改性鲢鱼肌肉蛋白、其加工方法及应用
阅读说明：本技术 改性鲢鱼肌肉蛋白、其加工方法及应用 (Modified silver carp muscle protein, processing method and application thereof ) 是由 蒋将 金斐 熊幼翎 崔雅茹 张文斌 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于动物蛋白加工领域,特别涉及改性鲢鱼肌肉蛋白、其加工方法及应用。本发明公开了一种改性鲢鱼肌肉蛋白的加工方法：将鲢鱼组织块捣碎并制成混合匀浆；将混合匀浆的pH值提高至10.5～11.5,搅拌使充分溶解；第一次固液分离并收集上清液；将第一次固液分离收集的上清液的pH值调整至5.0～5.5；第二次固液分离并收集沉淀,即为鲢鱼肌肉蛋白；将碱提法提取的鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液,在功率为100～1000W的条件下超声处理3～30min,得到改性鲢鱼肌肉蛋白。通过碱提法提取的鲢鱼肌肉蛋白经超声波改性后,起到了协同增效的效果,实现了同步改善鲢鱼肌肉蛋白的溶解度、乳化活性、乳化稳定性、持水力和凝胶成型效果的同步提升,蛋白综合加工性能显著提升。(The invention belongs to the field of animal protein processing, and particularly relates to modified silver carp muscle protein, a processing method and application thereof. The invention discloses a processing method of modified silver carp muscle protein, which comprises the following steps: mashing tissue blocks of chubs and preparing mixed homogenate; increasing the pH value of the mixed homogenate to 10.5-11.5, and stirring to fully dissolve; carrying out solid-liquid separation for the first time and collecting supernatant; adjusting the pH value of the supernatant collected by the first solid-liquid separation to 5.0-5.5; carrying out solid-liquid separation for the second time and collecting the precipitate to obtain the muscle protein of the silver carp; dissolving the silver carp muscle protein extracted by the alkali extraction method in a salt solution, and carrying out ultrasonic treatment for 3-30 min under the condition that the power is 100-1000W to obtain the modified silver carp muscle protein. The chub muscle protein extracted by the alkali extraction method has a synergistic effect after being modified by ultrasonic waves, so that the solubility, the emulsifying activity, the emulsifying stability, the water holding capacity and the gel forming effect of the chub muscle protein are synchronously improved, and the comprehensive processing performance of the protein is obviously improved.)
技术领域
本发明属于动物蛋白加工技术领域，特别是涉及一种改性鲢鱼肌肉蛋白、其加工方法及应用。
背景技术
动物性蛋白是人类饮食的重要组成部分，它有助于建立、修复和维护身体的结构和组成，同时也为食物提供所需的颜色、风味、质地，这些特性很大程度取决于蛋白质的功能。在动物肉蛋白中，鱼蛋白对比畜禽肉蛋白在必需氨基酸组成、消化吸收率等方面具有更突出的优势；鱼肉中富含的不饱和脂肪酸也符合当前健康饮食趋势；同时鱼肉蛋白中肌原纤维蛋白具有良好乳化性能、凝胶性和持水性等加工特性，这些功能特性也是决定相关蛋白产品品质的关键。
蛋白溶解度，在肉类加工过程中，蛋白质的溶解度是至关重要的，因为它与蛋白质的许多其他功能(乳化性、起泡性、凝胶性等)表达效果密切相关，溶解性是所有蛋白质表达功能特性的前提和基础，提高蛋白在加工过程中的溶解性是食品工艺中不可忽视的重要一环。
乳化性具体分为乳化活性和乳化稳定性，是指肌肉蛋白破坏脂肪成小颗粒并稳定该油-水体系的能力，特别是在乳化肉糜制品中良好的乳化性能将体系水相和油相界面间形成肌肉蛋白膜并对阻止脂肪颗粒相互结合，是乳化肉糜加工产品品质控制和贮藏稳定的关键因素。
蛋白凝胶性能可以用凝胶强度和凝胶持水力来体现。肉蛋白凝胶为肌肉蛋白在热诱导下结构展开、聚集，而后形成具有粘弹性的三维网状结构的能力，凝胶性是肉糜制品品质的基础属性。凝胶强度表示凝胶受外力被刺破所需的压力，优化后良好的凝胶强度能赋予蛋白热凝胶产品坚韧而不硬实、松弹却不软塌的质地；持水性为肉及其肉蛋白制品在外力作用下保持原有水分与添加水分的能力，优秀的凝胶持水性能保证肉蛋白制品在加工、运输、售卖和贮存过程中保持稳定的水分含量和水分活度，从而维持产品品质稳定。
目前，国内鱼水产深加工应用中，鱼糜制品消费市场庞大，其中海鱼鱼糜占据主流，究其原因是淡水鱼较海鱼相比本身肉质松垮，鱼肉蛋白加工性能(溶解性、乳化性和凝胶性)较差，限制了国内淡水鱼水产加工产品的开发；同时研究发现鱼肌肉蛋白中的肌球蛋白在正常加工条件下会发生自组装的行为，将蛋白中部分功能基团和氨基酸侧链以非共价键(疏水相互作用、静电相互作用、氢键、范德华力等)的形式包埋起来，限制了鱼肌肉蛋白溶解性、乳化性能、凝胶性和持水性等加工功能特性，一定程度上对鱼肌肉蛋白工业加工、利用和新产品研发造成影响。
我国淡水鱼资源丰富，鲢鱼更是被誉为“四大淡水鱼”之一，俗称白鲢，其易饲养、生长快、个体大、营养高，蛋白含量可达18％，生物学效价高。鲢鱼年产量在我国常年位居前二，其资源储备庞大，具有良好的开发前景，但相较于其他“三大淡水鱼”，鲢鱼由于其带有浓烈的土腥味和丰富的骨刺，且肉质较为松垮缺乏弹性等固有特性导致其生产附加值较低，限制了其消费市场潜能，同时鲢鱼鱼肉中的内源酶也会间接影响鲢鱼肌肉蛋白提取率和加工特性，故鲢鱼资源存在巨大的浪费。鲢鱼肌肉蛋白中主要含肌原纤维蛋白、肌浆蛋白和基质蛋白，其中肌原纤维蛋白约占总蛋白60％～70％，是鲢鱼蛋白的主要成分，在肉和肉制品的食品加工中起着主要的结构和功能作用。
综上可知，将低价值鲢鱼或鲢鱼加工副产品在高效提取得到鱼蛋白的基础上，进一步改良蛋白结构、提高蛋白加工性能以满足更多样的食品加工方式与广泛实际应用具有深远意义，有助于鲢鱼肌肉蛋白产品的丰富性，提高鲢鱼资源的利用率，促进我国淡水鱼产业的发展。
目前鲜有关于快速提取鲢鱼肌肉蛋白并显著提高鲢鱼肌肉蛋白加工特性的研究与应用的报道。本发明试图寻找一种基于低值鲢鱼高效提取高附加值的鲢鱼肌肉蛋白并改性的方法能满足食品生产企业和消费者的需求。
发明内容
技术问题：
鲢鱼在我国被誉为“四大淡水鱼”之一，具有庞大的渔资源储量，但鲢鱼本身带有丰富的骨刺和浓烈的土腥味，肉质也缺乏弹性，大大限制了其消费市场的扩大，鱼肉中内源性蛋白酶如钙蛋白酶、组织蛋白酶、肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶在常规漂洗鱼肉过程中中降解蛋白、劣化鱼肉，同时难加工的鲢鱼多刺结构和常规漂洗蛋白法较高的生产成本让不少水产企业望而却步，所以将低值鲢鱼中的肌肉蛋白高效提取并用于开发生产高价值鱼蛋白资源就显得尤为重要。
针对现有技术的不足，本发明的技术构思是提供一种利用鲢鱼或鲢鱼加工副产物为主要原料，使用碱性偏移提取技术高效获取鲢鱼肌肉蛋白，再辅助低频高强度超声处理进一步改善鲢鱼肌肉蛋白的加工功能性质，以期获得一种能广泛应用于乳化鱼糜食品体系的改性蛋白。本发明可为拓宽淡水鱼特别是鲢鱼深加工行业发展提供技术支持。
技术方案：
本发明基于对鲢鱼或鲢鱼加工副产品的鱼肌肉蛋白提取，并进一步通过低频高强度超声进行加工性能的改性，开发出一种具有良好溶解度、乳化性能、凝胶性和持水性的多功能蛋白，为鲢鱼肌肉蛋白应用于乳化鱼糜食品体系产品提供技术支撑。
鉴于上述和/或现有鱼肌肉蛋白生产加工存在的问题和研究方向，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是克服现有鲢鱼肌肉蛋白难提取、蛋白加工性能差等不足，提供一种高效提取鲢鱼肌肉蛋白并改良其结构以提高其加工性能的思路。
本发明的目的之一在于提供一种改性鲢鱼肌肉蛋白的加工方法，包括如下步骤：
碱提法提取鲢鱼肌肉蛋白：将新鲜鲢鱼组织块捣碎并制成混合匀浆；将混合匀浆的pH值提高至10.5～11.5搅拌使充分溶解；第一次固液分离并收集上清液；将第一次固液分离收集的上清液的pH值调整至5.0～5.5；第二次固液分离并收集沉淀，即为鲢鱼肌肉蛋白；
超声波改性鲢鱼肌肉蛋白：将碱提法提取的鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液，在100～1000W条件下超声处理3～30min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。所得的改性蛋白可直接用于生产加工也可冻干保藏。
作为本发明的其中一种实施方式，超声功率优选为100～700W。
作为本发明的其中一种实施方式，超声时间优选为3～20min。
作为本发明的其中一种实施方式，碱提法提取鲢鱼肌肉蛋白步骤中将混合匀浆的pH值提高至11.5搅拌使充分溶解，将第一次固液分离收集的上清液的pH值调整至5.3。
作为本发明的其中一种实施方式，提高pH值所使用试剂优选2.0mol/L的NaOH溶液，目的是偏离鲢鱼肌肉蛋白等电点，使鲢鱼肌肉蛋白表面带有净负电荷，而高电荷密度使鲢鱼肌肉蛋白间产生静电排斥力，并提高水合能力和溶解度。
作为本发明的其中一种实施方式，降低pH值所使用试剂为苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸或盐酸、硫酸等无机酸中的一种，浓度为1.0～2.0mol/L。目的是降低溶液pH至等电点，此时肌肉蛋白表面缺少净电荷，静电排斥力弱于其他非共价力(疏水相互作用、氢键作用力、范德华力)而降低蛋白溶解度，使蛋白更易通过离心法被回收。优选2.0mol/L的HCl溶液。
作为本发明的其中一种实施方式，碱提法提取鲢鱼肌肉蛋白步骤中将新鲜鲢鱼组织块捣碎并制成混合匀浆具体为：取新鲜鲢鱼组织块与冰水混合，捣碎、研磨、均质，得到混合匀浆。
作为本发明的其中一种实施方式，所述鲢鱼组织块为简单去鳞、去骨后的鲢鱼块或鲢鱼生产加工后副产物中的至少一种。
作为本发明的其中一种实施方式，制备混合匀浆步骤中鲢鱼组织块与冰水混合比例为1:9，均质条件为15000～20000rpm，均质1～2min。目的是使鲢鱼组织充分破碎，打断鲢鱼骨刺和结缔组织，使肌肉蛋白与冰水充分接触溶解，并为后续碱性偏移提供溶液环境。
作为本发明的其中一种实施方式，第一次固液分离和第二次固液分离均采用离心配合过滤的方式进行。
作为本发明的其中一种实施方式，第一次固液分离采用离心转速为8000～9000rpm，控制温度0～7℃，离心20min。目的是通过高速离心法除去不溶物：鲢鱼骨刺、鳞片和中性脂肪等，提高蛋白提取率和纯度。
作为本发明的其中一种实施方式，第二次固液分离采用离心转速为5000～6000rpm，控制温度0～7℃，离心15min。目的是回收基本无细胞膜和脂肪的可溶性鲢鱼肌肉蛋白。
作为本发明的其中一种实施方式，超声波改性鲢鱼肌肉蛋白中超声处理蛋白溶液为50～100g，超声处理的功率为400W，超声处理的时间为10min。
作为本发明的其中一种实施方式，将碱提法提取的鲢鱼肌肉蛋白溶解于NaCl溶液(0.55～0.65mol/L)中，配制成质量分数为2.0～4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50～100g，在功率400W、频率15～25kHz、振幅10～20％、脉冲间歇比3s：3s～7s：7s冰浴环境的条件下超声处理10min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
作为本发明的其中一种实施方式，将碱提法提取的鲢鱼肌肉蛋白溶解于NaCl溶液(0.55～0.65mol/L)中，配制成质量分数为2.0～4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理10min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
作为本发明的其中一种实施方式，超声处理优选用直径为7mm的不锈钢探头式超声处理器，探头位于溶液中央液面下方2.0cm，超声处理全程于冰浴中进行，加工过程中鲢鱼肌肉蛋白溶液温度不超过10℃，以防肉蛋白变性。
本发明的第二目的在于提供前述的加工方法制得的改性鲢鱼肌肉蛋白。
本发明的第三目的在于提供前述的改性鲢鱼肌肉蛋白作为食品的应用。
例如，以本发明制备的改性鲢鱼肌肉蛋白为原料加工得到鲢鱼纯蛋白鱼糜产品、乳化肉糜产品或鲢鱼蛋白冻干产品等。
作为本发明的其中一种实施方式，在超声波改性鲢鱼肌肉蛋白步骤之后还包括：制备鲢鱼肌肉蛋白冻干：将改性鲢鱼肌肉蛋白冷冻干燥，得到鲢鱼肌肉蛋白冻干。
本发明的第三目的在于提供前述的改性鲢鱼肌肉蛋白作为饲料的应用。
本发明的第四目的在于提供前述的改性鲢鱼肌肉蛋白在生产美容护肤产品中的应用。
本发明的第五目的在于提供前述的改性鲢鱼肌肉蛋白在制备保健品及药物添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明的加工方法，具有成本低、耗时短、易操作、低污染、安全性等特点。本发明研究发现，当碱液将匀浆pH值提高至10.5～11.5范围内，酸液将离心清液的pH调整至5.0～5.5范围内时，通过本发明特定参数的碱提法提取制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率在70％以上，溶解度在35％以上，乳化活性在5.38m2/g以上，乳化稳定性(4℃静置180min)为57.14％以上。因此，本发明的加工方法得到的鲢鱼肌肉蛋白获得了更良好的溶解度、乳化活性、乳化稳定性、凝胶特性和持水能力，可以改善漂洗制备法鱼肉质地松、蛋白加工性能差的问题，提高低价值鲢鱼资源的利用率，更能满足多样化加工工艺条件以及适用于更丰富的乳化鱼糜体系产品的开发。对比畜禽肉蛋白在必需氨基酸组成、消化吸收率等方面具有更突出的优势，因此可替代传统的畜禽肉蛋白和植物蛋白应用于饲料、食品和保健品及药物添加剂的应用中，因其具有良好的乳化性能也能应用于生产美容护肤产品。
(2)本发明研究发现，通过优化前述两个pH值可以显著提升鲢鱼肌肉蛋白的提取率、溶解度、乳化活性和乳化稳定性。优选地，当碱液将匀浆pH值提高至11.5时，酸液将离心清液的pH调整至5.3时，鲢鱼肌肉蛋白性能最优：提取率为89.0％，溶解度为37.05％，乳化活性为6.03m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为63.73％。
(3)本发明研究发现，本发明的特定参数的碱提法，相较于传统漂洗法应用于提取鲢鱼肌肉蛋白，鲢鱼肌肉蛋白提取率显著提升(由42％提升至70％以上)，乳化活性显著提升(由4.37m2/g提升至5.38m2/g以上)，乳化稳定性(4℃静置180min)显著提升(由14％提升至57％以上)，鲢鱼肌肉蛋白溶解度有所增加。说明本发明采用的特定条件的碱提法在高效提取鲢鱼肌肉蛋白，改善鲢鱼肌肉蛋白产品的溶解度、乳化活性和乳化稳定性(4℃静置180min)方面存在显著优势。
(4)本发明研究发现，通过碱提法提取的鲢鱼肌肉蛋白在经超声波改性后，起到了协同增效的效果，实现了同步改善鲢鱼肌肉蛋白溶解度(最高可达到93.27％)、乳化活性(最高可达到10.36m2/g)、4℃静置30min乳化稳定性(最高可达到95.83％)、4℃静置180min乳化稳定性(最高可达到88.65％)、凝胶强度(最高可达到1.037N)、凝胶持水力(最高可达到68.05％)和凝胶成型效果(凝胶直观更具立体感，塑型性较好)的同步提升，蛋白综合加工性能显著提升。
(5)本发明研究发现，通过传统漂洗法提取的鲢鱼肌肉蛋白在经超声波改性后，与超声波改性处理前相比，溶解度反而有所下降，对凝胶强度和持水力显著下降，凝胶直观成型也较差，表现为塑形性能差。可见，通过传统漂洗法提取的鲢鱼肌肉蛋白在经超声波改性后，无法实现本发明类似的协同增效的效果。
(6)本发明研究发现，通过改变超声处理的时机，具体地，同步碱提和超声处理相较本发明的先碱提再超声改性相比，所得鲢鱼肌肉蛋白的溶解度、乳化稳定性(4℃、180min)、凝胶强度和持水力性能发生了显著下降，且所得凝胶直观表现极差，说明超声碱提的顺序对性能会产生预料不到的影响，调整超声次序不可视为常规调整，本发明的特定次序可起到预料不到的技术效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
其中：
图1为实施例1～5和对照例1制得的鲢鱼肌肉蛋白提取率变化；
图2为实施例3、6、7、10制得的鲢鱼肌肉蛋白溶解度；
图3为实施例3、6、7、10制得的鲢鱼肌肉蛋白乳化活性；
图4为实施例3、6、7、10制得的鲢鱼肌肉蛋白凝胶强度和持水力变化；
图5为实施例3和实施例8～12制得的鲢鱼肌肉蛋白粒径变化；
图6为实施例3和实施例8～12制得的鲢鱼肌肉蛋白溶解度；
图7为实施例3和实施例8～12制得的鲢鱼肌肉蛋白乳化活性；
图8为实施例3和实施例8～12制得的鲢鱼肌肉蛋白乳化稳定性；
图9为实施例3和实施例8～12制得的鲢鱼肌肉蛋白乳液微观结构，其中标尺均为50μm；
图10为实施例3和实施例8～12制得的鲢鱼肌肉蛋白凝胶强度和持水力变化；
图11为对照例1～3和实施例3、实施例10制得的鲢鱼肌肉蛋白溶解度；
图12为对照例1～3和实施例3、实施例10制得的鲢鱼肌肉蛋白乳化活性；
图13为对照例1～3和实施例3、实施例10制得的鲢鱼肌肉蛋白乳化稳定性；
图14为对照例1～3和实施例3、实施例10制得的鲢鱼肌肉蛋白凝胶强度和持水力变化；
图15为对照例1～3和实施例3、实施例10制得的鲢鱼肌肉蛋白凝胶直观图；
图16为本发明的加工鲢鱼肌肉蛋白的工艺流程简图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明实施例及对照例所涉及的测试及表征方法如下：
鲢鱼肌肉蛋白提取率测定:
(1)漂洗法制备鲢鱼肌肉蛋白提取率：取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水混合、组织捣碎后，缓慢将匀浆用两层粗棉布过滤后得到粗提取液，其蛋白含量记为A；经漂洗法最终得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀溶于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)，利用双缩脲蛋白测定法测得提取后的鲢鱼肌肉蛋白含量记为B。
(2)碱提法制备鲢鱼肌肉蛋白提取率：取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水混合、组织捣碎后，在碱环境中彻底溶解后离心，取上清液并测定蛋白含量记为A；经等电点沉淀离心后最终得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀，溶于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)，利用双缩脲蛋白测定法测得提取后的鲢鱼肌肉蛋白含量记为B。
蛋白溶解度测定：将待测鲢鱼肌肉蛋白溶液稀释到2.0mg/mL，在4℃条件下，5000×g离心15min，收集上清液，利用双缩脲测定蛋白质含量，蛋白质溶解度表示为上清液蛋白质和原始鲢鱼肌肉蛋白稀释液的含量百分比。
蛋白粒径测定：将待测鲢鱼肌肉蛋白溶液稀释到1.0mg/mL，取适量装入Zeta比色皿中，自动测定蛋白粒径大小。
乳液制备：实验前需预先冷却鲢鱼肌肉蛋白溶液(4℃)，再将待测鲢鱼肌肉蛋白溶液(蛋白浓度为1.1％w/v)和菜籽油以体积比9:1混合得到混合物，以制备乳液(乳液中鲢鱼肌肉蛋白终浓度为1.0％w/v)。将前述混合物用高速剪切分散机(低起泡性探头)以17500rpm的速度剪切2min，制得相应的乳液，用于下述蛋白乳化活性测定、蛋白乳化稳定性测定和蛋白乳液微观结构表征。
蛋白乳化活性测定：将待测乳液立即转移到25mL烧杯中，从烧杯底部取20μL乳液并分散在5mL 0.1％(w/w)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中。在500nm下测定分散吸光度A500，乳化活性指数(EAI)根据以下公式进行计算：
其中C为乳化前的蛋白质浓度(g/mL)＝0.01，为乳化液的油体积分数(v/v)＝0.9，稀释因子取251。
蛋白乳化稳定性测定：将待测乳液立即转移到25mL烧杯中，置于4℃冷藏。待冷藏时间达到30min和180min时，从烧杯底部取20μL乳液分散在5mL 0.1％(w/w)SDS溶液中。在500nm下测定吸光值，乳化稳定性(ESI)根据以下公式进行计算：
ESI(％)＝100*At/A0
其中A0和At分别对应4℃贮藏时间下乳状液的吸光值。
蛋白乳液微观结构表征：用ECLIPSE 80i尼康显微镜对新鲜制备的待测乳液进行观察。将乳液样品(10μL)滴在载玻片上，轻轻盖上盖玻片，用100倍物镜进行观察，并用显微镜上配备的尼康DS-Ri1相机记录乳液图像。
蛋白凝胶制备：用塑料吸管吸取5.0g待测鲢鱼肌肉蛋白溶液样品(稀释至40mg/mL并于4℃下，1000×g离心1min脱气)置于小玻璃瓶(内径×长度＝16.5mm×50mm)中，用带有螺纹的配套塑料盖轻轻密封后，放入水浴锅中，以0.9℃/min的升温速率，从20℃加热至72℃。加热结束后，立即将样品放入冰水混合物中冷却30min，然后放入4℃冰箱过夜，制得相应的蛋白凝胶，用于下述凝胶强度测定、凝胶持水力测定。在测定凝胶性能之前，需将凝胶样品从冰箱取出放在室温下平衡2h。
凝胶强度测定：将待测凝胶样品置于测试平台上固定好，室温条件下利用质构分析仪进行测量。测定模式选择测试前速率为5mm/s；测试速率为1mm/s；测试后速率为5mm/s；下压距离为10mm；引发力为5g；探头型号为P/0.5。凝胶强度定义为刺破凝胶所需的初始压力(N)。
凝胶持水力测定：用小铲将凝胶轻轻与玻璃壁分开，准确称取3.0g凝胶于离心管中，在4000×g转速下离心15min，将离心管倒置晾干，残留水分用干燥滤纸擦干，计算离心后凝胶与离心前称重的凝胶的重量比(％)。
1.由鲢鱼提取鲢鱼肌肉蛋白
1.1碱提法提取-碱提参数的优化
实施例1碱提法提取
取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水按比例1:9(w/w)混合，使用组织捣碎机在20000rpm转速下机械研磨、均质剁碎2min，得到匀浆；取2.0mol/L NaOH溶液将匀浆pH值提高至10.5，并在冰浴下搅拌20min充分溶解，得到混合物；将混合物在8000rpm条件下高速离心，除去不溶物；使用2.0mol/L HCl溶液将离心清液的pH调整至5.3；之后使用离心机在6000rpm高速离心得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀。
实施例1制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率为70.3％，溶解度为35.4％，乳化活性为5.38m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为57.14％。
实施例2碱提法提取
取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水按比例1:9(w/w)混合，使用组织捣碎机在20000rpm转速下机械研磨、均质剁碎2min，得到匀浆；取2.0mol/L NaOH溶液将匀浆pH值提高至11.0，并在冰浴下搅拌20min充分溶解，得到混合物；将混合物在8000rpm条件下高速离心，除去不溶物；使用2.0mol/L HCl溶液将离心清液的pH调整至5.3；之后使用离心机在6000rpm高速离心得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀。
实施例2制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率为79.8％，溶解度为36.2％，乳化活性为5.84m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为60.84％。
实施例3碱提法提取
取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水按比例1:9(w/w)混合，使用组织捣碎机在20000rpm转速下机械研磨、均质剁碎2min，得到匀浆；取2.0mol/L NaOH溶液将匀浆pH值提高至11.5，并在冰浴下搅拌20min充分溶解，得到混合物；将混合物在8000rpm条件下高速离心，除去不溶物；使用2.0mol/L HCl溶液将离心清液的pH调整至5.3；之后使用离心机在6000rpm高速离心得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀。
实施例3制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率为89.0％，溶解度为37.5％，乳化活性为6.12m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为63.73％。
实施例4碱提法提取
取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水按比例1:9(w/w)混合，使用组织捣碎机在20000rpm转速下机械研磨、均质剁碎2min，得到匀浆；取2.0mol/L NaOH溶液将匀浆pH值提高至11.5，并在冰浴下搅拌20min充分溶解，得到混合物；将混合物在8000rpm条件下高速离心，除去不溶物；使用2.0mol/L HCl溶液将离心清液的pH调整至5.0；之后使用离心机在6000rpm高速离心得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀。
实施例4制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率为86.4％，溶解度为36.9％，乳化活性为5.86m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为61.51％。
实施例5碱提法提取
取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水按比例1:9(w/w)混合，使用组织捣碎机在20000rpm转速下机械研磨、均质剁碎2min，得到匀浆；取2.0mol/L NaOH溶液将匀浆pH值提高至11.5，并在冰浴下搅拌20min充分溶解，得到混合物；将混合物在8000rpm条件下高速离心，除去不溶物；使用2.0mol/L HCl溶液将离心清液的pH调整至5.5；之后使用离心机在6000rpm高速离心得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀。
实施例5制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率为87.6％，溶解度为36.7％，乳化活性为5.83m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为59.04％。
对比分析实施例1～5可以发现：当碱液将匀浆pH值提高至10.5～11.5范围内，酸液将离心清液的pH调整至5.0～5.5范围内时，通过本发明特定参数的碱提法提取制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率在70.3％～89.0％，溶解度在35.4～37.5％，乳化活性在5.38～6.03m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为57.14～63.73％。通过优化前述两个pH值可以显著提升鲢鱼肌肉蛋白的提取率、溶解度、乳化活性和乳化稳定性。优选地，当碱液将匀浆pH值提高至11.5内，酸液将离心清液的pH调整至5.3时，鲢鱼肌肉蛋白性能最优：提取率为89.0％，溶解度为37.5％，乳化活性为6.12m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为63.73％。
1.2本发明的碱提法提取与传统漂洗法提取的对比
对照例1传统漂洗法提取
采用漂洗法提取鲢鱼肌肉蛋白：取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水按比例1:4(w/w)混合，使用组织捣碎机在20000rpm转速下机械研磨、均质剁碎2min，缓慢搅拌匀浆15min后倒入含两层粗棉布的过滤器中脱水，所得沉淀加入4倍体积的冰水重复上述步骤2次，向最后一次沉淀中加入0.1mol/L NaCl溶液(1:4，w/w)，过滤所得沉淀为鲢鱼肌肉蛋白。
对照例1制备得到的鲢鱼肌肉蛋白提取率为42.0％，鲢鱼肌肉蛋白溶解度为33.8％；乳化活性为4.37m2/g，乳化稳定性(4℃静置180min)为14.40％。
对比分析对照例1与实施例1～5可以发现：本发明的特定参数的碱提法，相较于传统漂洗法应用于提取鲢鱼肌肉蛋白，鲢鱼肌肉蛋白提取率显著提升(由42.0％提升至70.3％以上，参见图1)，鲢鱼肌肉蛋白溶解度有所增加，乳化活性显著提升(由4.37m2/g提升至5.38m2/g以上)，乳化稳定性(4℃静置180min)显著提升(由14.40％提升至57.14％以上)。说明，本发明采用的特定条件的碱提法在高效提取鲢鱼肌肉蛋白，改善鲢鱼肌肉蛋白产品的溶解度、乳化活性和乳化稳定性(4℃静置180min)方面存在显著优势。
2.改性鲢鱼肌肉蛋白
2.1超声改性参数的优化
实施例6～12的鲢鱼肌肉蛋白原料由实施例3的提取方法(碱液将匀浆pH值提高至11.5内，酸液将离心清液的pH调整至5.3)提取得到，并将新鲜提取的鲢鱼肌肉蛋白立即低温冷藏备用。
实施例6碱提+超声波改性
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率100W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理10min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
实施例7碱提+超声波改性
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率700W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理10min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
实施例8碱提+超声波改性
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理3min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
实施例9碱提+超声波改性
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理6min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
实施例10碱提+超声波改性
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理10min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
实施例11碱提+超声波改性
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理15min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
实施例12碱提+超声波改性
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理20min，得到改性鲢鱼肌肉蛋白。
对比分析实施例6、7、10可以发现，当超声处理功率控制在100～700W范围内，通过本发明特定参数的改性方法，鲢鱼肌肉蛋白溶解度在47.05～78.65％，乳化活性在8.20～9.28m2/g，凝胶强度为0.42～1.04N，凝胶持水力在53.42～60.93％。为获得更好的乳化活性、凝胶强度和持水力，达到较低能耗又不显著影响溶解度的效果，优化得到超声功率参数：400W。对比分析实施例8～12可以发现，当超声时间控制在3～20min范围内，通过本发明特定参数的改性方法，鲢鱼肌肉蛋白粒径在258.57～402.60nm，溶解度在84.40～93.28％，乳化活性在7.76～10.36m2/g，凝胶强度为0.87～1.04N，凝胶持水力在55.16～68.05％。为了获得蛋白较小粒径、较高溶解度、较高的乳化活性和乳化稳定性、更均一的乳液油滴尺寸、更高的凝胶强度、较高的凝胶持水力效果，优化得到超声时间参数：10min。
以上优化参数主要基于实验室测定的结果，为满足大规模工业生产的加工要求，随着鲢鱼肌肉蛋白处理量的增加，可适当增大超声功率和/或延长超声时间。为满足某些特殊加工要求，超声功率和时间参数也可根据实际需求适当增大或减小。综上分析，在100～1000W条件下超声处理3～30min均能实现较好的改性效果。
对比分析实施例3单独碱提法得到的鲢鱼肌肉蛋白和实施例6～12碱提+超声波改性的鲢鱼肌肉蛋白可以发现：鲢鱼肌肉蛋白溶解度显著提升(由37.5％提升至84.0％以上，参见图6)，乳化活性显著提升(由6.12m2/g提升至7.76m2/g以上，参见图7)，乳化稳定性(4℃静置30min)显著提升(由72.02％提升至84.30％以上，参见图8)，乳化稳定性(4℃静置180min)显著提升(由63.73％提升至71.75％以上，参见图8)，乳液油滴尺寸、分散性和稳定性显著改善(参见图9)，凝胶强度显著提升(由0.27N提升至0.87N以上，参见图10)，凝胶持水力显著提高(由47.65％提升至55.16％以上，参见图10)，说明碱提法提取处理与超声波改性处理之间彼此功能上相互支持，进一步提升了鲢鱼肌肉蛋白在溶解能力、乳化性能、凝胶特性方面的参数，改善了鲢鱼肌肉蛋白的综合加工性能，因此本发明方法制得的鲢鱼肌肉蛋白产品显著提升的市场价值。
2.2不同提取方法与超声波改性的联合对比
对照例2漂洗法+超声波改性
对照例2的鲢鱼肌肉蛋白原料由对照例1的提取方法提取得到，并将新鲜提取的鲢鱼肌肉蛋白立即低温冷藏备用。
将鲢鱼肌肉蛋白溶解于盐溶液(0.6mol/L NaCl，pH 7.0，4℃)中，配制成质量分数为4.0％的鲢鱼肌肉蛋白溶液50g，将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理10min，得到漂洗后的改性鲢鱼肌肉蛋白(参照实施例10的超声波改性方法)。
对比分析对照例1与对照例2可以发现：漂洗法提取的鲢鱼肌肉蛋白在经超声波改性处理后(对照例2)，与超声波改性处理前(对照例1)相比，溶解度有所下降(参见图11)，对凝胶强度和持水力显著下降(参见图14)，凝胶直观成型也较差(参见图15)。对比分析对照例2与实施例10可以发现，一方面，碱提法联合超声波改性处理制得的鲢鱼肌肉蛋白的溶解度、乳化活性、乳化稳定性、持水力和凝胶成型效果仍远高于漂洗法联合超声波改性处理制得的鲢鱼肌肉蛋白(参见图11～15)。另一方面，不同提取方法得到的鲢鱼肌肉蛋白在超声波改性处理后，表现出不同的变化趋势：采用漂洗法+超声波的联合，无法实现同步改善鲢鱼肌肉蛋白的溶解度、乳化活性、乳化稳定性、持水力和凝胶成型效果的同步提升，溶解度、凝胶强度和持水力的变化趋势不同于碱提法+超声波的联合。说明本发明的碱提法与超声波改性的联合使用是协同增效的效果，替换其中任一处理工艺，则可能无法实现相当的技术效果。
如图14所示，对比对照例1～2、实施例3和实施例10的持水力数据可以发现，单独漂洗法的持水力略高于单独碱提法，但是经过同样的超声处理后，碱提法+超声波的联合处理得反而高于漂洗法+超声波的联合处理。凝胶强度数据也呈现类似的规律，说明碱提法与超声波处理之间存在协同作用，利用超声处理弥补碱提法带来的凝胶强度较低和持水力较低的不足。
2.3改变超声处理的时机
对照例3同步碱提和超声
取适量新鲜鲢鱼组织块与冰水按比例1:9(w/w)混合，使用组织捣碎机在20000rpm转速下机械研磨、均质剁碎2min，得到匀浆；然后取2.0mol/L NaOH溶液将匀浆pH值提高至11.5，并在冰浴下搅拌20min充分溶解，得到混合物；对混合物进行超声处理，将混合物在8000rpm条件下高速离心，除去不溶物；使用2.0mol/L HCl溶液将离心清液的pH调整至5.3；之后使用离心机在6000rpm高速离心得到鲢鱼肌肉蛋白沉淀。其中，超声处理的参数如下：将直径为7mm的不锈钢探头位于溶液中央液面下方2.0cm，在功率400W、频率20kHz、振幅10％、脉冲间歇比5s:5s、冰浴环境的条件下超声处理10min(超声条件同实施例10)。
对比分析对照例3与实施例10可以发现，同步碱提和超声处理相较本发明的先碱提再超声改性相比，所得鲢鱼肌肉蛋白的溶解度(参见图11)、乳化稳定性(4℃、180min)(参见图13)、凝胶强度和持水力性能发生了显著下降(参见图14)，对照例3的凝胶直观表现极差(参见图15)，说明碱提过程中超声处理对肌肉蛋白加工性能提高有限，体现超声时机的重要性，超声碱提的顺序对性能会产生预料不到的影响，调整超声次序不可视为常规调整，本发明的特定次序可起到预料不到的技术效果。
3.改性鲢鱼肌肉蛋白在生产美容护肤产品中的应用
以改性鲢鱼肌肉蛋白在乳液制备中的应用为例进行说明。
由实施例6～12的改性鲢鱼肌肉蛋白，可以替代植物蛋白用作乳化剂，应用于乳液制备。
经超声改性后的碱提鲢鱼肌肉蛋白具有良好的乳化活性和乳化稳定性，在乳液形成过程中发挥脂肪球与水相界面交互的能力，降低两相界面张力，产生较厚的蛋白界面层，同时能缩小脂肪油滴的尺寸，并使其在溶液中均匀、稳定分布。实施例6～12的改性鲢鱼肌肉蛋白在富含动物油脂的水包油乳液中的应用，对于利用改性动物蛋白来替代乳化性较弱的植物蛋白或人工合成乳化剂具有很深的研究意义。
4.改性鲢鱼肌肉蛋白作为食品的应用
以改性鲢鱼肌肉蛋白在蛋白凝胶制备中的应用为例进行说明。
经超声改性后的碱提鲢鱼肌肉蛋白粒度更小，形成的凝胶结构更加均匀致密，排布有序细腻，具有良好的弹性和韧性。从外观上可以观察到鲢鱼肌肉蛋白凝胶整体性强，不易流动，呈果冻、布丁状质地，整体显白色，富有光泽，未见明显水分析出，体现良好的持水能力。实施例6～12的经超声改性后的碱提鲢鱼肌肉蛋白具有的凝胶强度以及持水能力可以被应用在肉蛋白凝胶制品中，尤其是鱼糜制品及其仿制品中。
5.改性鲢鱼肌肉蛋白作为饲料的应用
由实施例6～12的改性鲢鱼肌肉蛋白，可经冷冻干燥加工为鲢鱼肌肉蛋白冻干，应用于饲料产品中。
6.改性鲢鱼肌肉蛋白在制备保健品及药物添加剂中的应用
由实施例6～12的改性鲢鱼肌肉蛋白，可作为乳化剂及重要营养成分在制备保健品及药物添加剂中进行应用。