一种游离脂肪酸的测定方法在制备试剂盒中的应用
阅读说明：本技术 一种游离脂肪酸的测定方法在制备试剂盒中的应用 (Application of free fatty acid determination method in preparation of kit ) 是由 潘利琴 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种游离脂肪酸的测定方法在制备检测游离脂肪酸浓度的试剂和/或试剂盒中的应用。所述的测定方法中包括使用含有漆酶的试剂组合物消除样品中羟苯磺酸钙干扰,所述的含有漆酶的试剂直接与样本混合发生反应。所述的测定方法中还包括向含有漆酶的试剂直接与样本混合发生反应后的体系中添加与游离脂肪酸反应的试剂。本发明在测定游离脂肪酸时可特异性消除样本中羟苯磺酸钙的负干扰,提高了检测结果的准确度,并且可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪,从而达到大规模测定样本的要求。(The invention provides an application of a free fatty acid determination method in preparation of a reagent and/or a kit for detecting the concentration of free fatty acid. The determination method comprises the step of eliminating the interference of calcium dobesilate in a sample by using a laccase-containing reagent composition, wherein the laccase-containing reagent is directly mixed with the sample to react. The determination method also comprises the step of adding a reagent which reacts with the free fatty acid into a system after a reagent containing the laccase is directly mixed with the sample to react. The invention can specifically eliminate the negative interference of the calcium dobesilate in the sample when measuring the free fatty acid, improves the accuracy of the detection result, and can be applied to the clinical biochemical automatic analyzer which is widely used at present, thereby meeting the requirement of measuring the sample in a large scale.)
技术领域
本发明属于医学检验
技术领域
，具体涉及一种游离脂肪酸的测定方法在制备游离脂肪酸的测定试剂盒中的应用。背景技术
游离脂肪酸(Non Esterified Fatty Acid，NEFA)是指血清中未与甘油、胆固醇等酯化的脂肪酸，又称非酯化脂肪酸或未酯化脂肪酸，在血浆中半衰期2-3分钟，正常情况下，血浆中含量极少。血清中的NEFA代谢活性极高，极易受脂肪代谢、糖代谢及内分泌代谢的影响。随着研究的深入和技术的不断进步，血清NEFA与疾病的关系逐渐明晰，NEFA已被证实与心脑血管、呼吸、消化、内分泌、免疫等系统疾病的发生发展，以及肿瘤和创伤性应激等的能量代谢关系密切。
乙酰辅酶A合成酶(ACS)-乙酰辅酶A氧化酶(ACOD)偶联的酶法测定法是目前临床测试NEFA的主要方法，检测原理是人血清中游离脂肪酸和辅酶A在乙酰辅酶A合成酶的作用下反应生成脂酰辅酶A，脂酰辅酶A在乙酰辅酶A氧化酶的作用下生成H2O2，随后通过Trinder’s反应在过氧化物酶的作用下生成有色物质。临床应用发现，该法极容易受羟苯磺酸钙干扰而使结果存在较大偏差甚至得出错误结果[1]，其可能的原因是羟苯磺酸钙还原了反应过程中生成的H2O2而对测定造成负干扰。羟苯磺酸钙是临床用于治疗多种原因引起的毛细血管疾病，如糖尿病视网膜病变、静脉曲张、静脉炎、腿痉挛、痰痒性皮炎等症的常见药物，服用该药物后，患者的血清样本中不可避免的存在较高浓度的该药物。
因此，提供一种能够排除羟苯磺酸钙影响的游离脂肪酸的测定方法及试剂盒对临床检测具有十分重要的意义。
[1]侯立安,国秀芝,邱玲,等.羟苯磺酸钙对酶法游离脂肪酸检测的负干扰[J].检验医学.2016,(11).936-940.
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种可消除羟苯磺酸钙干扰的游离脂肪酸的测定方法在制备游离脂肪酸的测定中的应用。本申请经长期研究发现，漆酶可特异性氧化羟苯磺酸钙中的对苯二酚环，从而避免由于对苯二酚环与过程中生成的过氧化氢反应而对游离脂肪酸的测定造成负干扰，因此，在试剂组合中添加漆酶可消除羟苯磺酸钙对游离脂肪酸测定的负干扰。
术语：
4-APP：4-氨基安替比林；
TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚；
TODB：N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐。
一方面，本发明提供了一种游离脂肪酸的测定方法。
所述的测定方法中包括：使用含有漆酶的试剂组合物消除样品中羟苯磺酸钙干扰，所述的含有漆酶的试剂直接与样本混合发生反应。
所述试剂组合物中漆酶的浓度为0.5-15KU/L。
优选地，所述试剂组合物中还包括浓度为0.5-5KU/L的乙酰辅酶A合成酶、0.3-1.0g/L的辅酶A和2-8mmoL/L的三磷酸腺苷。
优选地，所述试剂组合物还包括pH为7.20的Tris-HCl缓冲液，所述的Tris-HCl缓冲液浓度为25-100mmol/L。
优选地，所述试剂组合物还包括TODB、TritonX-100、Proclin300、海藻糖。
在一些实施例中，所述试剂组合物中包括：pH为7.20、浓度为30-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，浓度为10-50KU/L的漆酶，浓度为0.5-5KU/L的乙酰辅酶A合成酶，浓度为0.3-1.0g/L的辅酶A，浓度为2-8mmoL/L的三磷酸腺苷，浓度为1-3mmoL/L的TODB，浓度为0.1-5mL/L的TritonX-100，浓度为0.01-5mL/L的proclin300，浓度为20-100g/L的海藻糖。
作为本发明的一个优选的实施方式，所述试剂组合物中包括pH 7.20、浓度为50-80mmol/L的Tris-HCl缓冲液，浓度为20-40KU/L的漆酶，浓度为1.5-4KU/L的乙酰辅酶A合成酶，浓度为0.5-0.8g/L的辅酶A，浓度为4-6mmoL的三磷酸腺苷，浓度为1.5-2.5mmoL/L的TODB，浓度为0.5-4.5mL/L的TritonX-100，浓度为0.02-2mL/L的proclin300，浓度为40-80g/L的海藻糖。
所述的测定方法中还包括：向含有漆酶的试剂直接与样本混合发生反应后的体系中添加与游离脂肪酸反应的试剂。
所述的与游离脂肪酸反应的试剂中包括：10-100KU/L乙酰辅酶A氧化酶、10-200KU/L过氧化物酶。
优选地，所述的与游离脂肪酸反应的试剂中还包括pH为7.20的Tris-HCl缓冲液，其浓度为25-100mmol/L。
优选地，所述的与游离脂肪酸反应的试剂中还包括4-AAP、TritonX-100、N-乙基顺丁烯二酰亚胺、Proclin300和海藻糖。
优选地，所述的与游离脂肪酸反应的试剂中包括pH 7.20、浓度为30-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，浓度为10-100KU/L的乙酰辅酶A氧化酶，浓度为10-200KU/L的过氧化物酶，浓度为1-5mmol/L的4-AAP，浓度为0.1-5mL/L的TritonX-100，浓度为0.1-1g/L的N-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为0.01-5mL/L的proclin300、浓度为20-100g/L的海藻糖。
在一些实施例中，所述的与游离脂肪酸反应的试剂中包括pH 7.20、浓度为50-80mmol/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为30-80KU/L的乙酰辅酶A氧化酶、浓度为50-160KU/L的过氧化物酶、浓度为2-4mmol/L的4-AAP、浓度为0.5-4.5mL/L的TritonX-100、浓度为0.3-0.8g/L的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、浓度为0.02-2mL/L的proclin300、浓度为40-80g g/L的海藻糖。
作为本发明的一个优选的实施方式，所述的与游离脂肪酸反应的试剂中包括pH7.20、浓度为65mmol/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为55KU/L的乙酰辅酶A氧化酶、浓度为105KU/L的过氧化物酶、浓度为3mmol/L的4-AAP、浓度为2.5mL/L的TritonX-100、浓度为0.55g/L的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、浓度为0.2mL/L的proclin300、浓度为60g g/L的海藻糖。
优选地，所述的测定方法包括以下步骤：
S1、按比例配制含有漆酶的试剂组合物；
S2、将试剂组合物与样本混合、反应结束后检测吸光值记为AU,1；
S3、向S2反应后的体系中中继续加入与游离脂肪酸反应的试剂继续反应后检测吸光值记为AU,2，根据AU,1和AU,2的差计算出样本中的游离脂肪酸浓度。
所述的步骤S2、S3中检测吸光值采用的主波长为540-560nm。
优选地，所述的步骤S2、S3中检测吸光值采用全自动生化分析仪进行检测。
优选地，所述全自动生化分析仪进行反应的主波长为540-560nm，副波长为700nm。
优选地，全自动生化分析仪的反应温度为37℃±1℃。
优选地，所述的步骤S2、S3中反应时间均为3-5min。
优选地，样本与含有漆酶的试剂组合物的体积比为1:40-60。
优选地，样本与与游离脂肪酸反应的试剂的体积比为1:10-15。
采用如上试剂组合进行游离脂肪酸测定的原理为：
首先，在含有漆酶的试剂组合物作用下，人血清中游离脂肪酸和辅酶A在乙酰辅酶A合成酶的作用下反应生成脂酰辅酶A；
第二步，脂酰辅酶A在乙酰辅酶A氧化酶的作用下生成H2O2，随后通过Trinder’s反应在过氧化物酶的作用下生成有色物质，对应检测出游离脂肪酸浓度。
另一方面，本发明提供了前述的游离脂肪酸的测定方法在制备检测游离脂肪酸浓度的试剂和/或试剂盒中的应用。
所述的试剂用于通过前述方法检测游离脂肪酸浓度。
所述的试剂盒中包括前述的含有漆酶的试剂组合物。
所述的试剂盒中还包括前述的与游离脂肪酸反应的试剂。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供可消除羟苯磺酸钙干扰的游离脂肪酸的测定方法检测结果的准确度高。
(2)本发明操作简单，可以在目前广泛使用的临床生化自动分析仪上开展，从而达到大规模测定样本的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中各试剂的来源信息如下：
实施例1一种游离脂肪酸的测定方法
本实施例中含有漆酶的试剂组合物为试剂组合物(1)；与游离脂肪酸反应的试剂为试剂组合物(2)。
试剂组合物(1)包括的具体成分及终浓度如下：
浓度为10KU/L的漆酶、浓度为0.5KU/L的乙酰辅酶A合成酶、浓度为0.3g/L的辅酶A、浓度为2mmoL/L的三磷酸腺苷、浓度为1mmoL/L的TODB、浓度为0.1mL/L的TritonX-100、浓度为0.01mL/L的proclin300、浓度为20g/L的海藻糖、浓度为30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
试剂组合物(2)包括的具体成分及终浓度如下：
浓度为10KU/L的乙酰辅酶A氧化酶、浓度为10KU/L的过氧化物酶、浓度为1mmol/L的4-AAP、浓度为0.1mL/L的TritonX-100、浓度为0.1g/L的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、浓度为0.01mL/L的proclin300、浓度为20g/L的海藻糖、浓度为30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
采用该试剂组合进行检测，采用的仪器为BECKMAN LX20全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为4μL，试剂(1)体积为200μL，试剂(2)体积为50μL，测定主/副波长为560/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的拟合方式为线性拟合。
检测步骤如下：
S1分别按上述比例配制试剂组合物(1)和试剂组合物(2)；
S2试剂组合物(1)和血清样本混合后在测定温度反应5分钟，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,1、AS,1、AU,1；
S3加入试剂组合物(2)后继续反应5分钟，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,2、AS,2、AU,2，由仪器自动计算出样本中的游离脂肪酸浓度。用本法分别测定了不添加和添加不同浓度羟苯磺酸钙的低浓度(0.5mmol/L)、中浓度(1.0mmol/L)、高浓度(1.5mmol/L)的游离脂肪酸样本浓度，计算干扰率，检测结果如下表1。
表1为本实施例所述方法测定的不同羟苯磺酸钙浓度下游离脂肪酸浓度与空白血清的百分偏差(％)。
表1
从表1中可以看出，所有的百分偏差(％)均小于10％。
实施例2一种游离脂肪酸的测定方法
本实施例中含有漆酶的试剂组合物为试剂组合物(1)；与游离脂肪酸反应的试剂为试剂组合物(2)。
试剂组合物(1)包括的具体成分及终浓度如下：
50KU/L的漆酶、5KU/L的乙酰辅酶A合成酶、1.0g/L的辅酶A、8mmoL/L的三磷酸腺苷、3mmoL/L的TODB、5mL/L的TritonX-100、5mL/L的proclin300、100g/L的海藻糖、30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
试剂组合物(2)包括的具体成分及终浓度如下：
10KU/L的乙酰辅酶A氧化酶、100KU/L的乙酰辅酶A氧化酶、200KU/L的过氧化物酶、5mmol/L的4-AAP、5mL/L的TritonX-100、1g/L的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、5mL/L的proclin300、100g/L的海藻糖、30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
采用该试剂组合进行检测，采用的仪器为BECKMANAU5400全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为4μL，试剂(1)体积为200μL，试剂(2)体积为50μL，测定主/副波长为540/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的拟合方式为线性拟合。
检测步骤同实施例1。
表2为本实施例所述方法测定的不同羟苯磺酸钙浓度下游离脂肪酸浓度与空白血清的百分偏差(％)。
表2
从表2中可以看出，所有的百分偏差(％)均小于10％。
实施例3一种游离脂肪酸的测定方法
本实施例中含有漆酶的试剂组合物为试剂组合物(1)；与游离脂肪酸反应的试剂为试剂组合物(2)。
试剂组合物(1)包括的具体成分及终浓度如下：
30KU/L的漆酶、2.75KU/L的乙酰辅酶A合成酶、0.65g/L的辅酶A、5mmoL/L的三磷酸腺苷、2mmol/L的TODB、2.5mL/L的TritonX-1000.2mL/L的proclin300、60g/L的海藻糖、30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
试剂组合物(2)包括的具体成分及终浓度如下：
55KU/L的乙酰辅酶A氧化酶、105KU/L的过氧化物酶、3mmol/L的4-AAP、2.5mL/L的TritonX-100、0.55g/L的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、0.2mL/L的proclin300、60g g/L的海藻糖、30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
仪器参数、检测步骤同实施例1。
表3为本实施例所述方法测定的不同羟苯磺酸钙浓度下游离脂肪酸浓度与空白血清的百分偏差(％)。
表3
从表3中可以看出，所有的百分偏差(％)均小于10％。
实施例4一种游离脂肪酸测定用试剂盒
本实施例的试剂盒中包括试剂组合物(1)和试剂组合物(2)。
试剂组合物(1)包括的具体成分及使用终浓度如下：
浓度为10KU/L的漆酶、浓度为0.5KU/L的乙酰辅酶A合成酶、浓度为0.3g/L的辅酶A、浓度为2mmol/L的三磷酸腺苷、浓度为1mmol/L的TODB、浓度为0.1mL/L的TritonX-100、浓度为0.01mL/L的proclin300、浓度为20g/L的海藻糖、浓度为30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
试剂组合物(2)包括的具体成分及使用终浓度如下：
浓度为10KU/L的乙酰辅酶A氧化酶、浓度为10KU/L的过氧化物酶、浓度为1mmol/L的4-AAP、浓度为0.1mL/L的TritonX-100、浓度为0.1g/L的N-乙基顺丁烯二酰亚胺、浓度为0.01mL/L的proclin300、浓度为20g/L的海藻糖、浓度为30mmol/L且pH为7.20的Tris-HCl缓冲液。
对比例
以实施例1-3的技术方案为基础，区别仅在于试剂组合物(1)中不添加漆酶，仪器参数、检测步骤同对应的实施例1-3，从而得到对应的对比例1-3(对比例1对应实施例1，对比例2对应实施例2，对比例3对应实施例3)，各对比例测定的不同羟苯磺酸钙浓度下游离脂肪酸浓度与空白血清的百分偏差(％)分别见表4-6：
表4对比例1测定的不同羟苯磺酸钙浓度下游离脂肪酸浓度与空白血清的百分偏差(％)
表5对比例2测定的不同羟苯磺酸钙浓度下游离脂肪酸浓度与空白血清的百分偏差(％)
表6对比例3测定的不同羟苯磺酸钙浓度下游离脂肪酸浓度与空白血清的百分偏差(％)
可以看出，各对比例的百分偏差(％)均远远大于实施例的百分偏差(％)。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。