具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本发明中，微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及原料、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，微生物限度检查应在环境洁净度C级下的局部A级的单向流空气区域内进行，检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物再污染，并定期对工作台面及环境进行浮游菌、沉降菌、尘埃粒子、表面微生物的检测。

在本发明中，实验用具的准备：

培养基和稀释剂，沙氏葡萄糖琼脂培养基，大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)，含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，用100ml量筒，量取80ml纯化水至三角瓶中，再加入20ml聚乙二醇200，使总体积为100ml，加入0.2克氯化钙，溶解，混合均匀，即为含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，121-124℃蒸汽灭菌30-31分钟，取实验用250ml三角瓶、100ml量筒、10×150mm小试管、离心管、90mm玻璃培养皿、加样头，用呼吸袋封好，121-124℃条件下蒸汽灭菌30-31min。

在本发明中，菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂斜面上，30-35℃培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20-25℃培养2-3天。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌数≤100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨脂80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用含0.05％(ml/ml)聚山梨脂80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数≤100cfu的孢子悬液，菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2-8℃，可在24小时使用。

在本发明中，菌液初步计数：取以上金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及黑曲霉5种≤100cfu稀释度菌悬液各1ml，分别注入培养皿中，立即倾注15-20ml温度不超过45℃的琼脂培养基，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌悬液注入胰酪大豆胨琼脂培养基，凝固后倒置平皿，30-35℃培养18-24小时计数。白色念珠菌、黑曲霉菌悬液注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固后倒置平皿，20-25℃培养，白色念珠菌2-3天计数，黑曲霉5-7天计数。填写附件3《微生物计数确认记录》。

在本发明中，土霉素中霉菌及酵母菌检验方法验证(平皿法)：

一、土霉素供试液准备

步骤1：在洁净室内超净工作台上，把10g土霉素样品，加入三角瓶中，用灭菌量筒准确量入100ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，充分振摇30s，作为1：10的供试液。

步骤2：从1：10的供试液中，用专用加样枪吸取1ml到15×150mm小试管中，再换加样头吸取9ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200到小试管中，充分振摇30s，作为1：100的供试液。

二、验证过程

步骤1试验组：

取1：10、1：100的供试液1ml和1ml≤100cfu/ml的白色念珠菌、黑曲霉菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

步骤2菌液组：

取1ml≤100cfu/ml的白色念珠菌、黑曲霉试验菌，不加供试液，按a操作。

步骤3供试品对照组：

取1：10、1：100供试液1ml，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

步骤4稀释剂对照组：

(在进行土霉素的微生物限度测定时，供试品稀释要用稀释剂含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200溶液，所以进行增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度)。

取上述稀释剂1ml和1ml≤100cfu/ml白色念珠菌、黑曲霉试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

步骤5空白组：

为考察做样过程中对供试液是否有污染，进行空白实验。

取稀释剂1ml注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

三、验证试验

至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率，霉菌和酵母菌的计数使用沙氏葡萄糖琼脂培养基20-25℃倒置培养5天。填写附件4《霉菌及酵母菌检验方法试验记录》。

四、可接受标准

步骤1：空白组应无菌生长

步骤2：在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均应在50-200％。回收率计算公式如下：

在本发明中，土霉素中需氧菌计数方法的验证(离心沉淀和薄膜过滤结合法)

一、供试品对照组

取土霉素供试液准备步骤1中1:10的土霉素供试液10毫升用封口膜封口，先在旋涡混合器上旋3分钟，成为悬浮液，使土霉素中污染的微生物分散到溶液中，再于离心机上2000转/分离心3分钟，吸取上清液1ml加入99ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，混合均匀，取混合液50ml全部薄膜过滤，用含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200作为冲洗液，每次100ml，共冲洗5次，总共冲洗量500ml，将滤膜取下，滤膜向上贴在TSA平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数。

二、试验组

前部分操作同上，只是在加最后一次冲洗液时，分别加入≤100cfu/ml铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，滤后，再将滤膜取下，滤膜向上贴在琼脂平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数。

三、菌液组

先加少量含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，将滤膜湿润后，分别加入≤100cfu/ml铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，再用100毫升含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200冲洗，将滤膜取下，滤膜向上贴在琼脂平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数。

四、稀释剂对照组

在灭菌离心管内分别加入1ml(每ml含≤100cfu上个稀释级别)铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，再加入灭菌的9毫升含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，用封口膜封口，先在旋涡混合器上旋3分钟，使菌均匀分布，再于离心机上2000转/分离心3分钟，取上层溶液1ml，薄膜过滤，用含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200溶液冲洗，每次100毫升共冲洗5次，总冲洗量500ml，将滤膜取下，滤膜向上贴在琼脂平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数。

五、空白

取含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200溶液10毫升用封口膜封口，先在旋涡混合器上旋3分钟，再于离心机上2000转/分离心3分钟，吸取上层溶液1ml加入99ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，混合均匀，取混合液50ml全部薄膜过滤，用含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200作为冲洗液，每次100ml，共冲洗5次，总共冲洗量500ml，将滤膜取下，滤膜向上贴在TSA平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数。

六、验证试验

至少应进行3次独立的平行试验，需氧菌的计数使用胰酪大豆胨琼脂培养基30-35℃倒置培养3天，并分别计算各试验菌每次试验的回收率，填写附件5《需氧菌检验方法试验记录》。

七、可接受标准

步骤1：空白组应无菌生长。

步骤2：在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均应在50-200％。回收率计算公式如下：

试验组的菌回收率(％)＝(试验组菌落数－供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数×100％

稀释剂对照组的菌回收率(％)＝稀释剂对照组菌落数/菌液组菌落数×100％

八、异常情况处理

验证过程中应严格按照验证方案及涉及到的标准操作规程执行，出现不符合验证可接受标准的结果或其他异常时，应按照SMP-08-007.05《偏差处理管理制度》，SOP-11-00900.6《超标数据(OOS)处理标准操作规程》，进行记录，调查，分析，并根据SMP-02-001.3《质量风险管理(QRS)制度》进行评估，根据最终结论，确定异常是否可以接受；是否对验证对象，验证方案进行调整；是否重新开展验证等工作。

本发明中的再验证

一、定期再验证

首次验证后，由质量管理人员根据SMP-12-001.1《传统产品的验证与确认总计划(VMP)》规定的方法，给定再验证周期。并根据验证对象运行情况，对再验证周期组织定期评估。

二、变更再验证

验证对象发生属于SMP-13-001.1《变更控制管理制度》定义的变更后，按照SMP-02-001.3《质量风险管理(QRS)制度》进行风险评估，根据评估结论决定是否采取验证，以及再验证的方式。

在本发明中，寻找合适的溶剂增加土霉素的溶解度或薄膜抽滤过程优于现有溶剂且对微生物生长无抑制，土霉素在中性条件下无法溶解，只能以混悬液的形式存在，20％聚乙二醇200对土霉素溶解度稍微高点但1：10、1：100溶液也是混悬液，无法完全溶解，20％聚乙二醇200薄膜抽滤过程快而且不会产生泡沫，从实际操作来讲优于现有的pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，而且经验证20％聚乙二醇200对菌落无抑制。

在本发明中，离心的目的是使土霉素沉淀，做样取上清液，但如果需要检测的菌落也沉淀，就不能检测产品的真实数据，所以要验证离心过程是否影响菌落分布。

在本发明中，经验证加入0.2％氯化钙，可以去除产品抑菌性提高菌落回收率。

在本发明中，冲洗量少，残留土霉素会抑制菌落生长，无法准确检出样品中的菌落，冲洗量太大，会对样品中的微生物造成损伤，所以需要试验准确的冲洗次数、冲洗量让菌落回收率在50％-200％之间，经过反复试验每次冲洗100ml、共冲洗5次为最佳冲洗方式。

在本发明中，验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

本发明中的土霉素微生物限度检验方法验证，通过平皿法、离心沉淀与薄膜过滤结合法确认霉菌及酵母菌、需氧菌计数方法，平皿法对霉菌及酵母菌计数回收率为71％-89％，稀释剂对照组回收率为74％-91％，均在50-200％范围内，符合方案要求，本方法可以用于检测土霉素中霉菌和酵母菌，采用离心沉淀与薄膜过滤结合法对需氧菌进行计数，试验组回收率为69％-91％，稀释剂对照组回收率为67％-94％，均在50-200％范围内，可以用于检测土霉素中需氧菌。

土霉素中的微生物限度检验方法步骤：

1、采用平皿法对土霉素中霉菌及酵母菌计数，土霉素供试液准备，供试液使用前需手动上下振荡摇匀30s，在洁净室内超净工作台上，把10g土霉素样品，加入三角瓶中，用灭菌量筒准确量入100ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，充分振摇30s，作为1：10的供试液，从1：10的供试液中，用专用加样枪吸取1ml到15×150mm小试管中，再换加样头吸取9ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200到小试管中，充分振摇30s，作为1：100的供试液；

2、试验组，取1：10、1：100的供试液1ml和1ml≤100cfu/ml的白色念珠菌、黑曲霉菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数；

3、菌液组，取1ml≤100cfu/ml的白色念珠菌、黑曲霉试验菌，不加供试液，按步骤S2操作；

4、供试品对照组，取1：10、1：100供试液1ml，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数；

5、稀释剂对照组，取上述稀释剂1ml和1ml≤100cfu/ml白色念珠菌、黑曲霉试验菌,分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数，进行土霉素的微生物限度测定时，供试品稀释要用稀释剂含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200溶液，为此增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度；

6、空白组，取稀释剂1ml注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数；

7、进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率，霉菌和酵母菌的计数使用沙氏葡萄糖琼脂培养基20-25℃倒置培养5天；

8、采用离心沉淀和薄膜过滤结合法对土霉素中需氧菌计数，供试品对照组，取步骤S2中1:10的土霉素供试液10毫升用封口膜封口，先在旋涡混合器上旋3分钟，成为悬浮液，使土霉素中污染的微生物分散到溶液中，再于离心机上2000转/分离心3分钟，吸取上清液1ml加入99ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，混合均匀，取混合液50ml全部薄膜过滤，用含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200作为冲洗液，每次100ml，共冲洗5次，总共冲洗量500ml，将滤膜取下，滤膜向上贴在TSA平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数；

9、试验组，前部分操作同上，只是在加最后一次冲洗液时，分别加入≤100cfu/ml铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，滤后，再将滤膜取下，滤膜向上贴在琼脂平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数；

10、菌液组，先加少量含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，将滤膜湿润后，分别加入≤100cfu/ml铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，再用100毫升含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200冲洗，将滤膜取下，滤膜向上贴在琼脂平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数；

11、稀释剂对照组，在灭菌离心管内分别加入1ml(每ml含≤100cfu上个稀释级别)铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，再加入灭菌的9毫升含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，用封口膜封口，先在旋涡混合器上旋3分钟，使菌均匀分布，再于离心机上2000转/分离心3分钟，取上层溶液1ml，薄膜过滤，用含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200溶液冲洗，每次100毫升共冲洗5次，总冲洗量500ml，将滤膜取下，滤膜向上贴在琼脂平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数；

12、空白，取含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200溶液10毫升用封口膜封口，先在旋涡混合器上旋3分钟，再于离心机上2000转/分离心3分钟，吸取上层溶液1ml加入99ml含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200，混合均匀，取混合液50ml全部薄膜过滤，用含0.2％氯化钙的20％聚乙二醇200作为冲洗液，每次100ml，共冲洗5次，总共冲洗量500ml，将滤膜取下，滤膜向上贴在TSA平板上，于30-35℃倒置培养72小时后，计数；

13、上述步骤S8-S 12验证试验3次独立的平行试验，需氧菌的计数使用胰酪大豆胨琼脂培养基30-35℃倒置培养3天，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

14、平皿法对霉菌及酵母菌计数回收率为71％-89％，稀释剂对照组回收率为74％-91％，均在50-200％范围内，符合方案要求，可以用于检测土霉素中霉菌及酵母菌。

15、采用离心沉淀法与薄膜过滤法相结合的方法对需氧菌进行计数，试验组回收率为69％-91％,稀释剂对照组回收率为67％-94％，均在50-200％范围内，符合方案要求，可以用于检测土霉素中需氧菌。

微生物计数确认记录表

霉菌及酵母菌检验方法试验记录表

需氧菌检验方法试验记录表

细菌检验方法试验记录表

备注：试验组菌回收率(％)＝(试验组菌落数－供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数×100％

稀释剂对照组菌回收率(％)＝稀释剂对照组菌落数/菌液组菌落数×100％

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。