具体实施方式

本文公开的指的是如“Phoenix AP”的样本制备器械(下文称为样本制备或制备平台)、或如BD Phoenix^TM的AST系统，或指的是如“BD EpiCenter”系统的具有用户界面的数据管理系统，或指的是如“BD BACTEC^TM”的血液培养分析器械，或指的是如MALDI的质谱系统，但应理解，这些术语的含义不限于具有这些商标名称的器械，而是可以包括具有基本上相似功能的器械。具有基本上相似功能的器械可以包括BacT/Alert(bioMerieux)和VersaTREK(Trek)血液培养系统，以及Vitek(bioMerieux)和MicroScan(SiemensHealthcare)ID/AST系统。

在一个实施方式中，本文描述的系统将MALDI仪器的微生物鉴定能力与实验室分析或处理系统(如Phoenix、Phoenix AP、BACTEC或EpiCenter系统)的AST和数据处理能力集成在一起。

在另一个实施方式中，Phoenix AP被修改以不仅为Phoenix板制备AST接种物，而且为MALDI板制备相同的样本。通过确保应用到MALDI板的分离物是来自用于抗微生物剂敏感性试验的完全相同的样本，该特征提供了为在MALDI板上制备的样本进行肯定鉴定(positive identification)的自动化优势。

MALDI、样本制备、AST系统、和/或血液培养仪器与数据管理系统(如EpiCenter系统)交流。EpiCenter提供了实时数据获取和分析工具，以改善患者护理。EpiCenter能够及时监控、分析和交流微生物学数据，从而直接控制、监控和改善患者护理。Phoenix产生AST结果，且MALDI仪器产生鉴定结果。EpiCenter合并结果，并应用专家规则(expert rules)为样本产生最终的ID/AST结果。这种应用专家规则的系统的实例是BDXpert^TM。

图7示出了根据本发明的实施方式的检测和分析微生物样本的系统100的框图。系统100的各种部件包括样本制备平台102(如Phoenix AP)、质谱仪104(如MALDI-TOF)、AST系统106(如Phoenix)、血液培养系统108(如BACTEC仪器)、制备的平板培养基110(例如，手动制备或由诸如Innova的系统制备)、数据管理系统112(如EpiCenter)、和实验室信息系统116(“LIS”)，实验室信息系统116经由ID/AST链路114从数据管理系统112接收数据，并经由PT Info链路118将患者信息提供给数据管理系统112。

在系统100中，样本制备系统提供有例如从制备的板挑取或从血液培养小瓶中取出的细菌。在一个实施方式中，用细菌样本过度接种小池。小池有利地被用作用于ID和AST的样本来源。这样可以确保不仅相同的患者样本，而且相同的分离物都经受ID和AST测试。

样本制备平台102为ID和AST两者制备样本，而AST系统106产生AST结果，且质谱仪104产生ID结果。数据管理系统112存储ID结果和AST结果，任选地应用专家规则以产生用于样本的最终组合的ID/AST结果，并且还与LIS系统交互。

参考图1，过程开始于收集样本(典型地来自培养板或培养管)的步骤150，并且在步骤155，将该样本递送到悬浮液中。在步骤160测量悬浮液的浊度，以及然后在步骤165评估浊度以确定测量的浊度是否在预定范围内。因为用于接种MALDI板或液体培养基管的样本的体积受到自动移液器可准确转移的体积的限制，并且在移液器的体积限制内，所以预定范围是必要的。在这方面，当前的移液器被配置以转移不超过约10mL(即，1000μL)至约12mL(即1200mL)的悬浮液。

如果悬浮液的浊度在目标范围内，则基于浊度读数，在步骤170，计算用必要量的样本接种液体培养基管需要的悬浮液的所需体积。在步骤175，使用移液器从悬浮液中抽吸计算体积的悬浮液。如果悬浮液太稀，则接种MALDI板或液体培养基管以递送目标量的样本所需的体积将太大，以至于移液器无法容纳(至少在一次转移中)。如果悬浮液太浓(heavy)，则仅需小体积的悬浮液用于MALDI板或液体培养基管的接种。小体积的抽吸和分配很难精确控制，这使得难以递送精确量的样本用于MALDI板或液体培养基管的接种。根据图1中示例的方法，在一个实施方式中，预定的浊度在约0.2麦氏单位至约2麦氏单位的范围内。如果悬浮液在该范围之外，则在步骤180指定纠正方案。如果悬浮液太浓缩的，则使悬浮液经受稀释方案185，稀释方案185将浓度降低至目标范围。稀释方案185很大程度上是设计选择的问题，并且典型地由去除一些体积的悬浮液并用稀释液代替它组成。基于浊度测量值选择悬浮液的去除体积。如果稀释方案185成功，则在步骤190，通过使用在步骤170中计算的悬浮液体积，将悬浮液用于接种AST液体培养基管。稀释方案的一个示例性实例在本文后面描述。如果稀释方案不成功，则在步骤191丢弃样本。

如果在步骤180确定悬浮液太稀释的，则在步骤195悬浮液经受浓缩方案以增加悬浮液中样本的浓度。这种浓缩方案需要将样本添加到悬浮液中。浓缩方案195在很大程度上是设计选择的问题，并且典型地由向稀释液添加一些额外样本组成。递送到悬浮液中的额外样本的量难以精确控制，因此在浓缩方案完成后，浓缩方案可能需要额外浊度测量以确定悬浮液的浊度。如果在步骤190的方案成功，则通过在步骤170计算将目标量的样本接种到液体培养基管中所需的悬浮液体积，将悬浮液用于接种液体培养基管，并在步骤175抽吸该体积的悬浮液以接种靶板。如果浓缩方案不成功，则在步骤191丢弃样本。

稀释方案的一个实例在本文后面描述。预期稀释方案和浓缩方案都需要在悬浮液被浓缩或稀释后进行额外的浊度测量。

被用于接种用于鉴定的板(例如，MALDI板)或用于抗生素敏感性试验(AST)的液体培养基管的悬浮液的量基于每单位体积悬浮液携带的样本量。一旦制成了悬浮液，如果悬浮液中样本的浓度(即，样本浊度)太高(例如，约2麦氏单位或以上)，则将该量的样本接种到MALDI板上或AST液体培养基管中所需的悬浮液体积可能相当小。小体积难以准确移液。

因此，如果递送到悬浮液中的样本量使得悬浮液中的样本浓度(如通过悬浮液浊度测量)高于预定范围的上限阈值(例如，高于2麦氏单位)，则悬浮液经受稀释方案以降低浊度，使得悬浮液的浊度在预定范围内。如果递送到悬浮液中的样本量是使得悬浮液的浊度低于预定范围的下限阈值(例如，低于约0.2麦氏单位)，则需要额外样本以增加悬浮液中样本的浓度(如果没有额外样本可获得，则将悬浮液搁置(set aside))。

在一个实例中，制备的悬浮液的测量的浊度在约3麦氏单位的范围内。在该示例中，预定的浊度范围是约0.2麦氏单位至约2麦氏单位。基于该浊度测量值，系统确定以使该悬浮液经受稀释方案。

预定的浊度范围在很大程度上是设计选择的问题。确定广泛范围的因素包括：i)用于测量浊度的器械(例如，比浊计)的准确性；ii)比浊计的读取窗口；以及iii)移液器的准确性和能力。根据该方法，制成具有较高的麦氏单位值的悬浮液，以及然后稀释以将浊度降低至将目标量的样本递送到ID或AST试验的值。

在另一个实例中，获得样本并将其接种到悬浮液稀释液中。测量悬浮液的浊度。确定测得的浊度在预定范围内(例如，约0.2麦氏单位至约2麦氏单位)。基于接种所需的样本量，获得将目标量的样本携带到MALDI板或AST液体培养基管中的悬浮液体积。根据一个实施方式，通过从培养皿挑取一定量的菌落并将挑取的样本递送至悬浮液中来制备悬浮液。

在另一个实例中，获得样本并将其接种到悬浮液稀释液中。确定测量的浊度低于预定范围(即，低于约0.2麦氏单位)。在此实例中，获取了额外样本并将其接种到悬浮液中以增加样本的浊度。重新测量悬浮液的浊度。如果浊度在预定范围内，则获得指定体积的悬浮液，以将目标量的样本递送到MALDI板上或AST液体培养基管中。如果调节后的浊度太高，则使用稀释方案以稀释悬浮液。如果调节后的浊度保持太低，则重复该过程(如果有待获取的剩余额外样本)。如果没有额外样本，则不使用悬浮液，并将其置于自动化过程之外。如果进行重复尝试以获得浊度在预定范围内的悬浮液不成功，则将悬浮液置于自动化过程之外。

悬浮液稀释液的体积在很大程度上是设计选择的问题。悬浮液的体积不能太低，因为这将导致悬浮液的浊度远远高于目标浊度范围，需要多个稀释步骤以获得具有目标浊度的悬浮液。悬浮液体积的量不能太高，否则接种的悬浮液的浊度将太低，需要多个步骤以获取目标浊度范围内的悬浮液浓度。

在一个实施方式中，样本最初被接种到其中的悬浮液稀释液的体积为约200μL至约400μL。可替代地，悬浮液稀释液体积的范围为约250μL至约350μL。在一个实例中，样本被接种到其中的悬浮液稀释液的体积为约300μL。

在图2和图3中示例了具有具体浓缩/稀释方案的工作流程的实例。通常，在步骤200获取样本。在210，如果确定样本为粘液样样本，则在步骤220，将样本与稀释液混合，并在270测量其浊度(以麦氏单位计)。

如果样本不是粘液样样本，则在步骤230稀释之前确定样本的浊度。在步骤240，如果常规样本的悬浮液的初始麦氏单位值大于2麦氏单位，或者如果怀疑含有链球菌的样本的悬浮液的初始麦氏单位值大于约1麦氏单位，则悬浮液继续进行到步骤250，其中将去离子水添加到悬浮液并混合悬浮液。如果常规样本的初始麦氏单位值小于或等于约2(或者对于怀疑含有链球菌的样本，如果初始麦氏单位值小于或等于1)，则样本准备好混合并且样本继续进行到步骤220。

在步骤250，在具有机器人移液器的自动化系统中，机器人移液器拾取1000μL的移液器枪头(pipette tip)，并将950μL的去离子水分配到含有悬浮液的小池中。如果怀疑样本含有链球菌，则机器人移液器拾取1000μL的移液器枪头，并将495μL去离子水分配到含有悬浮液的小池中。在手动程序中，获得了1000μL的移液器枪头，并将上述量的去离子水分配到悬浮液中。

在步骤220，获得悬浮液的1000μL等分部分，并通过一系列约五(5)次抽吸和约250μL悬浮液的分配来用于混合样本。然后将移液器枪头丢弃。

在步骤260，将在步骤250中未被分配到悬浮液中的去离子水分配到废物中。另外，如果稀释样本的体积超过体积上限，则将多余体积的悬浮液去除。

在步骤270，使用比浊计测量稀释的悬浮液的浊度。测量浊度和用于测量浊度的装置是本领域技术人员公知的，且本文不详细描述。在WO 2016/034554中描述了用于测量浊度的方法和器械。在图2和图3的方案中，由于样本浊度值决定了在图2和图3中示例的工作流程中如何处理悬浮液，所以导致悬浮液中样本浓度变化的任何步骤都需要新的浊度测量。

在步骤280，评估测量的样本浊度。如果小池悬浮液的麦氏单位值小于0.2，则该悬浮液不能用于接种AST液体培养基管。系统会将样本与错误标记(error flag)链接，以确保该悬浮液不用于接种AST液体培养基管。系统将用此信息进行更新，并且将悬浮液搁置。如果悬浮液的麦氏单位值大于0.2，则该悬浮液可以潜在地用于接种AST液体培养基管。

在步骤290，如果悬浮液的麦氏单位值大于或等于0.2但小于或等于2(如果怀疑样本含有链球菌，则该范围大于或等于0.2但小于或等于1)，则该方法继续进行到步骤295，其中计算目标量的样本将被递送到AST液体培养基管中的悬浮液的接种体积。

使用以下关系式为常规AST液体培养基计算体积：

增加的体积＝(0.55÷(悬浮液的测量的麦氏单位值))×47.5μL (1)

例如，如果悬浮液的测量的浊度为2.3，则用于接种AST液体培养基管的悬浮液的体积为(0.55÷2.3)×47.5μL＝11.36μL。如果样本是链球菌AST样本，则根据以下关系式用一定体积接种液体培养基：

增加的体积＝(0.55÷(悬浮液的测量的麦氏单位值))×25.00μL (2)

如果麦氏单位值大于2(如果怀疑悬浮液含有链球菌，则为1)，则在步骤296，确定样本已被稀释的次数。如果稀释次数小于三，则将悬浮液返回步骤250以进行进一步稀释和混合(且如果需要进一步稀释，则减少悬浮液的体积)。如果稀释次数为三(3)，则由于样本已超过允许的最大稀释步骤数，因此会发出错误消息。

图3描述了使用悬浮液接种液体培养基管而不标准化悬浮液的浊度的过程。该过程从制备的悬浮液开始，已从制备的悬浮液去除了少量悬浮液并用于接种MALDI板。参考图3A，在步骤300获得该悬浮液。在步骤310，确定在MALDI点样(spotting)之后的悬浮液的体积。实际体积根据以下关系式确定：

实际体积＝V_s(例如，330μL)-((目标板点的数量×悬浮液层的数量)×V_点[例如，3μL])-(层数×缓冲余量(buffer margin))-(蒸发率×甲板寿命(deck life)以小时计)(3)

在以上方程式中，V_s是悬浮液体积，V_点是沉积在MALDI板上的悬浮液的每个点体积。例如，含有悬浮液的小池(已经从小池去除足够用于靶板(target plate)上的一个点和4层的体积)的体积将为330μL-((1×4)×3μL)-(4×3)-(10×3)＝276μL实际小池悬浮液体积。假设悬浮液的甲板寿命为三个小时。在步骤320，评估样本以确定其是否为粘液样样本。如果样本是粘液样的，则样本继续进行至步骤370，在此稀释样本并将悬浮液混合并测量其浊度。如果样本不是粘液样的，则样本继续进行至步骤330。悬浮液的初始浊度确定被用于开始初始浓的悬浮液的处理，使得该悬浮液可用于接种用于AST的液体培养基管。

在步骤340，如果悬浮液的初始浊度大于或等于预定阈值(例如，0.75麦氏单位)，则将去离子水添加到悬浮液，并在步骤350中混合悬浮液。如果悬浮液的初始浊度小于预定阈值(例如，0.75麦氏单位)，则方法继续进行至用于该悬浮液的步骤370。如本文其它地方所提到的，在图2和图3的描述中阐述的浊度和体积阈值是示例性的而非限制性的。

在步骤350，获得移液器枪头(1000μL)并将一定体积的去离子水分配到目标小池中。这可以手动完成，或可以使用安装在构台(gantry)上的机器人移液器完成。被分配的去离子水的体积通过以下公式计算：

去离子水的体积＝((初始麦氏单位值÷0.75)×实际小池体积)-实际小池体积(4)根据方程式4，实际麦氏单位值与阈值麦氏单位值之比率被用于确定添加的去离子水的体积。如果实际麦氏单位值在上限阈值以下，则不向悬浮液添加去离子水。使用上面的实例，初始麦氏单位值为1.4，去离子水的体积为((1.4÷0.75)×276μL)-276μL＝239μL。在步骤360，如果计算出的体积小于最大体积(例如，对于1000μL的移液器枪头，为950μL)，则将计算的体积的去离子水添加到样本(在图3A中表明为“使用确定的体积”)。如果待添加的去离子水的量超过950μL，则仅添加950μL的最大体积(在图3A中表明为“设置最大体积”)。

在步骤370，使用移液管枪头(1000μL)通过一系列约五(5)次抽吸和约250μL悬浮液的分配来混合样本。在第五次循环后，然后将移液器枪头丢弃。

在步骤380，确定是否需要向悬浮液添加额外体积(即，去离子水)。如果需要额外体积，则悬浮液继续进行至步骤390，在此将额外稀释液(去离子水)添加到悬浮液。如果增加的体积导致悬浮液超过体积限制，则应去除悬浮液以减少悬浮液体积，使得体积处于或低于体积上限。如果不需要额外的稀释液，则该方法继续进行至步骤400(图3B)，在此使用比浊计测量悬浮液的浊度。悬浮液的后续处理由测量的浊度确定(在该实施方式中，测量的浊度以麦氏单位测量)。

具体地，如果麦氏单位值小于0.2，则不能使用悬浮液并且产生错误消息。参见图3B中的步骤410。如果麦氏单位值大于或等于0.2，则在步骤420，如果麦氏单位值为0.2至0.3(这是0.25麦氏单位值+/-20％)，则将悬浮液被用作用于AST板的样本来源。

如果麦氏单位值大于0.3，则在步骤430，确定麦氏单位值是否在0.5到0.6的范围内(这是0.55麦氏单位值+/-10％)。确定这种悬浮液适合用作用于接种在AST板中使用的液体培养基的样本来源。在步骤430，如果悬浮液的浊度在0.5至0.6麦氏单位的范围之外，则样本继续进行至步骤440，在此悬浮液的先前稀释数确定了悬浮液的进一步处理。如果悬浮液已经被稀释了5次，则对于该悬浮液会发出错误消息，并且其不会被用作用于AST液体培养基接种的样本来源。

如果悬浮液已被稀释少于五次，则在步骤450，悬浮液返回步骤360以在步骤370进一步稀释。对于被确定具有在预定范围(使这些悬浮液适合用作AST液体培养基接种的样本来源)内的麦氏单位值的那些悬浮液，可以根据以下表1中的一览表(schedule)稀释悬浮液，而无需进一步浊度测量。

表1

为了从具有以上表1所述范围内的浊度的样本获得具有目标麦氏单位体积的悬浮液，根据以下关系式稀释样本：

增加的体积＝((测量的麦氏单位值(步骤370)÷目标麦氏单位值)×实际体积)-实际体积 (5)

例如，在步骤350使用小池体积，如果悬浮液的初始测量麦氏单位值为1，则添加体积等于((1÷0.75)×276)-276，即92μL稀释液(例如，去离子水)被添加到悬浮液以产生具有目标麦氏单位值0.75的悬浮液。然而，如果待添加的体积量超过950μL，则仅将950μL添加到样本。

在步骤370，一旦确定增加的体积，则指定体积的稀释液(例如，去离子水)被添加到样本。为此目的获得了1000μL的移液器枪头(在自动化环境中，机器人移液器获取移液器枪头，以及然后经由构台平移移液器以将移液器定位在悬浮液上)。使用移液器枪头，通过吸取一定体积的悬浮液以及然后从移液器枪头分配该一定体积的悬浮液，来混合悬浮液。在悬浮液上方用移液器枪头分配最后的五十(例如，50μL)，以确保移液器枪头完全是空的。

如果目标麦氏单位值为0.55或0.25，并且在稀释后小池中的悬浮液的总体积大于1500μL，则从悬浮液中去除体积，使得悬浮液不超过最大体积。参照步骤390，根据以下公式去除多余的体积：

待去除的体积＝实际体积(μL)-1500μL (6)

然而，如果稀释次数超过5次，则样本已被稀释太频繁，且不能用于自动AST跟踪(follow up)。在这种情况下，将产生错误消息。如果先前稀释的次数少于五次，则将悬浮液返回至步骤360用于如前所述的稀释。

评估了上述方法，其中根据以上方法(替代调节为MALDI制成的浓悬浮液的麦氏单位值，并基于浊度(例如，麦氏单位)规格用预定体积接种AST板)计算了AST接种物的体积，以确定其对AST液体培养基接种的效力。为了此确定，使用了大肠杆菌QC菌株BACTECA25922，以测试计算达到在AST液体培养基管中可接受的生物体浓度需要的接种物体积的再现性。对于大肠杆菌(BACTEC A25922)，浓度的预定范围在2×10⁵和8×10⁵CFU/mL之间。BACTEC A25922还用于将本文所述方法(其中评估悬浮液并基于悬浮液浊度确定悬浮液体积)与以下过程进行比较，在该过程中制备用于MALDI的浓悬浮液然后稀释至目标浊度(例如，0.5-0.6麦氏单位或0.2-0.3麦氏单位)并使用一致体积(consistent volume)的该悬浮液以接种AST液体培养基管。使用这两种方法测试了二十(20)个样本(总共40个样本)，并使用了平板计数以测量AST液体培养基管中的细菌浓度。还分析了来自处理过的AST板的AST结果。

如图6中报告的，对于不同的麦氏单位起始值，所有40个样本结果为AST液体培养基浓度均在2×10⁵至8×10⁵CFU/mL内。对于所有40个样本，所有最小抑菌浓度均完全一致。因此，得出的结论是，稀释浓悬浮液以及然后确定将目标量的样本递送到AST液体培养基中所需的悬浮液体积的过程是可再现的，并且对于该QC菌株，该过程的性能与稀释过程相同，达到标准化浊度值(McFarland)。

参考图4，示例了AST液体培养基管中的大肠杆菌浓度相对于使用Direct AST来接种AST液体培养基管的悬浮液的最终浊度。误差条代表为每个样本制备的9个平板计数的标准偏差。顶部和底部虚线表明可接受浓度范围的极限，2×10⁵至8×10⁵CFU/mL，且中间的虚线代表范围的中间(5×10⁵CFU/mL)。

参考图5，AST液体培养基管中的大肠杆菌浓度相对于用于接种AST液体培养基管的悬浮液的最终浊度，使用稀释方案将悬浮液稀释至目标麦氏单位值(0.5-0.6麦氏单位)。误差条代表为每个样本制备的9个平板计数的标准偏差。顶部和底部虚线表明可接受浓度范围的极限，2×10⁵至8×10⁵CFU/mL，且中间的虚线代表范围的中间(5×10⁵CFU/mL)。

参考图6，无论是将悬浮液的浊度调节到目标浊度内或无论将接种物的体积调节以将目标量的样本接种到AST液体培养基中，每种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)都相同。

尽管本文已经参考具体实施方式描述了本发明，但是应当理解，这些实施方式仅是本发明的原理和应用的示例。因此，应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对示例性实施方式进行多种修改，并且可以设计其它布置。