一种人工种植体
阅读说明：本技术 一种人工种植体 (Artificial implant ) 是由 吴连俊 刘崇星 刘劲松 姚李韬 刘传通 姚丽丽 杨颖� 于 2020-03-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人工种植体,其技术方案是包括基体和涂层,所述基体为氧化锆陶瓷,所述涂层为表面形成纳米孔结构的钽涂层,所述钽涂层的纳米孔径在15～50nm,所述钽涂层的厚度在0.5～2μm,还包括一种人工种植体的制备方法,本发明提供一种人工种植体,该种植体的基体选为氧化锆,利用磁控溅射结合阳极氧化技术,在氧化锆表面上形成具有一定厚度且与氧化锆基体结合力良好的钽纳米结构涂层,增加种植体表面的粗糙度和亲水性,促进氧化锆种植体早期骨结合。(The invention discloses an artificial implant, which comprises a substrate and a coating, wherein the substrate is zirconia ceramic, the coating is a tantalum coating with a nano-pore structure formed on the surface, the nano-pore diameter of the tantalum coating is 15-50 nm, and the thickness of the tantalum coating is 0.5-2 mu m.)
技术领域
本发明涉及医学领域，更具体的说是一种人工种植体。
背景技术
近年来，氧化锆种植体由于其优越的美学性能、良好的生物相容性以及稳定的化学性能而越来越多地应用于种植材料领域。但是,由于氧化锆是一种生物惰性材料,其表面没有与活体骨组织产生化学键合的基团，在作为种植体植入到人体内时,材料与人体骨组织之间没有良好的接触,这就会导致一些纤维组织易于长入种植体与骨组织之间的界面，从而破坏骨结合，使种植体松动,最终导致种植失败。
因此,如何促进氧化锆种植体早期骨结合成为一个至关重要的问题。目前，有许多表面改性的方法，如喷砂酸蚀、激光处理以及包覆涂层等，然而，这些方法都存在一些缺点，如氧化锆基体表面污染，涂层易于分离以及骨结合效果不理想。
有研究表明，钽及其氧化物因其优越的生物相容性、抗腐蚀性以及骨诱导能力而广泛应用于生物材料中，在种植体表面制备纳米结构的涂层可显著提高该种植体的骨结合能力，但对氧化锆陶瓷而言，由于氧化锆表面化学性质十分稳定，以往制备的涂层与基底的结合力较差，在植入过程中易脱落。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种人工种植体，该种植体的基体选为氧化锆，利用磁控溅射结合阳极氧化技术，在氧化锆表面上形成具有一定厚度且与氧化锆基体结合力良好的钽纳米结构涂层，增加种植体表面的粗糙度和亲水性，促进氧化锆种植体早期骨结合。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种人工种植体，包括基体和涂层，所述基体为氧化锆陶瓷，所述涂层为表面形成纳米孔结构的钽涂层。
作为本发明的进一步改进，所述钽涂层的纳米孔径在15～50nm。
作为本发明的进一步改进，所述钽涂层的厚度在0.5～2μm。
一种人工种植体的制备方法，包括如下制备步骤：
步骤a：将钇稳定氧化锆陶瓷在1000～2000℃下烧结1～5h，得到氧化锆结晶体；
步骤b：洗涤氧化锆结晶体，干燥；
步骤c：将钽靶材安装在磁控溅射设备的溅射靶上，利用磁控溅射技术在氧化锆表面溅射钽涂层，磁控溅射参数为：溅射功率：20～100w；溅射速率：0.8～1.2nm/s；基准气压：1×10-4～5×10-4Pa工作气压：0.4Pa～0.6Pa；溅射时间：0.5～3h：温度：25～30℃；
步骤d：利用电化学阳极氧化技术，将沉积钽涂层的氧化锆作为阳极，铂片作为阴极，将阴极、阳极同时浸泡在酸性电解液中，在恒压下电解2～8min，在钽涂层表面进一步形成钽纳米孔结构，电解电压为12～18v；
步骤e：洗涤钽纳米孔涂层表面的污物。
作为本发明的进一步改进，在步骤d中，所述酸性电解液选为浓硫酸和氢氟酸的混合液，该混合液由90～98wt％的浓硫酸溶液与5～40wt％的氢氟酸按体积比(90～99)：(1～10)混合得到。
作为本发明的进一步改进，所述氢氟酸的浓度为5～10wt％。
作为本发明的进一步改进，在步骤d中，所述酸性电解液的温度控制在0℃，所述电解时间为5min。
作为本发明的进一步改进，在步骤c中，所述溅射功率选为100～150w，所述溅射时间选为2～3h。
作为本发明的进一步改进，在步骤b中，所述洗涤方法为将氧化锆结晶体依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10～20min，再干燥。
作为本发明的进一步改进，在步骤e中，所述洗涤方法为将沉积钽纳米孔涂层的氧化锆依次在乙醇、去离子水中超声清洗10～20min，再干燥。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用磁控溅射结合阳极氧化技术，在氧化锆表面上形成具有一定厚度且与氧化锆基体结合力良好的钽纳米结构涂层，与采用电子束蒸镀结合阳极氧化的方法相比，本发明所制备的涂层与氧化锆基底结合力较好，不易脱离，且无污染，能量利用率高；
(2)本发明通过磁控溅射技术制备的厚度合适的钽涂层，钽涂层不会太厚，导致结合力不佳而容易脱落，也避免太薄在后续阳极氧化电解步骤中，难以形成纳米结构，或是氧化锆基体表面易受污染，故厚度控制在0.5～2μm的范围内。
(3)本发明所制备的钽纳米孔涂层能增加氧化锆种植体表面粗糙和亲水性，且纳米孔的孔径在15～50nm，而蛋白的尺寸通常在10nm左右，将有利于细胞粘附和铺展，从而促进成骨细胞的骨诱导活性，提高种植体的骨结合率。
附图说明
图1为实施例二中所制备的涂层的表面形貌的SEM图；
图2为实施例二中所制备的涂层的横截面的SEM图；
图3为实施例二、对比例一、对比例二所制备的涂层的粗糙度；
图4为实施例二、对比例一、对比例二所制备的涂层的接触角；
图5-A、图5-B、图5-C为实施例二、对比例一、对比例二所制备的涂层的表面细胞的粘附；
图6-A、图6-B、图6-C为实施例二、对比例一、对比例二所制备的涂层的表面细胞的增值。
具体实施方式
实施例一
一种人工种植体，包括如下制备步骤：
步骤a：用数控机床将3％钇稳定氧化锆陶瓷(99.6％，UPCERA)切成片状(直径10mm，厚度1.5mm)，在1400℃下烧结1h，得到氧化锆结晶体；
步骤b：将氧化锆结晶体依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，再干燥；
步骤c：将99.9％钽靶材安装在磁控溅射设备的溅射靶上(VTC-600-2HD)，利用磁控溅射技术在氧化锆上溅射钽涂层，磁控溅射参数为：溅射功率：20w；溅射速率：0.8nm/s；基准气压：1×10-4Pa；工作气压：0.4Pa；溅射时间：1.5h：温度：25℃；
步骤d：利用电化学阳极氧化技术，将沉积钽涂层的氧化锆作为阳极，铂片作为阴极，将阴极、阳极同时浸泡在浓硫酸和氢氟酸的混合液中，该混合液温度控制在0℃，在恒压下电解2min，在钽涂层表面进一步形成钽纳米孔结构，电解电压为12v；
步骤e：将沉积钽纳米孔涂层的氧化锆依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，除去其表面的污物，再干燥。
实施例二
一种人工种植体，包括如下制备步骤：
步骤a：用数控机床将3％钇稳定氧化锆陶瓷(99.6％，UPCERA)切成片状(直径10mm，厚度1.5mm)，在1500℃下烧结2h，得到氧化锆结晶体；
步骤b：将氧化锆结晶体依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，再干燥；
步骤c：将99.9％钽靶材安装在磁控溅射设备的溅射靶上(VTC-600-2HD)，利用磁控溅射技术在氧化锆上溅射钽涂层，磁控溅射参数为：溅射功率：100w；溅射速率：1nm/s；基准气压：5×10-4Pa；工作气压：0.5Pa；溅射时间：2h：温度：27℃；
步骤d：利用电化学阳极氧化技术，将沉积钽涂层的氧化锆作为阳极，铂片作为阴极，将阴极、阳极同时浸泡在浓硫酸和氢氟酸的混合液中，该混合液温度控制在0℃，在恒压下电解5min，在钽涂层表面进一步形成钽纳米孔结构，电解电压为15v；
步骤e：将沉积钽纳米孔涂层的氧化锆依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，除去其表面的污物，再干燥。
实施例三
一种人工种植体，包括如下制备步骤：
步骤a：用数控机床将3％钇稳定氧化锆陶瓷(99.6％，UPCERA)切成片状(直径10mm，厚度1.5mm)，在1600℃下烧结3h，得到氧化锆结晶体；
步骤b：将氧化锆结晶体依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，再干燥；
步骤c：将99.9％钽靶材安装在磁控溅射设备的溅射靶上(VTC-600-2HD)，利用磁控溅射技术在氧化锆上溅射钽涂层，磁控溅射参数为：溅射功率：100w；溅射速率：1nm/s；基准气压：5×10-4Pa；工作气压：0.6Pa；溅射时间：3h：温度：30℃；
步骤d：利用电化学阳极氧化技术，将沉积钽涂层的氧化锆作为阳极，铂片作为阴极，将阴极、阳极同时浸泡在浓硫酸和氢氟酸的混合液中，该混合液温度控制在0℃，在恒压下电解8min，在钽涂层表面进一步形成钽纳米孔结构，电解电压为18v；
步骤e：将沉积钽纳米孔涂层的氧化锆依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，除去其表面的污物，再干燥。
对比例一
一种人工种植体，包括如下制备步骤：
步骤a：用数控机床将钇稳定3％氧化锆陶瓷(99.6％，UPCERA)切成片状(直径10mm，厚度1.5mm)，在1500℃下烧结2h，得到氧化锆结晶体；
步骤b：将氧化锆结晶体依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，再干燥；
步骤c：将99.9％钽靶材安装在磁控溅射设备的溅射靶上(VTC-600-2HD)，利用磁控溅射技术在氧化锆上溅射钽涂层，磁控溅射参数为：溅射功率：100w；溅射速率：1nm/s；基准气压：5×10-4Pa；工作气压：0.5Pa；溅射时间：2h：温度：27℃。
对比例二
一种人工种植体，包括如下制备步骤：
步骤a：用数控机床将3％钇稳定氧化锆陶瓷(99.6％，UPCERA)切成片状(直径10mm，厚度1.5mm)，在1500℃下烧结2h，得到氧化锆结晶体；
步骤b：将氧化锆结晶体依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，再干燥。
对比例三
一种人工种植体，包括如下制备步骤：
步骤一：用数控机床将钇稳定氧化锆陶瓷(99.6％，UPCERA)切成片状(直径10mm，厚度1.5mm)；
步骤二：喷料选择孔径为50μm的Al2O3颗粒，使用喷砂机在517kPa压力下对钇稳定氧化锆陶瓷进行喷砂处理，喷砂时间为10秒；
步骤三：喷砂结束后，依次在乙醇和去离子水中超声波清洗10min；
步骤四：利用电子术蒸发技术在清洗后的氧化锆上制备钽涂层，压强保持在5×10-7Torr，钛的蒸发电流维持在47ma，电压为10v；
步骤五；利用电化学阳极氧化技术，将沉积有钛涂层的氧化锆作为阳极，石墨作为阴极，将阴极、阳极同时浸泡在浓硫酸和氢氟酸的混合液中，在恒压下电解5min，在钽涂层表面进一步形成钽纳米孔结构，电解电压为15v，电解时间为10min；
步骤六：将沉积钽纳米孔涂层的氧化锆依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，除去其表面的污物，再干燥。
对比例四
一种人工种植体，包括如下制备步骤：
步骤a：用数控机床将3％钇稳定氧化锆陶瓷(99.6％，UPCERA)切成片状(直径10mm，厚度1.5mm)，在1500℃下烧结2h，得到氧化锆结晶体；
步骤b：将氧化锆结晶体依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，再干燥；
步骤c：将99.9％钽靶材安装在磁控溅射设备的溅射靶上(VTC-600-2HD)，利用磁控溅射技术在氧化锆上溅射钽涂层，磁控溅射参数为：溅射功率：100w；溅射速率：1nm/s；基准气压：5×10-4Pa；工作气压：0.5Pa；溅射时间：2h：温度：27℃；
步骤d：利用电化学阳极氧化技术，将沉积钽涂层的氧化锆作为阳极，铂片作为阴极，将阴极、阳极同时浸泡在浓硫酸和氢氟酸的混合液中，该混合液温度控制在20℃，在恒压下电解5min，在钽涂层表面进一步形成钽纳米孔结构，电解电压为15v；
步骤e：将沉积钽纳米孔涂层的氧化锆依次在丙酮、乙醇以及去离子水中超声清洗10min，除去其表面的污物，再干燥。
表面形貌检测
使用场发射扫描电子显微镜观察样品的表面形貌(FESEM,Nova NanoSEM200,FEICo.USA)。
图1为实施例二所制备的钽纳米孔涂层，其厚度为1μm，实施例一所制备的钽纳米孔涂层的厚度在0.5μm，实施例三所制备的钽纳米孔涂层的厚度在2μm。
通过磁控溅射得到的钽涂层，钽涂层不会太厚，导致结合力不佳而容易脱落，也避免太薄在后续阳极氧化电解步骤中，难以形成纳米结构，或是氧化锆基体表面易受污染，故厚度控制在0.5～2μm的范围内。
图2为实施例二所制备的钽纳米孔涂层的横截面，其纳米孔直径为30mm，长度为1μm。本实施例二所制备的钽纳米孔直径约30nm，而蛋白的尺寸通常在10nm左右，将有利于细胞粘附和铺展。
化学组成检测
X射线光电子能谱分别测定实施例二、对比例一、对比例二所制备的ZrO2/TaNS、ZrO2/Ta、ZrO2人工种植体的化学成分(XPS,K-alpha,Thermo)，如下表所示：
表中显示ZrO2主要由Zr3d,C1s和O1s三种元素组成，ZrO2/Ta和ZrO2/TaNS主要由Ta4f(Ta4f7/2和Ta4f5/2),C1s和O1s组成，ZrO2/Ta中O1s和Ta4f的比例为2.6，而在ZrO2/TaNS中的比例提高到4.9，表明阳极氧化后涂层表面氧的比例明显提高，这有利于细胞的生长和粘附。
粗糙度检测
采用原子力显微镜(AFM)分别获得实施例二、对比例一、对比例二所制备的ZrO2/TaNS、ZrO2/Ta、ZrO2人工种植体的三维形貌图像和平均粗糙度。
如图3所示，与ZrO2和ZrO2/Ta相比，ZrO2/TaNS涂层测得的粗糙度(Ra＝151±14.5nm)显著提高。
亲水性检测
采用接触角检测实施例二、对比例一、对比例二所制备的ZrO2/TaNS、ZrO2/Ta、ZrO2人工种植体表面的亲水性。
如图4所示，接触角检测显示ZrO2/TaNS的接触角(16.6±2.65°)显著低于ZrO2/Ta(44.6±2.12°)和/ZrO2(67.9±3.22°)，ZrO2/TaNS的亲水性提高。
涂层结合力检测
使用纳米划痕设备检测实施例一至三和对比例一至二所制得的涂层，采用声发射测量检测结合力，当涂层被钻头划伤或剥落时，会发出微弱的声音信号。此时，可以得到涂层的临界载荷(Lc)。
钻头型号：Rockwell；钻头曲率半径：200μm；加载速度：30N/min；终止加载载荷：40N。
实施例一至三中为采用磁控溅射结合阳极氧化技术制备钽纳米孔的涂层，磁控溅射具有设备简单、沉积速率快、易于控制、对涂层和基片损伤小、镀膜面积大强等优点，在采用磁控溅射溅射钽涂层的过程中，随着溅射功率和时间的增加，溅射离子粒子的能量增加，使得涂层生长的可用能量和密度增加，从而能提高涂层的结合力，在采用阳极氧化技术的制备钽纳米孔涂层的过程中，使用低浓度氢氟酸来可以降低氢氟酸的腐蚀性对涂层的影响，除此之外，低温可以避免体积膨胀，释放内应力以防止形变，使钽纳米孔阵列涂层与氧化锆基体之间的结合较强，
实施例一至三采用磁控溅射结合阳极氧化技术制备钽纳米孔的涂层，并通过对溅射功率、溅射时间、电解温度、电解时间、电解液浓度等参数不同所致的理化、生物学性能对比分析，确定了在氧化锆上制备钽纳米孔涂层的最佳参数，在该参数条件下可制备一定厚度和结合强度的钽纳米孔涂层，且在磁控溅射钽涂层的步骤中，如对比例一所示，此时与基层的结合力较强，可避免在后续电解时，由于结合能力弱，钽涂层脱离而难以得到钽纳米孔涂层。
对比例三为采用电子束蒸镀结合阳极氧化的方法在氧化锆表面制备钽纳米管结构的涂层，对比例三在制备的过程中，由于大多数的化合物薄膜在被高能电子轰击时会发生分解，导致薄膜的结合力较弱，故对比例三所制得的产品在作为种植体在植入的过程中，涂层易脱落，此外，该制备方法还具有如下缺陷：1、由于蒸镀过程中需要持续水冷，对能量的利用率不高；2、由于高能电子可能带来的二次电子可能使残余的气体分子电离，也有可能带来污染。
故实施例一至三与对比例三相比，所制得的钽纳米孔涂层与氧化锆结合力较强，可避免涂层在种植过程中的剥脱的现象发生。
细胞粘附、形态和增值的检测
在实施例二、对比例一、对比例二所制备的ZrO2/TaNS、ZrO2/Ta、ZrO2人工种植体上培养MC3T3-E1细胞，用荧光光显微镜来观察分别培养6h、24h、48h后的细胞形态。具体为用3.7％甲醛固定MC3T3-E1细胞，再用分别用荧光素异硫氰酸酯(FITC,Aladdin)标记的phalloidin和4'，6'-二氨基-2-苯基吲哚对胞质和细胞核进行染色，然后用荧光光显微镜观察染色细胞，同时利用Image J软件计算原始贴壁细胞的数目和扩散面积。MC3T3-E1的增殖检测采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化铵，培养1、3、5天后测定吸光度。样本在每个时间点,用PBS洗两次并转移到新的含300μl培养液和60μl MTT液的24孔板中。然后，样本孵化4h直至形成甲瓒并添加500μl二甲亚砜来溶解甲瓒晶体。使用荧光光谱仪在490nm波长下检测吸光度。
如图5-A所示，在ZrO2表面上MC3T3-E1细胞呈圆形或卵圆形，丝状伪足较少，呈块状聚集，而导致表面细胞数量较多，细胞丝状伪足较多，细胞间连接较多。在ZrO2/TaNS表面ZrO2/Ta观察到MC3T3-E1细胞具有成熟的丝状伪足和长伪足，这说明TaNS涂层可以促进MC3T3-E1细胞的粘附和铺展。而已具有成熟丝状伪足的铺展良好的细胞会引发细胞骨架重组和细胞核构象改变。此外，在整个过程中(6h、24h和48h)，如图5-B所示，ZrO2、ZrO2/Ta、ZrO2/TaNS的初始细胞数量均有所增加，但ZrO2/Ta表面的细胞明显多于其他两组。
同样，从图5-C可以看出，ZrO2/Ta和ZrO2/TaNS的细胞扩展面积明显大于ZrO2(ZrO2/TaNS>ZrO2/Ta>ZrO2)。这可能是由于TaNS涂层的表面积较大以及纳米多孔结构可以诱导MC3T3-E1细胞产生较强的细胞骨架张力，促进从而细胞的铺展和粘附。
如图6-A显示，与ZrO2相比，ZrO2/Ta和ZrO2/TaNS表面MC3T3-E1细胞增殖能力在1、3、5天显著增加，而细胞在ZrO2/Ta和ZrO2/TaNS表面的细胞增殖能力无明显差异。结果表明，TaNS涂层和Ta涂层促进MC3T3-E1细胞增殖，
如图6-B显示，与ZrO2和ZrO2相比，在7天和14天的细胞培养后ZrO2/TaNS的ALP活性明显升高(ZrO2/TaNS>ZrO2/Ta>ZrO2)。结果表明，TaNS涂层和Ta涂层可通过提高ALP活性促进MC3T3-E1细胞的早期成骨分化。矿化作用在细胞培养14和21天后逐渐增强，被认为是晚期成骨分化的标志。
如图6-C可以看出，在14天和21天之后，ZrO2/TaNS的矿化量明显高于其他两组(ZrO2/TaNS>ZrO2/Ta>ZrO2)，这说明TaNS涂层可以诱导细胞更多的矿化。
综上，本发明的有益效果为：
(1)本发明利用磁控溅射结合阳极氧化技术，在氧化锆表面上形成具有一定厚度且与氧化锆基体结合力良好的钽纳米结构涂层，与采用电子束蒸镀结合阳极氧化的方法相比，本发明所制备的涂层与氧化锆基底结合力较好，不易脱离，且无污染，能量利用率高；
(2)本发明通过磁控溅射技术制备的厚度合适的钽涂层，钽涂层不会太厚，导致结合力不佳而容易脱落，也避免太薄在后续阳极氧化电解步骤中，难以形成纳米结构，或是氧化锆基体表面易受污染，故厚度控制在0.5～2μm的范围内。
(3)本发明所制备的钽纳米孔涂层能增加氧化锆种植体表面粗糙和亲水性，且纳米孔的孔径在15～50nm，而蛋白的尺寸通常在10nm左右，将有利于细胞粘附和铺展，从而促进成骨细胞的骨诱导活性，提高种植体的骨结合率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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