雷公藤内酯醇在制备用于治疗car-t诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途
阅读说明：本技术 雷公藤内酯醇在制备用于治疗car-t诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途 (Application of triptolide in preparing medicine for treating CAR-T induced cytokine release syndrome ) 是由 朱学军 田芳 陈碧清 代兴斌 孔祥图 徐祖琼 姜鹏君 于 2020-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了雷公藤内酯醇在制备用于治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途。本发明研究发现雷公藤内酯醇可以选择性清除外周血活化的单核细胞,快速遏制CAR-T治疗后发生的CRS,对体内CAR-T细胞不影响,可能为CRS提供一种起效快速、有效、安全、方便的治疗方法,同时也具有良好的成本效益比,能够大大降低患者的临床治疗费用。此外,对新型冠状病毒(COVID-19)感染后的重症患者发生的CRS,也有望起到积极的治疗作用。(The invention discloses application of triptolide in preparing a medicament for treating CAR-T induced cytokine release syndrome. The research of the invention finds that triptolide can selectively remove mononuclear cells activated by peripheral blood, quickly suppress CRS generated after CAR-T treatment, has no influence on CAR-T cells in vivo, possibly provides a treatment method for CRS with quick, effective, safe and convenient effect, has good cost-benefit ratio and can greatly reduce the clinical treatment cost of patients. In addition, CRS, which occurs in severe patients after infection with the novel coronavirus (COVID-19), is expected to have a positive therapeutic effect.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及雷公藤内酯醇的医用新用途，更具体地，涉及雷公藤内酯醇在制备用于治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途。
背景技术
表达嵌合抗原受体的转基因T细胞开辟了癌症免疫治疗的新领域，但常并发细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)，发生率高，表现为大量细胞因子短暂的、显著的升高以及一系列的临床症状，严重的可危及患者生命，是限制CAR-T细胞治疗广泛应用的主要不良事件。
CRS的治疗通常首先使用类固醇，对于以高热、低血压和低氧为特征的CRS，可以联合妥珠单抗输注治疗。近年来提出一系列的改良策略，包括对CAR-T改构以减少CRS的发生，中和去除体内GM-CSF，使用达沙替尼抑制CAR-T细胞等，但目前这些策略都仍难以较好地控制CRS。目前治疗CRS的方法主要是使用妥珠单抗(tocilizumab)和激素。应用妥珠单抗治疗CRS的效果并不理想，可能与其只能单一清除IL-6有关；激素可以比较有效地遏制CRS，但使用激素治疗CRS的同时也会导致大部分CAR-T细胞发生凋亡，影响CAR-T的长期疗效，同时易并发或加重感染。
近期的两个独立的模型系统证实小鼠体内单核细胞/巨噬细胞是CRS细胞因子的主要来源，应用氯膦酸脂质体清除小鼠体内的巨噬细胞和单核细胞可以阻止CRS的发生和致死，但氯膦酸脂质体因为毒副作用大不能用于人体；依托泊苷被认为较其它化疗药物更能够去除活化的单核细胞，但是效果也不甚理想，而且有加重造血抑制的潜在危害。因此目前仍缺乏能够选择性清除人体内单核细胞的有效药物。
以往的研究显示雷公藤内酯醇具有免疫抑制作用，主要集中在对T细胞及B细胞的免疫调控作用方面，而对髓系细胞研究较少。2011年Titov等证实雷公藤内酯醇作用靶点为XPB，通过抑制RNA酶转录实现实现其生物学效应；2013年Lu等报道TAB1是雷公藤内酯醇的作用靶点，30nM雷公藤内酯醇体外处理12h可以抑制小鼠巨噬细胞TAK1激酶活性，提示TAB1可能是炎症性疾病的潜在治疗靶点。但目前尚不清楚雷公藤内酯醇能否清除人体内单核细胞而遏制CRS。
发明内容
发明目的：本发明意外发现了雷公藤内酯醇在制备用于治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综合征上的用途。
具体地，根据动物实验，雷公藤内酯醇10μg/kg剂量连续注射3天，可以有效减少小鼠腹腔单核/巨噬细胞，20μg/kg剂量连续注射3天，可以显著减少小鼠腹腔单核/巨噬细胞，另外，当应用于人体时，推荐的雷公藤内酯醇的用量范围为0.5μg/kg-5μg/kg体重，优选地，1μg/kg-2μg/kg体重。
本申请发现雷公藤内酯醇选择性清除细胞因子释放综合征患者外周血中的单核细胞。体外实验表明，随着雷公藤内酯醇浓度增高，患者外周血中的单核细胞比例逐渐减少，100ng/ml雷公藤内酯醇可去除绝大部分单核细胞，而对T细胞的影响不大。
有益效果：
本发明发现，作为雷公藤多苷片的主要成分之一雷公藤内酯醇，可以快速遏制IL-6、IL-8、IL-5、IL-10、IL-17、IL-1β、TNFα、IFNγ，低剂量的雷公藤内酯醇可以选择性清除外周血活化的单核细胞，快速遏制CAR-T治疗后发生的CRS，对体内CAR-T细胞不影响，可能为CRS提供一种起效快速、有效、安全、方便的治疗方法。值得进一步注意的是，新型冠状病毒(COVID-19)感染患者与CAR-T治疗后发生的CRS具有相似的临床表现，伴有高烧、低氧和低血压，并伴有细胞因子风暴，我们的发现对COVID-19感染的治疗具有启发性。
附图说明
图1为雷公藤内酯醇体外对不同肿瘤细胞系的抑制活性检测的结果图；
图2、图3为腹腔注射雷公藤内酯醇对小鼠腹腔单核/巨噬细胞的影响的结果图；
图4为雷公藤内酯醇体外对CRS患者外周血中单核细胞及T细胞的影响的结果图。
图5为雷公藤内酯醇体外对CRS患者外周血细胞因子产生的影响的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1雷公藤内酯醇体外对单核细胞系的抑制活性。
1)取处于对数生长期的THP-1等10种人类血液系统及实体肿瘤细胞系，计数后以密度为2×103/ml每孔200μl细胞悬液细胞接种于96孔板中，放入培养箱培养5h后取后使用显微镜观察细胞状态，若细胞状态良好进行加药处理。
2)雷公藤内酯醇(Triptolide)以起始浓度200ng/ml 2倍稀释浓度递减的方式分5次处理10种细胞系，每株细胞系每个药物浓度设置3个复孔，共进行5次重复实验。
3)加药处理48h后，每个孔中加入20μl 5mg/ml MTT溶液，在37℃培养箱中孵育4小时。取出后除去培养基中液体并向每个孔中加入150μl DMSO，使用酶标仪在570nm下测量每个孔的光密度值，导出excel表格。
4)根据如下公式分别计算雷公藤内酯醇对各株细胞系的IC50值(请给出每种细胞系的IC50值)。
5)结果：
雷公藤内酯醇对各株细胞系的生长抑制作用(IC50值)检测结果如图1所示。表明雷公藤内酯醇对人单核细胞系THP-1的IC50值最低，显著低于其他血液系统肿瘤细胞包括B细胞(Raji)、T细胞(Jurkat)、浆细胞(ARP-1)，也低于其它实体肿瘤包括肺癌、肝癌、肠癌等细胞系。
实施例2雷公藤内酯醇选择性清除小鼠腹腔单核/巨噬细胞。
1)SPF级雄性6-8周龄C57BL/6小鼠15只，每只小鼠腹腔注射LPS(0111:B4,Sigma)4mg/kg体重(溶于0.2ml PBS)，诱导及活化腹腔单核/巨噬细胞。
2)24h后，将小鼠随机分为3组，每组5只，分别腹腔注射0.2ml PBS、Triptolide 10μg/kg、Triptolide 20μg/kg，连续注射3天。
3)第5天处死各组小鼠，以5ml PBS/2mM EDTA冲洗各小鼠腹腔，离心收集细胞，取2×106个细胞，冰上孵育，分别加入荧光标记的抗体F4/80-FITC，Ly6c-peVIO770及对照抗体，流式细胞仪检测。
4)结果：
雷公藤内酯醇(Triptolide)对LPS活化的小鼠腹腔单核/巨噬细胞影响的检测结果如图2和图3所示。表明雷公藤内酯醇10μg/kg剂量连续注射3天，可以有效减少小鼠腹腔单核/巨噬细胞，20μg/kg剂量连续注射3天，可以显著减少小鼠腹腔单核/巨噬细胞。
实施例3雷公藤内酯醇体外选择性清除CRS患者外周血中单核细胞。
1)CAR-T细胞输注后诊断CRS的患者，取肝素抗凝外周血2ml，加入完全培养基2ml，混匀，每孔100μl接种于96孔板中。
2)各孔再加入含雷公藤内酯醇的完全培养基100μl，雷公藤内酯醇最终浓度分别为0、1、3、10、30、100ng/ml，每个药物浓度设置3个复孔。
3)加药处理24h后，吹打收集各孔细胞，加入5ml流式细胞管，加入荧光标记抗体CD3-PE、CD14-FITC，冰上孵育30min，裂解红细胞后，流式细胞仪检测。
4)结果：
患者全血加入一系列浓度的雷公藤内酯醇体外培养24小时，结果表明，随着雷公藤内酯醇浓度增高，患者外周血中的单核细胞比例逐渐减少，100ng/ml雷公藤内酯醇可去除绝大部分单核细胞，而对T细胞的影响不大(图4)。
实施例4雷公藤内酯醇体外对CRS患者外周血细胞因子产生的影响。
1)CAR-T细胞输注后诊断CRS的患者，取肝素抗凝外周血2ml，加入完全培养基2ml，混匀，每孔100μl接种于96孔板中。
2)各孔再加入含雷公藤内酯醇的完全培养基100μl，雷公藤内酯醇最终浓度分别为0、0.3、1、3ng/ml，每个药物浓度设置3个复孔。
3)加药处理60h后，吸取各孔上清100μl，血清中多重细胞因子定量采用基于复合微球的流式细胞仪免疫分析法，数据通过Navios流式细胞仪(Beckman Coulter Cytomics)采集，并使用LEGENDplex v8进行分析。
4)结果：
患者全血加入一系列浓度的雷公藤内酯醇体外培养60小时，结果表明，随着雷公藤内酯醇浓度增高，外周血细胞培养上清中8种炎症相关的细胞因子水平逐渐降低，表明雷公藤内酯醇可以浓度依赖性方式抑制CRS的患者外周血细胞多种炎症相关细胞因子的表达分泌(图5)。
综上所述，雷公藤内酯醇在体内选择性地清除激活的单核细胞，从而迅速缓解CRS，而不影响功能正常的CAR-T细胞的数量和活性。值得进一步注意的是，新型冠状病毒(COVID-19)感染患者与CAR-T治疗后发生的CRS具有相似的临床表现，伴有高烧、低氧和低血压，并伴有细胞因子风暴，我们的发现对COVID-19感染的治疗具有启发性。