为200rpm；所述培养的时间优选为18～24h，更优选为19～23h。

本发明所述XAL液体培养基优选包括以下浓度的组分：10g/L的蔗糖、5g/L的细菌级蛋白胨、5g/L的酵母提取物、0.5g/L的磷酸二氢钾、0.25g/L的七水合硫酸镁、0.05g/L的亚硫酸钠、5g/L的溴化钾、0.01g/L的苯菌灵、25mg/L的头孢氨苄、30mg/L的新生霉素、50mg/L的春日霉素和100mg/L的放线菌酮；所述XAL液体培养基的组分可参考《Evaluation ofselective media and immunoassays for detection of Xanthomonas albilineans，thecausal agent of sugarcane leaf scald disease》(Davis M J，Rott P，Baudin P，DeanJ L.Plant Disease，1994，78：78-82)。

本发明所述XAL液体培养基的制备方法，优选包括以下步骤：将蔗糖、细菌级蛋白胨、酵母提取物，磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、亚硫酸钠、溴化钾和苯菌灵溶于900mL纯水中，调pH＝7.0后定容至1L，得培养基；将培养基分装和高压灭菌后，待高压灭菌后所得培养基的温度不高于55℃时，添加抗生素母液储存液，使其使用的终浓度为头孢氨苄25mg/L、新生霉素30mg/L、春日霉素50mg/L和放线菌酮100mg/L，得XAL液体培养基。

在本发明中，所述抗生素母液储存液优选包括独立分装的头孢氨苄母液储存液、新生霉素母液储存液、春日霉素母液储存液和放线菌酮母液储存液。

本发明所述头孢氨苄母液储存液的制备方法优选包括以下步骤：在配置头孢氨苄浓度为25mg/L时，称取125mg头孢氨苄加入10mL灭菌蒸馏水中，用细菌滤器过滤后，得到头孢氨苄母液储存液；所述头孢氨苄母液储存液的浓度优选为12.5mg/mL，分装成小份于-20℃储存。本发明所述头孢氨苄母液储存液在使用时，优选每毫升培养基中取2μL头孢氨苄母液储存液加入培养基中，保证头孢氨苄的使用浓度为25mg/L。本发明对过滤的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明所述新生霉素母液储存液的制备方法优选包括以下步骤：在配置新生霉素浓度为30mg/L时，称取150mg新生霉素加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得到新生霉素母液储存液；所述新生霉素母液储存液的浓度优选为150mg/mL，分装成小份于-20℃储存。本发明所述新生霉素母液储存液使用时，优选每毫升培养基中取2μL新生霉素母液储存液加入培养基中，保证新生霉素的使用浓度为30mg/L。本发明对过滤的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明所述春日霉素母液储存液的制备方法优选包括以下步骤：在配置春日霉素浓度为50mg/L时，称取250mg春日霉素加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得到春日霉素母液储存液；所述春日霉素母液储存液的浓度优选为250mg/mL，分装成小份于-20℃储存。本发明所述春日霉素母液储存液在使用时，优选每毫升培养基中取2μL春日霉素母液储存液加入培养基中，保证春日霉素的使用浓度为50mg/L。本发明对过滤的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明所述放线菌酮母液储存液的制备方法优选包括以下步骤：在配置放线菌酮浓度为100mg/L时，称取500mg放线菌酮加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得到放线菌酮母液储存液；所述放线菌酮母液储存液的浓度优选为500mg/mL，分装成小份于-20℃储存。本发明所述放线菌酮母液储存液在使用时，优选每毫升培养基中取2μL放线菌酮母液储存液加入培养基中，保证放线菌酮的使用浓度为100mg/L。本发明对过滤的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

采用本发明所述抗生素母液储存液的制备方法既能节省时间，还能配置合适浓度的储存液。

在本发明中，所述高压灭菌的温度优选为121℃；所述高压灭菌的时间优选为21min。

本发明所述活化菌液和XAS固体培养基的体积质量比优选为(10～200)μL∶(10～20)mL，更优选为100μL∶15mL；所述活化培养的温度优选为28～32℃，最优选为28℃；所述活化培养的时间优选为4～5d，更优选为5d；所述活化培养时，采用培养皿的直径优选90mm；所述培养皿的高优选为20mm。

本发明所述XAS固体培养基包括以下浓度的组分：10g/L的蔗糖、5g/L的细菌级蛋白胨、5g/L的酵母提取物、0.5g/L的磷酸二氢钾、0.25g/L的七水合硫酸镁、0.05g/L的亚硫酸钠、5g/L的溴化钾、0.01g/L的苯菌灵、15g/L的琼脂粉、25mg/L头孢氨苄、30mg/L的新生霉素、50mg/L的春日霉素和100mg/L的放线菌酮；所述XAS固体培养基的组分可参考《Evaluation of selective media and immunoassays for detection of Xanthomonasalbilineans，the causal agent of sugarcane leaf scald disease》(Davis M J，RottP，Baudin P，Dean J L.Plant Disease，1994，78：78-82)。

本发明所述XAS固体培养基的制备方法，优选包括以下步骤：取蔗糖、细菌级蛋白胨、酵母提取物，磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、亚硫酸钠、溴化钾和苯菌灵溶于900mL纯水中，调pH＝7.0后定容至1L，加入琼脂粉15g，得培养基；将培养基分装后和高压灭菌后，待高压灭菌后所得培养基的温度为50～55℃时，更优选为50℃，添加抗生素母液储存液，得XAS固体培养基。本发明所述高压灭菌均在前文进行描述，在此不做赘述。

本发明所述挑取病原菌单菌落优选采用接种环进行。

本发明所述纯化细菌单菌落的获取方法优选为用无菌吸头挑取；所述无菌吸头的体积优选为10μL；所述XAL液体培养基的用量优选为10～20mL，更优选为15ml；所述培养的温度优选为28～23℃，更优选为28℃；所述培养的转速优选为200rpm；所述培养的时间优选为36～48h，更优选为38～46h；所述培养时，采用培养皿的直径优选90mm；所述培养皿的高优选为20mm。

本发明所述发病等级和抗性水平划分标准如下：

病斑长度≤5.0cm，发病等级为1级，高抗；

5.0cm<病斑长度≤10.0cm，发病等级为2级，抗病；

10.0cm<病斑长度<15.0cm，发病等级为3级，感病；

病斑长度≥15.0cm，4级，高感。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种甘蔗细菌性病害抗性的鉴定方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、供鉴定甘蔗品种

实施例中供试材料为Co1146、桂糖97-69、LCP85-384、云蔗08-1609、云蔗05-51、ROC20、桂糖03-1462、粤甘50号8个品种。

2、甘蔗白条病致病菌菌株LB-1培养

将保存在-80℃的白条黄单胞杆菌菌株LB-1冻存液解冻，取100μL菌液放入1mLXAL液体培养基中，于28℃、200rpm振荡培养18h～24h；再取100μL震荡培养好的菌液放入无菌XAS固体培养基中，涂布均匀后放入28℃恒温箱培养5d，后用接种环以无菌操作挑取XAS固体培养基上的白条黄单胞杆菌单菌落，接种到在新的XAS固体培养基中，于28℃恒温培养箱中培养5d，获得纯化的白条黄单胞杆菌。用10μL无菌吸头挑取纯化后的白条黄单胞杆菌单个菌落放入20mLXAL液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养36h～48h，用灭菌XAL液体培养基将其配制成细菌浓度为1×10⁸cfu/mL的病原菌液后立即用于接种。

3、XAL液体培养基的配制和准备

将配制好并经过高压灭菌的的XAL液体培养基倒入容器中备用，其中XAL液体培养基的成分及其制备方法为：取蔗糖10g、细菌级蛋白胨5g、酵母提取物5g，磷酸氢二钾0.5g、七水合硫酸镁0.25g、亚硫酸钠0.05g、溴化钾5g、苯菌灵0.01g，溶于900mL纯水中，调pH＝7.0后定容至1L；将培养基分装后，在121℃下灭菌21min；在配置头孢氨苄浓度为25mg/L时，称取125mg头孢氨苄加入10mL灭菌蒸馏水中，用细菌滤器过滤后，得到头孢氨苄母液储存液，其中头孢氨苄母液储存液的浓度为12.5mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL头孢氨苄母液储存液加入培养基中，保证头孢氨苄的使用浓度为25mg/L；在配置新生霉素浓度为30mg/L时，称取150mg新生霉素加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得新生霉素母液储存液，其中新生霉素母液储存液的浓度为150mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL新生霉素母液储存液加入培养基中，保证新生霉素的使用浓度为30mg/L；在配置春日霉素浓度为50mg/L时，称取250mg春日霉素加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得到春日霉素母液储存液，其中春日霉素母液储存液的浓度为250mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL春日霉素母液储存液加入培养基中，保证春日霉素的使用浓度为50mg/L；在配置放线菌酮浓度为100mg/L时，称取500mg放线菌酮加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得放线菌酮母液储存液，其中放线菌酮母液储存液的浓度为500mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL放线菌酮母液储存液加入培养基中，保证放线菌酮的使用浓度为100mg/L，得抗生素母液储存液；待高压灭菌后的培养液温度不高于55℃时，加入抗生素母液储存液，使其终浓度为头孢氨苄25mg/L、新生霉素30mg/L、春日霉素50mg/L、放线菌酮100mg/L。

XAS固培养基的配制和准备

XAS固体培养基的成分及其制备方法为：取蔗糖10g、细菌级蛋白胨5g、酵母提取物5g，磷酸氢二钾0.5g、七水合硫酸镁0.25g、亚硫酸钠0.05g、溴化钾5g、苯菌灵0.01g，溶于900mL纯水中，调pH＝7.0后定容至1L，加入琼脂粉15g，混匀；将培养基分装后，在121℃下灭菌21min；在配置头孢氨苄浓度为25mg/L时，称取125mg头孢氨苄加入10mL灭菌蒸馏水中，用细菌滤器过滤后，得头孢氨苄母液储存液，其中头孢氨苄母液储存液的浓度为12.5mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL头孢氨苄母液储存液加入培养基中，保证头孢氨苄的使用浓度为25mg/L；在配置新生霉素浓度为30mg/L时，称取150mg新生霉素加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得新生霉素母液储存液，其中新生霉素母液储存液的浓度为150mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL新生霉素母液储存液加入培养基中，保证新生霉素的使用浓度为30mg/L；在配置春日霉素浓度为50mg/L时，称取250mg春日霉素加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得春日霉素母液储存液，其中春日霉素母液储存液250mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL春日霉素母液储存液加入培养基中，保证春日霉素的使用浓度为50mg/L；在配置放线菌酮浓度为100mg/L时，称取500mg放线菌酮加入10mL灭菌水中，用细菌滤器过滤后，得放线菌酮母液储存液，其中放线菌酮母液储存液的浓度为配置成500mg/mL，分装成小份于-20℃储存，使用时每毫升培养基中取2μL放线菌酮母液储存液加入培养基中，保证了放线菌酮的使用浓度为100mg/L；待高压灭菌后的培养液温度为50℃时，加入抗生素母液储存液，使其终浓度为头孢氨苄25mg/L、新生霉素30mg/L、春日霉素50mg/L、放线菌酮100mg/L。

4、甘蔗离体叶片接种

采集3株健康无病虫害且处于伸长期的新鲜甘蔗叶片，每株取1叶，用自来水冲洗干净，75％酒精消毒3min，灭菌无菌水清洗3次，有效氯为0.1％的次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水清洗3次，晾干。用高压灭菌过的剪刀将叶片剪成长度为20cm的片段，剪口端要求整齐；然后将叶片基部的一端朝下插入装有50mL病原菌液的2L塑料量杯中，用无菌水喷湿未浸没在细菌菌悬液里的叶片尖端，再用保鲜膜封口；将量杯置于28℃培养箱中，培养24h后倒掉菌液(倒掉的菌液灭菌处理)；然后用灭菌水将离体叶片充分淋湿，再放回量杯中，用保鲜膜封口；继续在28℃培养箱中培养10d，完成离体叶片接种；用未接种病原菌的无菌XAL液体培养基模拟接种作为对照。

5、调查叶片发病情况和统计分析

完成离体叶片接种后，采用直尺测量与叶脉平行的条纹病斑(条纹病病斑发病初期的颜色为白色或乳黄色，发病后期的颜色为红色)长度，计算均值；根据病斑长度均值计算各样本发病等级并统计其抗病性。发病等级和抗性水平按如表1所示。

表1 甘蔗白条病离体叶片接种发病等级划分标准

6.结果分析

接种处理11d后，对8个品种的甘蔗进行调查，调查结果见表2。

表2 不同甘蔗品种接种白条病病菌抗性水平鉴定结果

结果如表2所示，8个甘蔗品种中桂糖03-1462的叶片出现的病斑最大，云蔗05-51、云蔗08-1609、ROC20的叶片的病斑较大、桂糖97-69、LCP85-384、Co1146叶片的病斑较小，粤甘50号叶片的病斑最小。可见8个参试鉴定材料中桂糖03-1462抗性水平最低，为高感材料；云蔗08-1609、ROC20为感病料；桂糖97-69、LCP85-384为抗病材料；Co1146、粤甘50号为高抗材料。离体叶片抗性鉴定结果与生产上的表现基本一致，表明通过离体叶片鉴定方法可以区分不同甘蔗品种对甘蔗白条病的抗性。

由上述实施例记载的可知，本发明所述方法利用甘蔗离体叶片可以快速、准确鉴定材料的抗病性，具有操作简单，可控性好，效率高等特点，能够保证病菌接种和侵染的持续性、发病环境的一致性和可控性，病原菌侵染1d就有症状，是一种简便、高效的接种鉴定方法。而且该方法在可控环境条件下进行，保证病原菌接种及侵染条件的持续性、稳定性和统一性，减少环境条件所导致的误差，较传统方法准确性高；接种鉴定结果稳定，重复性好；方法简便，周期短，接种效率高，可对单株进行重复鉴定，适合对材料进行规模化接种鉴定。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。